АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИМЕТАЛЛОКОМПЛЕКСА ХИТОЗАН-СЕРЕБРО СИНТЕЗИРОВАННОГО ИЗ ХИТИНА Apis mellifera

АННОТАЦИЯ

Данное исследование посвящено синтезу и всесторонней оценке антибактериальной активности комплекса хитозан-серебро (хз-Ag⁺), полученного из биомассы погибших пчел Apis mellifera. Основное внимание в работе уделено изучению синергетического противомикробного эффекта, возникающего при включении ионов серебра в структуру природной хитозановой матрицы. Физико-химическая характеристика подтвердила успешное формирование комплекса, после чего его биологическая активность была протестирована методом диффузии в агар (диско-диффузионный метод). Результаты показали, что комплекс Хз-Ag⁺ проявляет значительное ингибирующее действие в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов, включая Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella и Listeria monocytogenes. Повышенная антибактериальная эффективность объясняется двойным механизмом действия: разрушением клеточных мембран хитозаном и окислительным стрессом, индуцированным ионами серебра внутри бактериальных клеток. Полученные данные подтверждают высокую биосовместимость и эффективность синтезированного комплекса, подчеркивая его потенциал в качестве мощного антибактериального агента широкого спектра действия для биомедицинских и антисептических целей.

ABSTRACT

This study explores the synthesis and comprehensive antibacterial evaluation of a chitosan-silver (xz-Ag) complex derived from the biomass of dead Apis mellifera (honeybees). The research focuses on the synergistic antimicrobial effects produced by the incorporation of silver ions into the natural chitosan matrix. Physicochemical characterization confirmed the successful formation of the complex, which was subsequently tested for biological activity using the disc diffusion method. The results demonstrated that the xz-Ag complex exhibits significant inhibitory effects against a broad spectrum of pathogenic microorganisms, including Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella, and Listeria monocytogenes. The enhanced antibacterial potency is attributed to the dual action of chitosan's membrane-disrupting properties and the oxidative stress induced by silver ions within the bacterial cells. These findings confirm the high biocompatibility and superior efficacy of the synthesized complex, highlighting its potential as a potent, broad-spectrum antibacterial agent for advanced biomedical and antiseptic applications.

Ключевые слова: хитозан Apis mellifera, наночастицы серебра,  антимикробные свойства, физико-химические свойства, бактерицидный эффект.

Keywords: Chitosan, Silver nanoparticles, Apis Mellifera, Antimicrobial properties, Physicochemical properties, Bactericidal effect.

1. Введение

В последние годы разработка эффективных и экологически безопасных методов синтеза металлических наночастиц привлекает значительное внимание в различных областях нанотехнологии. Среди металлических наночастиц особый интерес представляют наночастицы серебра (НЧAg) благодаря их выраженной противомикробной активности и широкому спектру применения в биомедицине, фармацевтике и смежных областях.

В этом контексте нанокомпозиты на основе серебра и хитозана (ХЗ– НЧAg) рассматриваются как перспективный класс био-наноструктурированных гибридных материалов, сочетающих биосовместимость, биоразлагаемость и функциональную активность [1]. Биополимер хитозан и его производные играют важную роль в формировании стабильных комплексов с ионами серебра, выступая как матрица и стабилизирующий агент для наночастиц. В настоящее время комплексы хитозана с ионами серебра активно исследуются научным сообществом во всем мире. Установлено, что как хитозан, так и серебро, а также их производные обладают выраженными бактерицидными свойствами [2–3, 7].

Учитывая данные свойства, хитозан–серебряные системы рассматриваются также как потенциальные противовирусные и антибактериальные агенты. Ряд исследований показывает, что антимикробная активность комплексов ионов серебра с хитозаном значительно превышает активность индивидуального хитозана, что связано с синергетическим эффектом между полимерной матрицей и наночастицами серебра [8–12].

