ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Salvia deserta МЕТОДОМ ВЭЖХ

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты определения фенольных соединений в экстрактах Salvia deserta с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Исследуемые метаболиты включали метилированные агликоны (эупатилин, акацетин, лютеолин) и флавонол-гликозиды (рутин, изокверцитрин, кверцетин). Спиртовой экстракт надземной части растения подвергали последовательному фракционированию на силикагеле с использованием хлороформа и этилацетата. Для количественного анализа соединений применен воспроизводимый метод ВЭЖХ с использованием колонки Shim-pack GIST C18 (4.6×250 мм) в изократическом режиме. Установлено, что хлороформная фракция характеризуется преобладанием эупатилина и метилированных эфиров акацетина, а этилацетатная — высоким содержанием изокверцитрина и рутина.

ABSTRACT

The article presents the results of determining phenolic compounds in Salvia deserta extracts using high-performance liquid chromatography (HPLC). The studied metabolites included methylated aglycones (eupatilin, acacetin, luteolin, quercetin) and flavonol glycosides (rutin, isoquercitrin). An ethanol extract of the plant’s aerial parts was subjected to sequential fractionation on silica gel using chloroform and ethyl acetate. For quantitative analysis of the compounds, a reproducible HPLC method was applied using a Shim-pack GIST C18 column (4.6 × 250 mm) in isocratic mode. It was found that the chloroform fraction is characterized by a predominance of eupatilin and methylated esters of acacetin, while the ethyl acetate fraction is characterized by a high content of isoquercitrin and rutin.

Ключевые слова: Salviadeserta, высоко эффективная жидкостная хроматография, флавоноиды, агликоны, гликозилированные флавоноиды, эупатилин, изокверцитрин, рутин.

Keywords: Salvia deserta, high performance liquid chromatography, flavonoids, aglycones, glycosylated flavonoids, eupatilin, isoquercitrin, rutin.

Введение

Растительное разнообразие Узбекистана выступает приоритетным объектом для углубленного изучения в области фитохимии и фармакогнозии. Флора региона включает значительное число видов с потенциальной биологической активностью, а многовековой опыт их применения в традиционной медицине подтверждает их значимость как доступных источников природных соединений с доказанным фармакологическим действием [1]. В последние годы наблюдается устойчивый рост интереса к исследованию таких соединений, что обусловлено их широким спектром активности и относительной безопасностью по сравнению с синтетическими аналогами. Особое внимание исследователей сосредоточено на фенольных соединениях (флавоноидах, фенолкарбоновых кислотах), обладающих выраженными антиоксидантными, противовоспалительными и антимикробными свойствами [2].

Особый научный интерес вызывает род Salvia (семейство Lamiaceae), насчитывающий около 1000 видов. Представители этого рода характеризуются богатым химическим составом, включающим не только фенолы, но и терпеноиды, а также эфирные масла, что обуславливает их антидиабетическое и нейропротекторное действие [3].

Современные сравнительные исследования (например, на видах S. plebeia, S. sclarea, S. fruticosa и S. aethiopis) показывают, что химический профиль шалфеев существенно варьирует в зависимости от видовой принадлежности и экологических факторов [4]. В то время как европейские виды (S. officinalis) подробно изучены, Salvia deserta (шалфей пустынный), произрастающая в специфических аридных условиях Центральной Азии, до недавнего времени оставалась фрагментарно исследованным объектом [5]. Критический анализ литературы указывает на то, что большинство работ по данному виду посвящено изучению дитерпеноидов корней, тогда как флавоноидный состав надземной части локальных популяций практически не систематизирован.

Экологические стресс-факторы Узбекистана — высокая инсоляция и дефицит влаги — способствуют синтезу уникального набора вторичных метаболитов. Хемотаксономическое разнообразие видов Salvia напрямую коррелирует с их адаптационными механизмами: накопление гидроксилированных и метилированных форм флавоноидов обеспечивает защиту растений от радикальных процессов, вызванных УФ-излучением [6], [7]. Именно изучение распределения этих соединений по фракциям различной полярности позволяет выявить наиболее активные компоненты для дальнейшего практического применения.

