ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЛЕНОК НА ОСНОВЕ ФИБРОИНА И ДЕКСТРАНА

АННОТАЦИЯ

Данное исследование направлено на разработку механически стабильных композиционных биоматериалов для медицинских применений. С этой целью были получены композиции на основе фиброина шелка и полиальдегидного декстрана (ПАД).

Фиброин шелка был предварительно очищен в щелочной среде, а полиальдегидный декстран синтезирован методом периодатного окисления декстрана с образованием альдегидных групп. Предполагается, что взаимодействие между аминогруппами фиброина (-NH₂) и альдегидными группами ПАД (-СНО) приводит к образованию шиффовых оснований (-С=N-), что влияет на структурные и реологические свойства системы.

Реологические исследования показали снижение вязкости композиции по сравнению с исходным раствором фиброина, что может быть связано с изменением межмолекулярных взаимодействий и перераспределением β - sheet структур.

С использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭM) установлено, что в пленочных образцах сохраняется морфология, характерная для фиброина, при этом наблюдаются изменения микроструктуры, обусловленные введением ПАД.

ABSTRACT

This study is aimed at the development of mechanically stable composite biomaterials for medical applications. For this purpose, biomaterials based on silk fibroin and polyaldehyde dextran (PAD) were prepared. The silk fibroin used in this study was purified under alkaline conditions, while PAD was synthesized via periodate oxidation of dextran. The rheological properties of the resulting fibroin/PAD compositions were investigated, revealing a decrease in viscosity compared to that of pure fibroin. Furthermore, scanning electron microscopy (SEM) analysis of the obtained biopolymer film samples confirmed that the native structure of fibroin was preserved within the composite matrix. This study is aimed at the development of mechanically stable composite biomaterials for medical applications. For this purpose, composites based on silk fibroin and polyaldehyde dextran (PAD) were prepared. The silk fibroin used in this work was предварительно purified in an alkaline medium, while polyaldehyde dextran was synthesized via periodate oxidation of dextran, resulting in the formation of aldehyde groups.

It is assumed that the interaction between the amino groups of fibroin (–NH₂) and the aldehyde groups of PAD (–CHO) leads to the formation of Schiff bases (–C=N–), which affects the structural and rheological properties of the system.    

Rheological studies showed a decrease in the viscosity of the composite compared to the initial fibroin solution, which may be associated with changes in intermolecular interactions and redistribution of β-sheet structures.

Scanning electron microscopy (SEM) analysis demonstrated that the morphology characteristic of fibroin is preserved in the film samples, while changes in the microstructure are observed due to the incorporation of PAD.

Ключевые слова: фиброин шелка, полиальдегидный декстран, реология, СЭМ, биополимер, композиция

Keywords: silk fibroin, polyaldehyde dextran, rheology, SEM, biopolymer, composite

Введение. Шёлки представляют собой волокнистые белки, продуцируемые различными организмами, включая шелкопрядов и пауков. Для биомедицинского применения шелк шелкопряда предварительно подвергается процессу «дегуммирования» (удаления серицина) с целью устранения иммуногенного серицинового покрытия [1]. После этого материал, как правило, перерабатывается с получением раствора фиброина, который может быть сформирован в различные структуры, такие как плёнки [2], волокна [3] и пористые структуры [4].

Кроме того, фиброин может использоваться в комбинации с другими биоматериалами, такими как желатин и гидроксиапатит [5].

С точки зрения структуры, фиброин шелка состоит из повторяющихся аминокислотных последовательностей [6], в которых преобладают аланин, глицин и серин. Белок фиброина включает четыре основных структурных компонента:

-эластичные β – спирали;

-кристаллические β – слои, обогащённые аланином;

-α–спирали, образованные плотными повторяющимися аминокислотными последовательностями;

-промежуточные области.

Раствор фиброина не обладает устойчивой вторичной структурой, и его структурное состояние в значительной степени определяется методами обработки. Для управления структурой регенерированного фиброина разработаны различные подходы, среди которых широко применяется обработка органическими растворителями.

Во многих исследованиях показано, что обработка регенерированного фиброина метанолом приводит к формированию кристаллической β – структуры [7]. Однако при этом α-спиральные структуры полностью не исчезают [8]. Степень перехода к β – структуре зависит от времени воздействия растворителя и его концентрации. Эти изменения приводят к следующим эффектам:

-агрегации молекул фиброина;

-изменению термических характеристик разложения;

-снижению способности фиброина поглощать влагу из окружающей среды.

Мембраны фиброина, обработанные метанолом, обладают высокой проницаемостью для кислорода и водяного пара [9], а также повышенной механической прочностью [10]. Переход к β – структуре также повышает устойчивость фиброина к биодеградации [11].