Пленки на основе хитозана и его соединений, содержащих ионы серебра или наночастицы серебра, проявляют более выраженные фунгицидные свойства, чем композиты. Реакция протекает по следующему механизму. (Рис.1). Влияние молекулярной массы на бактерицидные свойства хитозана и его производных неодинаково. Это связано с различной степенью полимеризации молекулы полимера, которая проявляет максимальные антибактериальные свойства при различных значениях pH среды. Например, в кислой среде высокомолекулярный хитозан обладает относительно лучшими бактерицидными свойствами, так как в среде с pH выше 6,0–6,5 его аминогруппы теряют свой заряд и полимер выпадает в осадок [14-15].

Рисунок 1. Механизм взаимодействия хитозана с ионами серебра и структура комплекса хитозан-серебро

.

Нанокомпозиты на основе хитозана и серебра привлекают значительное внимание как перспективные функциональные материалы с выраженной антимикробной активностью и высокой биосовместимостью. Установлено, что хитозан, обладая катионной природой, способен взаимодействовать с клеточными стенками микроорганизмов, нарушая их проницаемость, а также индуцировать системную устойчивость растений к фитопатогенам. В то же время ионы серебра характеризуются широким спектром антимикробного действия, включая бактерицидную, фунгицидную и противовирусную активность, реализуемую за счёт взаимодействия с белками, ДНК и клеточными мембранами микроорганизмов. Синергетическое сочетание хитозана и серебра в составе нанокомпозитов обеспечивает стабилизацию наночастиц серебра, контролируемое высвобождение ионов Ag⁺ и усиление биоцидного эффекта при минимальной цитотоксичности в отношении клеток млекопитающих. Полученные наночастицы серебра, стабилизированные хитозаном, демонстрируют высокую эффективность в подавлении роста широкого спектра патогенных микроорганизмов, что определяет их значительный потенциал для применения в медицине, сельском хозяйстве и биотехнологии.

Целью данной работы является синтез и комплексное изучение структурных, морфологических и антибактериальных свойств комплексов хитозан–серебро, полученных из хитина медоносной пчелы Apis mellifera, с использованием современных физико-химических методов анализа, включая ИК-спектроскопию, рентгеноструктурный анализ (РСА) и сканирующую электронную микроскопию (СЭМ), а также оценку антимикробной активности методом диффузии в агаре. Научная новизна заключается в использовании подмора пчёл Apis mellifera в качестве альтернативного биологического сырья, а также в применении криогенного метода деацетилирования, позволяющего достичь более высокой степени деацетилирования (87%) по сравнению с традиционным методом (83%). Повышенная степень деацетилирования способствует увеличению плотности реакционноспособных аминогрупп в структуре хитозана, что, в свою очередь, усиливает координационное взаимодействие с ионами серебра (Ag⁺) и приводит к формированию более стабильных и биологически активных нанокомплексов с улучшенными антимикробными характеристиками.

2. Материалы и методы

Наночастицы ХЗ–Ag⁺ получили методом химического восстановления ионов серебра в присутствии хитозана и стабилизатора.

Синтез: 0,5%-ный раствор хитозана смешивали с 0,005 М раствором нитрата серебра (AgNO₃) при контролируемом добавлении (объём добавляемого раствора — 0,5 мкл). После образования координационного комплекса между ионами Ag⁺ и функциональными (аминными и гидроксильными) группами хитозана. Восстановление ионов серебра с использованием боргидрида натрия (NaBH₄),  приводит к формированию стабилизированных наночастиц серебра, равномерно распределённых в полимерной матрице. В ходе эксперимента 10 мл реакционной смеси при интенсивном перемешивание на магнитной мешалке со скоростью 800 об/мин для перехода в  гомогенную систему и предотвращением агрегации наночастиц. Полученный продукт фильтровали и разливали в чашки Петри для формирования тонкоплёночных образцов. Плёнки ХЗ–Ag высушивали при комнатной температуре (23 °C) в течение 4 суток до достижения постоянной массы, после чего проводили комплексное исследование их физико-химических и структурных характеристик.

Структурные характеристики образцов нанокомпозитов ХЗ/Ag⁺ исследовали методом ИК-Фурье-спектроскопии, Морфология поверхности образцов исследовалась методом сканирующей электронной микроскопии с использованием микроскопа EVO MA 10 (Carl Zeiss, Германия). В качестве объектов анализа использовали частицы высушенного хитозана (ХЗ) и нанокомпозита хитозан–серебро (ХЗ–Ag). Рентгеноструктурный анализ (РСА) нанокомпозитов ХЗ/Ag проводили на дифрактометре ДРОН-3М с использованием монохроматического CuKα-излучения при силе тока 16 мА и ускоряющем напряжении 22 кВ. В качестве объектов исследования применялись порошкообразные образцы, что обеспечивало получение репрезентативных дифракционных данных.