Для анализа сложных многокомпонентных систем, какими являются растительные экстракты, решающее значение имеют современные аналитические подходы. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), обладающая высокой селективностью, прецизионностью и воспроизводимостью, позволяет эффективно идентифицировать индивидуальные компоненты в экстрактах. Использование ВЭЖХ в сочетании с предварительным фракционированием по полярности дает возможность получить детализированную картину распределения биологически активных соединений [8], [9], [10].

Целью настоящего исследования является идентификация и сравнительный количественный анализ фенольного профиля хлороформной и этилацетатной фракций экстракта надземной части Salvia deserta флоры Узбекистана методом ВЭЖХ для оценки их фармацевтического потенциала.

Научная новизна данной работы заключается в том, что: впервые проведено комплексное исследование распределения вторичных метаболитов в различных по полярности фракциях S. deserta, произрастающего в Узбекистане. Выявлено специфическое распределение таких компонентов, как эупатилин и изокверцитрин. В отличие от аналогичных популяций из Ирана, где часто доминируют розмариновая кислота и кверцетин [11], узбекистанская популяция демонстрирует уникальное преобладание метилированных агликонов и гликозилированных флавоноидов. Предполагается, что выявленные особенности компонентного состава могут быть связаны с потенциальной антиоксидантной и антимикробной активностью, что согласуется с литературными данными о биологической активности метилированных флавоноидов и их гликозилированных форм.

Материалы и методы

Объектом исследования служила надземная часть растения Salvia deserta, собранная в Янгикурганском районе Наманганской области в период цветения (22 июля 2024 года). Видовая принадлежность растения была подтверждена специалистами Центрального гербария Узбекистана путём сопоставления с аутентичными фондовыми образцами.

Исходное растительное сырьё массой 812 г высушивали при комнатной температуре, после чего измельчали до размера частиц 0.5–1.0 мм. Экстракцию биологически активных веществ проводили 70%-ным этиловым спиртом методом мацерации с пятикратным повторением; продолжительность каждого этапа настаивания составляла 4–6 часов. Полученные извлечения объединяли и концентрировали под вакуумом на роторном испарителе до получения густого экстракта массой 333 г.

Для последующего разделения полученный экстракт смешивали с силикагелем в соотношении 1:1 (по массе) и наносили на хроматографическую колонку. Фракционирование проводили последовательно: экстракционным бензином (для удаления липидов и летучих веществ), хлороформом с десятикратным повторением элюирования. После упаривания растворителя под вакуумом получили хлороформную фракцию массой 32.05 г. Из этой фракции была отобрана проба №2 (массой 10.21 г) для последующего анализа.

Оставшуюся после хлороформного фракционирования массу освобождали от следов растворителя и подвергали дальнейшему разделению этилацетатом с шестикратным повторением. В результате упаривания была получена этилацетатная фракция массой 10.95 г, из которой для исследований выделили пробу №5 (массой 0.82 г).

Точную навеску 10 мг РСО образца помещали в мерную колбу объемом 10 мл. Растворяли в 3 мл ацетонитрила до получения истинного раствора, затем доводили до половины метки тем же растворителем и перемешивали. Из данного первичного стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл путем разведения готовили остальные рабочие стандартные растворы, необходимые для калибровки.

Для анализа использовали хлороформную и этилацетатную фракции. Точную навеску 10 мг полученного образца №2 растворяли в 3 мл ацетонитрила до полного растворения. Далее полученный раствор количественно переносили в мерную колбу объемом 10 мл, доводили до метки 96%-м этанолом и тщательно перемешивали. Пробный раствор этилацетатной фракции №5 готовили аналогично методике для хлороформной фракции. Полученные растворы фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0.22 мкм в специализированные флаконы (виалы) для анализа.

Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили в условиях, полностью идентичных анализу стандартных растворов. Идентификацию пиков на хроматограммах осуществляли на основании совпадения времен удерживания целевых соединений и соответствующих стандартных образцов, полученных в идентичных условиях, что позволило детально охарактеризовать и сопоставить профили вторичных метаболитов в исследуемых фракциях.

Высокоэффективный жидкостный хроматографический анализ проводился на хроматографе Shimadzu LC-20AD (Япония), оснащенном четырехканальным градиентным насосом, дегазатором, петлевым инжектором и УФ-детектором      SPD-20A в следующих условиях: колонка Shim-pack GIST C18 (4.6 × 250 мм, размер частиц 5 мкм), оснащенная предколонкой Shim-pack GIST C18 (20 × 4 мм, размер частиц 5 мкм); элюирование проводилось в изократическом режиме с использованием двух подвижных фаз (ПФ): ПФ-А: 60% 0,05%-й водный раствор ортофосфорной кислоты и ПФ-В: 40% ацетонитрил; длина волны детектирования УФ 215-266 нм, скорость потока подвижной фазы 0.9 мл/мин; время анализа составляло 10 мин; температура колонки поддерживалась на уровне 40°С.

Достоверность результатов подтверждали по параметрам линейности (R² ≥ 0.999 в диапазоне 0.01–1.0 мг/мл), чувствительности (LOD/LOQ на основе соотношения сигнал/шум 3:1 и 10:1) и повторяемости. Последнюю оценивали путем трехкратного анализа трех различных концентраций в течение одного дня при постоянном объеме инжекции 20 мкл; значения относительного стандартного отклонения (RSD) составили менее 2%. Обработку хроматографических данных проводили с использованием программного обеспечения LabSolutions (Shimadzu).

Результаты и обсуждение

В ходе проведенного исследования методом ВЭЖХ были получены подробные хроматографические профили хлороформной и этилацетатной фракций. Идентификацию обнаруженных компонентов осуществляли путем сопоставления их времен удерживания (ВУ) с пиками соответствующих рабочих стандартных образцов (РСО), полученных в идентичных условиях анализа.

Хлороформная фракция характеризуется накоплением менее полярных соединений. С точки зрения связи «структура — активность», преобладание здесь метилированных флавоноидов объясняется наличием метокси-групп (–OCH₃), которые повышают липофильность молекул. Наличие метокси-групп обусловливает повышение липофильности соединений, что способствует их селективной экстракции хлороформом и может способствовать проявлению биологической активности, включая антимикробную (рис. 1) [5].

Рисунок 1. ВЭЖХ-хроматограмма хлороформной фракции экстракта Salvia deserta

На полученной хроматограмме (Рис. 1) зафиксировано преобладание группы метилированных агликонов. Наибольший вклад в состав хлороформной фракции вносит эупатилин (2.12%), содержание которого превышает концентрации других компонентов данной группы более чем в 1.5–7 раз. Подробный компонентный состав хлороформной фракции с указанием времен удерживания и процентного содержания веществ представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Состав идентифицированных соединений хлороформной фракции Salvia deserta

* – время удерживания; ** – от воздушно весового сырья.

Сравнительный анализ с литературными данными показывает, что в отличие от популяций S. deserta из других регионов (например, Ирана), где доминируют розмариновая кислота и кверцетин [11], в исследуемом образце флоры Узбекистана превалирует эупатилин и метилированные флавоны. Согласно литературным данным, накопление флавоноидов, включая их метилированные производные, рассматривается как один из ключевых адаптационных механизмов растений к воздействию ультрафиолетового излучения и других абиотических стрессов. Эти соединения выполняют функцию УФ-экранов и антиоксидантов, поглощая UV-B излучение и нейтрализуя активные формы кислорода, тем самым защищая клеточные структуры от фотоокислительного повреждения [12],[13].

При переходе к этилацетатной фракции наблюдается смещение профиля в сторону полярных соединений. Связь «структура — активность» здесь проявляется через процесс гликозилирования: наличие сахарных остатков в молекулах (рутин, изокверцитрин) делает их гидрофильными. Это обуславливает их высокую растворимость в полярных средах и стабильность, что может быть важным при разработке препаратов с антиоксидантной направленностью (рис. 2) [14].