Фиброин, сохраняющий нативную структуру, хорошо растворяется в органических кислотах, однако не полностью растворим в воде. В связи с этим его водные системы обладают низкой текучестью, что затрудняет получение плёнок. Для улучшения плёнообразующих свойств фиброина необходимо его пластицирование с использованием совместимых биополимеров или химических пластификаторов. Пластификаторы должны хорошо растворяться в воде и способствовать формированию плёнок.

Получение плёнок из композиций на основе фиброина и полисахаридов связано с изучением их физико – химических свойств, включая термическую и биологическую стабильность, эластичность, а также оптимизацию технологических параметров процесса.

Сохранение нативной структуры фиброина при одновременном придании текучести его водной системе позволяет получать высококачественные мягкие лекарственные формы.

Глицерин является одним из наиболее широко применяемых пластификаторов при получении плёнок [12]. Однако плёнки, полученные с добавлением глицерина, со временем теряют эластичность, становятся хрупкими и ломкими. Это связано с тем, что в процессе сушки глицерин мигрирует к поверхности плёнки, нарушая её однородность и ухудшая эксплуатационные свойства.

В качестве пластификаторов также используются полисахариды. Фиброин состоит из чередующихся кристаллических и аморфных доменов, где β – слои формируют жёсткую структуру, а аморфные области обеспечивают гибкость [13]. Однако фиброин характеризуется ограниченной механической прочностью и высокой чувствительностью к водной среде, проявляющейся в значительном набухании. Для повышения стабильности и регулирования скорости деградации применяются различные методы модификации.

Среди химических модификаторов особое значение имеют соединения, содержащие альдегидные группы. В данной работе показано, что модифицированный декстран (полиальдегидный декстран) является эффективным пластификатором для получения плёнок на основе фиброина. При взаимодействии полиальдегидного декстрана с фиброином происходит образование связей между альдегидными группами декстрана и ε – аминогруппами остатков лизина в молекулах фиброина, что приводит к формированию растворимых композиций с образованием иминных связей (C=N) [14].

Цель работы: Изучение реологических свойств композиций, полученных на основе фиброина и полиальдегид декстран (ПАД), а также исследование структуры полученных на их основе плёнок с использованием микроскопических методов.

Материалы и методы.

Получение раствора фиброина шелка. В исследованиях использовали фиброин, выделенный из коконов Bombyx mori. Для этого коконы кипятили в течение 30 минут в 0,02 М растворе Na₂CO₃. Данная процедура позволила удалить серицин - белок, скрепляющий фиброиновые волокна. С целью удаления остаточных щелочных соединений образцы многократно промывали дистиллированной водой.

Для получения водного раствора фиброина волокна растворяли в реагенте Аджизава [CaCl₂: C₂H₅OH: H₂O], при этом CaCl₂ (реактив, Россия) и C₂H₅OH (реактив, Россия) использовали в мольном соотношении 1:2:8. Полученную смесь выдерживали на водяной бане при 75°C в течение 2 часов до полного растворения шелка.

Для удаления хлорида кальция раствор подвергали диализу против воды. Замена воды проводилась 5 раз в течение суток. После диализа полученные растворы фиброина центрифугировали. Конечный продукт выделяли методом лиофильной сушки [15].

Получение ПAД. Для получения ПАД проводили периодатное окисление декстрана. С этой целью 0,02 моль декстрана помещали в тёмную стеклянную ёмкость объёмом 200 мл, после чего добавляли 200 мл ацетатного буферного раствора с pH 4,25 и раствор 0,2 н NaIO₄. При этом мольное соотношение декстрана к IO₄^- составляло 1:1,5. Реакцию проводили при температуре 25^°C в течение 6 часов. Затем реакционную смесь диализовали в течение 24 часов для удаления низкомолекулярных побочных продуктов и ионов периодата. Полученный продукт выделяли методом лиофильной сушки [16].

Формование пленок. Для получения плёнок на основе фиброина и ПАД использовали водные растворы шёлкового фиброина, полученного вышеописанным методом, а также водные растворы ПАД и глицерин. Для формирования плёнок растворы заливали в чашки Петри диаметром 35 мм. Плёнки толщиной 50 мкм формировали путём нанесения 3 мл раствора с общей концентрацией 30 мг/мл на поверхность чашки Петри. Затем плёнки сушили при комнатной температуре в течение трёх суток.

Определение динамической вязкости. Реологические свойства образцов определяли на реометре Thermo Fisher Scientific HAAKE 2 Plus. Измерения проводили при температуре 25°C в режиме контролируемой скорости сдвига в диапазоне 0,1-100 с^-1. Образцы помещали в измерительную систему прибора и после термостатирования регистрировали значения динамической вязкости. На основании полученных результатов строили график зависимости вязкости от скорости сдвига.