Анализ ИК-спектра хитозана показали характерные полосы поглощения при 3439 см⁻¹ и 2885 см⁻¹, соответствующие амидным колебаниям (Амид A и Амид B). Полоса Амид A обусловлена валентными колебаниями связей O–H и N–H, тогда как полоса Амид B связана преимущественно с валентными колебаниями алифатических связей C–H. Кроме того, в областях 1655 см⁻¹, 1558 см⁻¹ и 1383 см⁻¹ фиксируются полосы, соответствующие валентным колебаниям карбонильной группы C=O (Амид I), деформационным колебаниям N–H (Амид II) и колебаниям Амид III соответственно, что подтверждает характерную структуру частично деацетилированного полисахарида.

3. Результаты и обсуждение

ИК-спектр комплекса хитозан-серебро  демонстрирует ряд существенных изменений по сравнению со спектром исходного хитозана (рис. 2), что свидетельствует о координационном взаимодействии ионов Ag⁺ с функциональными группами полимера. В частности, наблюдаются смещение и изменение интенсивности полос, соответствующих аминным и гидроксильным группам, что указывает на их участие в комплексообразовании. Уменьшение интенсивности полос, связанных с N–H и C=O группами, а также их незначительное смещение в низкочастотную область подтверждают образование координационных связей между ионами серебра и донорными атомами азота и кислорода в структуре хитозана, что приводит к модификации его электронной структуры и усилению функциональных свойств нанокомпозита (рис.2)

Рисунк 2. ИК-спектры А) хитозана и Б) комплекса хитозан-серебро

ИК-спектроскопический анализ подтвердил наличие координационного взаимодействия между функциональными группами хитозана и наночастицами серебра. Наблюдаемые сдвиги и изменения интенсивности полос в области ~3400 см⁻¹, соответствующей валентным колебаниям –OH и –NH₂ групп, а также в области ~1590 см⁻¹, связанной с деформационными колебаниями –NH₂, указывают на участие аминогрупп в координации ионов Ag⁺. Дополнительные изменения в диапазоне 1000–1100 см⁻¹ свидетельствуют о вовлечении гидроксильных групп в процесс стабилизации наночастиц серебра, что подтверждает формирование устойчивого нанокомпозита хитозан–серебро, стабилизированного за счёт функциональных групп –NH₂ и –OH.

Рентгенограммы пленок хитозана (ХЗ) и его металлокомплекса ХЗ/Ag⁺ свидетельствуют о существенном влиянии наночастиц серебра на надмолекулярную организацию полимерной матрицы. На дифрактограмме хитозана  Apis mellifera (рис. 3), наблюдаются два характерных дифракционных максимума при 2θ ≈ 10° и 2θ ≈ 20°, типичных для частично кристаллической структуры хитозана. При этом интенсивный пик при 2θ ≈ 20° соответствует более упорядоченным областям полимера, тогда как слабый максимум при 2θ ≈ 10° отражает наличие менее упорядоченных (аморфно-кристаллических) доменов [16].

Рисунок 3. Рентгенограммы пленок хитозана (Xz/) и комплекса Xz/Ag⁺, синтезированных из подмора медоносных пчел Apis mellifera.

Дополнительно на дифрактограммах комплекса ХЗ/Ag фиксируются новые отражения в областях 2θ = 28,5°, 35° и 38° [17], которые могут быть отнесены к кристаллическим фазам, связанным с присутствием наночастиц серебра и их взаимодействием с полимерной матрицей.

СЭМ-анализ показал, что поверхность хитозан–серебряного комплекса характеризуется сложной, неоднородной и выраженно пористой морфологией. На микрофотографиях (масштаб 10 мкм) отчетливо наблюдаются светлые кластеры частиц неправильной формы, неравномерно распределенные в темной матрице хитозана. Наиболее вероятно, что данные области соответствуют агломератам наночастиц серебра или зонам локального обогащения ионами Ag⁺, встроенными в полимерную структуру.

Рисунок 4. Изображения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)

А) хитозана и Б)Хитозан -серебро

Формирование такой шероховатой и пористой поверхности приводит к увеличению удельной площади материала, что способствует более эффективному взаимодействию с бактериальными клетками и, как следствие, усилению антимикробной активности исследуемого нанокомпозита (рис. 4). Для оценки бактерицидных свойств хитозан–серебряного комплекса бактериальные посевы инкубировали в термостате при 37 °C в течение 24 часов для обеспечения оптимального роста микроорганизмов. Антибактериальная активность металлокомплексов хитозана оценивалась в отношении пяти патогенных штаммов: Salmonella, S. aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli и Enterococcus faecalis (рис. 5). 

Рисунок 5.Влияние хитозана Apis mellifera и его комплексов с ионами Ag⁺ и Cu²⁺ на бактериальные штаммы

Для проведения испытаний из хитозан–серебряной пленки вырезали образцы размером 10 мм, которые наносили на поверхность засеянных бактериальных культур в чашках Петри. Область ингибирования роста бактерий (зона подавления) составляла 5–6 мм в радиусе, что свидетельствует о выраженной антибактериальной активности материала. Механизм действия обусловлен способностью ионов серебра проникать через бактериальную клеточную мембрану, нарушая ее структурную целостность. Кроме того, Ag⁺ ионы ингибируют ключевые ферментативные системы, участвующие в транспорте электролитов и энергетическом метаболизме клетки, что приводит к остановке процессов репликации и последующей гибели микроорганизмов [18-20].Результаты показали, что металлокомплексы хитозана обладают значительно более выраженными зонами ингибирования по сравнению с чистым хитозаном. При этом комплекс хитозан–серебро (ХЗ–Ag) демонстрировал стабильную антимикробную активность против всех исследованных штаммов, тогда как комплекс хитозан–медь (ХЗ–Cu) показал наибольшую активность в отношении E. coli и E. faecalis, что свидетельствует о различии механизмов и спектра действия металлокомплексов.

Выводы

Исследования показали, что хитозан обладает собственной умеренной антибактериальной активностью; при этом радиус зоны ингибирования роста микроорганизмов для исходного полимера не превышает 3 мм, что указывает на его ограниченную эффективность в индивидуальном применении. В то же время модификация хитозана наночастицами серебра приводит к выраженному синергетическому эффекту, существенно усиливающему антимикробные свойства материала.

Полученные результаты однозначно подтверждают, что пленки на основе комплекс хитозан-серебро обладают значительно более высокой антибактериальной активностью и эффективно подавляют рост клинически значимых микроорганизмов, включая Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Комплекс хитозан-серебро указывает на высокий потенциал разработанного материала для применения в качестве функционального биополимерного покрытия в медицинской практике, особенно в условиях растущей антибиотикорезистентности.

Таким образом, cовокупность полученных характеристик указывает на перспективность применения разработанного нанокомпозита в направление для создания биомедицинских покрытий, направленных на профилактику и лечение инфекций, включая обусловленные антибиотикорезистентными микроорганизмами.

Список литературы:

1. Badawy M.E.I., Lotfy T.M.R., Shawir S.M.S. Preparation and antibacterial activity of chitosan-silver nanoparticles for application in preservation of minced meat // Bulletin of the National Research Centre. – 2019. – Vol. 43. – Art. 83.
2. Govindan S., Nivethaa E.A.K., Saravanan R., Narayanan V., Stephen A. Synthesis and characterization of chitosan–silver nanocomposite // Applied Nanoscience. – 2012. – Vol. 2. – P. 299–303.
3. Lok C.N., Ho C.M., Chen R., He Q.Y., Yu W.Y., Sun H., Tam P.K.H., Chiu J.F., Che C.M. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities // Journal of Biological Inorganic Chemistry. – 2007. – Vol. 12. – P. 527–534.
4. Fu J., Ji J., Fan D., Shen J. Construction of antibacterial multilayer films containing nanosilver via layer-by-layer assembly of heparin and chitosan-silver ions complex // Journal of Biomedical Materials Research. Part A. – 2006. – Vol. 79A. – P. 665–674.  
5. Elieh D., Komi A., Hamblin M., Anitha A. Chitin and chitosan in selected biomedical applications // Progress in Polymer Science. – 2014. – Vol. 39, № 9. – P. 1644–1667. – С. 120–124.
6. Azuma K. et al. Chitin, chitosan, and its derivatives for wound healing: old and new materials // Journal of Functional Biomaterials. – 2015. – Vol. 6, № 1. – P. 104–142.
7. Shahverdi A.R., Fakhimi A., Shahverdi H.R., Minaian S. Synthesis and effect of silver nanoparticles on antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli // Nanomedicine. – 2007. – Vol. 3, № 2. – P. 168–171.
8. Sattarova D.M. Preparation of carboxymethyl chitosan nanofibers by electrospinning method // International Journal of Materials Science. – 2019. – Vol. 9, № 2. – P. 29–33.
9. Mourya V.K., Inamdar N.N. Chitosan-modifications and applications: opportunities galore // Reactive and Functional Polymers. – 2008. – Vol. 68. – P. 1013–1051.
10. Jian D., You-Lo H. Nanofibrous membranes from aqueous electrospinning of carboxymethyl chitosan // Nanotechnology. – 2008. – Vol. 19. – P. 1–9.
11. Egamberdiev E., Ergashev Y., Khaydullayev K., Husanov D., Rahmonberdiev G. Obtaining paper samples using basalt fibers and studying the effect of natural glue obtained from chitosan on paper quality // Universum: Technical Sciences. – 2022. – № 4. – P. 14–18.
12. Ikhtiyarova G.A., Turabdjanov S.M., Mengliyev A.S., Usmanova G.A., Axmadjonov A.N., Haydarova Ch.Q. Physicochemical properties of chitin and chitosan from died honey bees Apis mellifera of Uzbekistan // Journal of Critical Reviews. – 2020. – Vol. 7, № 4. – P. 120–124.
13. Ikhtiyarova G.A., Hazratova D.A., Umarov B.N., Seytnazarova O.M. Extraction of chitosan from died honey bee Apis mellifera // Chemical Technology Control and Management. – 2020. – № 2. – P. 15–20.
14. Andersson M., Lofroth J.E. Small particles of a heparin/chitosan complex prepared from a pharmaceutically acceptable microemulsion // International Journal of Pharmaceutics. – 2003. – Vol. 257. – P. 305–309.
15. Vokhidova N.R., Rashidova S.Sh. The influence of synthesis conditions on the film morphology of chitosan-stabilized silver nanoparticles // Polymer Bulletin. – 2022. – Vol. 79. – P. 3419–3436.
16. Hamzavi S.F., Jamili S., Yousefzadi M., Moradi A.M., Biuki N.A. Silver nanoparticles supported on chitosan as a green heterogeneous catalyst for synthesis of nitrogen heterocycles // Bulletin of Chemical Reaction Engineering and Catalysis. – 2019. – Vol. 14, № 1. – P. 51–59.
17. Asli A., Brouillett E., Ster C., Ghinet M.G., Bjezinski R., Lacasse P., Jacques M., Malouin F. Antibiofilm and antibacterial effects of bacteriophage formulation against Staphylococcus aureus in vitro // PLoS ONE. – 2017. – Vol. 12, № 5. – Art. e0176988.
18. Ikhtiyarova G.A., Mamatova Sh.B., Temirov F.F., Xolturayeva N.R. Синтез комплекса хитозан–серебро из пчелиного подмора и изучение его физико-химических свойств // Научный вестник НГУ. – 2022. – № 3. – P. 67–73.
19. Ikhtiyarova G.A., Isomitdinova D.S., Saidov J.E. Chitosan from dead bees Apis mellifera and its complex with silver ions for antibacterial biofilms // Proceedings of the X International Conference “Industrial Technologies and Engineering” (ICITE-2023). – 2023. – P. 18.
20. Cheung R.C.F., Ng T.B., Wong J.H., Chan W.Y. Chitosan: an update on biomedical applications // Marine Drugs. – 2015. – Vol. 13, № 8. – P. 5156–5186.