СЭМ анализ. Морфология поверхности плёнок исследовалась методом сканирующей электронной микроскопии на микроскопе ZEISS EVO MA 10. Для анализа образцы разрезали на фрагменты размером 5×5 мм, высушивали при комнатной температуре и фиксировали на алюминиевом держателе с помощью двусторонней углеродной ленты. Для снижения электрического заряда и повышения качества изображения поверхность образцов покрывали тонким слоем золота в вакуумных условиях. СЭМ-изображения получали при ускоряющем напряжении 5-20 кВ при различных увеличениях, после чего анализировали ровность поверхности, степень пористости, наличие трещин и однородность структуры.

Результаты и их обсуждение.

Изучение вязко-текучих свойств растворов фиброина способствует упрощению технологических процессов получения плёнок. Вязко-текучие свойства фиброина и полученных на его основе биополимерных композиций представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Вязко-текучие свойства: 1-фиброин, 2-композиция

Результаты показывают, что между значениями динамической вязкости фиброина, декстрана и композиции ПАД существуют различия: вязкость раствора фиброина выше, чем вязкость композиции.

Высокая вязко – текучесть фиброина обусловлена наличием межмолекулярных водородных связей между его макромолекулами. Как видно из рисунка 1, при добавлении ПАД к фиброину наблюдается снижение вязкости системы. Это объясняется тем, что активные функциональные группы молекул ПАД взаимодействуют с макромолекулами фиброина, образуя новые связи и тем самым уменьшая его вязкость.

Однако с увеличением содержания ПАД в фиброин-полисахаридной композиции происходит резкое снижение вязкости, что в свою очередь затрудняет получение качественных и эластичных плёнок на основе данной композиции.

В результате исследований структура фиброиновых волокон была изучена с помощью СЭM (рис. 2).

Рисунок 2. СЭМ-изображения поверхности плёнок: а) фиброин, б) композиция

Как видно из изображений поверхности фиброиновой плёнки (рис. 2), волокна фиброина имеют различный размер, расположены параллельно друг другу и характеризуются уплотнённой структурой поверхности. Также наблюдается уменьшение размеров пор и снижение общей пористости.

При сравнении изображений видно, что на рисунке-2, а) - фибриллы расположены на близком расстоянии друг от друга, тогда как на рисунке-2 б) в структуре композиции расстояние между фибриллами увеличивается, при этом их длина практически не изменяется. Это свидетельствует о том, что под воздействием полисахаридов молекулы с относительно меньшей молекулярной массой проникают между фибриллами фиброина, в результате чего расстояние между ними значительно увеличивается.

Заключение. В результате исследований были изучены изменения вязко-текучих свойств фиброина и биополимерных композиций на основе фиброина-ПАД. Микроскопические изображения фиброина, выделенного из кокона шелкопряда, подтвердили его фибриллярную структуру. На изображениях композиции установлено, что фиброин сохраняет свою природную структуру. Полученные результаты показывают, что фиброин может служить основой для получения различных форм, применяемых в медицине и фармацевтике, таких как плёнки, порошки, губки, гели и мази.

Список литературы:

1. PerezRigueiro J., Elices M., Llorca J., Viney C. Effect of degumming on the tensile properties of silkworm (Bombyx mori) silk fiber // Journal of Applied Polymer Science. 2002. 84(7). P. 1431-1437.
2. Sofia S., McCarthy M.B., Gronowicz G., Kaplan D.L. Functionalized silkbased biomaterials for bone formation // Journal of Biomedical Materials Research. 2001.54(1). P. 139-148.
3. Chen C., Chuanbao C., Xilan M., Yin T., Hesun Z. Preparation of nonwoven mats from allaqueous silk fibroin solution with electrospinning method //  Polymer 2006. 47(18). P. 6322-6327.
4. Slotta U., Tammer M., Kremer F., Koelsch P., Scheibel T. Structural analysis of spider silk films // Supramolecular Chemistry. 2006. 18(5).  P. 465-471.
5. Tanaka T., Hirose M., Kotobuki N., Ohgushi H., Furuzono T., Sato J. Nanoscaled hydroxyapatite/silk fibroin sheets support osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal cells // Materials Science and Engineering: C. 2007. 27(4). P. 817-823.
6. Kim S.H., Nam Y.S., Lee T.S., Park W.H. Silk fibroin nanofiber. Electrospinning, properties, and structure // Polymer Journal 2003. 35(2). Р. 185-190.
7. Servoli E., Maniglio D., Motta A., Predazzer R., Migliaresi C. Surface properties of silk fibroin films and their interaction with fibroblasts // Macromolecular Bioscience. 2005. 5(12). Р. 1175-1183.
8. Minoura N., Tsukada M., Nagura M. Fine structure and oxygen permeability of silk fibroin membrane treated with methanol // Polymer 1990. 31(2). Р. 265-269.
9. Petrini P., Parolari C., Tanzi M.C. Silk fibroinpolyurethane scaffolds for tissue engineering // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2001. 12(1012). Р. 849-853.
10. Муйдинов Н.Т, Раджабов О.И., Халилова Г.А., Гулямов Т., Атажанов А.Ю., Тураев А.С. Биополимерная композиция для лекарственных пленок // Фармацевтический журнал. 2018. №3. С. 69-72.
11. Kundu B., Rajkhowa R., Kundu S.C., Wang X. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations // Advanced Drug Delivery Reviews. 2013. Vol. 65, № 4. P. 457-470.
12. Hermanson G. T. Bioconjugate Techniques. – 3rd ed. – Amsterdam: Academic Press, 2013. – 1146 p. – ISBN 978-0-12-382239-0.
13. Ajisawa A. Studies on the dissolution of silk fibroin III. The dissolution of silk fibroin by CaCl₂– ₂O–R–OH ternary system solution // The Journal of Sericultural Science of Japan. – 1969. – V. 38. – №. 4. – P. 340-346.
14. Zhang Y., Ding C., Li Y., Hu X., Sun L. Oxidized polysaccharides as versatile crosslinking agents for biomedical hydrogels // Journal of Materials Chemistry B. – 2019. – Vol. 7. – P. 2199–2215. – DOI: 10.1039/C8TB03159F.
15. F.Karimi, N.Farbehi, F.Ziaee, K.Lau, M.Monfared, M.Kordanovski, H.Joukhdar, T. G.Molly, R.Nordon, K. A.Kilian, M. H.Stenzel, K. S.Lim, J.Rnjak-Kovacina, Photocrosslinked Silk Fibroin Microgel Scaffolds for Biomedical Applications. Adv. Funct. Mater.2024, 34, 2313354. https://doi.org/10.1002/adfm.202313354
16. Ma H, Xie B, Chen H, Song P, Zhou Y, Jia H, Liu J, Zhao Y and Zhang Y (2024) High-strength and high-elasticity silk fibroin-composite gelatin biomaterial hydrogels for rabbit knee cartilage regeneration. Front. Mater. 11:1390372. doi: 10.3389/
17. Schneider KH, Goldberg BJ, Hasturk O, Mu X, Dötzlhofer M, Eder G, Theodossiou S, Pichelkastner L, Riess P, Rohringer S, Kiss H, Teuschl-Woller AH, Fitzpatrick V, Enayati M, Podesser BK, Bergmeister H, Kaplan DL. Silk fibroin, gelatin, and human placenta extracellular matrix-based composite hydrogels for 3D bioprinting and soft tissue engineering. Biomater Res. 2023 Nov 17;27(1):117. doi: 10.1186/s40824-023-00431-5. PMID: 37978399; PMCID: PMC10656895.
18. Zhu S, Zhang Q, Xu X, Liu Z, Cheng G, Long D, Cheng L, Dai F. Recent Advances in Silk Fibroin-Based Composites for Bone Repair Applications: A Review. Polymers (Basel). 2025 Mar 14;17(6):772. doi: 10.3390/polym17060772. PMID: 40292628; PMCID: PMC11945653.
19. Plichta T, Mrazova K, Richterova V, Khyrova M, Lukes J, Sepitka J. Multiscale analysis of mechanical and structural properties of agarose-silk fibroin hydrogels. Int J Biol Macromol. 2025 Nov;330(Pt 3):148133. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2025.148133. Epub 2025 Oct 9. PMID: 41067342  
20. Chomchalao P, Saelim N, Lamlertthon S, Sisopa P, Tiyaboonchai W. Mucoadhesive Hybrid System of Silk Fibroin Nanoparticles and Thermosensitive In Situ Hydrogel for Amphotericin B Delivery: A Potential Option for Fungal Keratitis Treatment. Polymers (Basel). 2024 Jan 3;16(1):148. doi: 10.3390/polym16010148. PMID: 38201813; PMCID: PMC10780372.
21. Oral CB, Yetiskin B, Cil C, Kok FN, Okay O. Silk Fibroin-Based Shape-Memory Organohydrogels with Semicrystalline Microinclusions. ACS Appl Bio Mater. 2023 Apr 17;6(4):1594-1603. doi: 10.1021/acsabm.3c00017. Epub 2023 Mar 15. PMID: 36922721; PMCID: PMC10114111.