Рисунок 2. ВЭЖХ-хроматограмма этилацетатной фракции экстракта Salvia deserta

Как видно из рисунка 2, для данной фракции характерна высокая концентрация гликозилированных форм, которые вносят существенный вклад в антиоксидантный потенциал растения. В этилацетатной фракции доминирует изокверцитрин (2.49%), содержание которого превышает уровень рутина (1.94%) и существенно превосходит концентрацию свободного кверцетина (1.48%).

Таблица 2.

Состав идентифицированных соединений этилацетатной фракции Salvia deserta

* – время удерживания; ** – от воздушно весового сырья.

Высокое содержание изокверцитрина и рутина согласуется с данными, полученными для других представителей рода Salvia, где данные соединения рассматриваются как ключевые компоненты, формирующие антиоксидантную активность экстрактов. Известно, что рутин и изокверцитрин обладают выраженными радикал-поглощающими свойствами и вносят существенный вклад в суммарную антиоксидантную активность растительного сырья. При этом их преобладание в сочетании с относительно низким содержанием свободного кверцетина может быть связано с более высокой стабильностью и растворимостью гликозилированных форм, что способствует реализации антиоксидантного потенциала в комплексных системах [15].

Выявленные различия в распределении агликонов и гликозидов между фракциями отражают не только их различную полярность, но и особенности биосинтетических путей флавоноидов в растении. Метилирование и гликозилирование являются ключевыми модификациями, регулирующими растворимость, стабильность и биодоступность соединений. В условиях аридного климата такие преобразования могут играть важную роль в адаптации растений, обеспечивая оптимальный баланс между защитными и метаболическими функциями вторичных метаболитов.

Для подтверждения достоверности полученных результатов была проведена валидация метода по основным маркерам (эупатилин и изокверцитрин).

Таблица 3.

Валидационные характеристики определения основных маркеров

Результаты валидации подтверждают, что разработанный метод ВЭЖХ характеризуется высокой точностью и воспроизводимостью и может быть использован для надежного количественного определения фенольных соединений в исследуемых образцах.

Таким образом, комплексное исследование показало, что надземная часть Salvia deserta является богатым источником как липофильных (антимикробных), так и гидрофильных (антиоксидантных) фенольных соединений. Выявленные закономерности распределения соединений в зависимости от их структуры и полярности растворителя имеют важное значение для целенаправленного выделения биологически активных веществ и могут быть использованы при разработке фармацевтических и гигиенических препаратов.

Заключение

В результате проведенного фитохимического исследования надземной части Salvia deserta (шалфей пустынный), произрастающего в Узбекистане, впервые детально охарактеризован компонентный состав хлороформной и этилацетатной фракций с применением метода ВЭЖХ.

Разработанная эффективная схема фракционирования позволила выявить специфическое распределение вторичных метаболитов: использование хлороформа обеспечивает извлечение преимущественно метилированных агликонов, тогда как этилацетат способствует концентрированию флавонол-гликозидов.

Установлено, что узбекистанская популяция обладает уникальным хемотаксономическим профилем: в отличие от популяций из других регионов, где часто доминирует розмариновая кислота, здесь превалируют эупатилин и гликозилированные формы флавоноидов. Это подтверждает значительное влияние аридных факторов среды на биосинтез защитных метаболитов.

Выявленные закономерности «структура — активность» (липофильность агликонов против гидрофильности гликозидов) обосновывают синергизм антибактериального и антиоксидантного действия экстрактов. Примененная методика анализа была валидирована по параметрам линейности, чувствительности и повторяемости, что подтверждает достоверность полученных количественных данных.

Таким образом, надземная часть Salvia deserta является перспективным отечественным источником для разработки новых лекарственных и гигиенических препаратов с выраженным терапевтическим потенциалом. Результаты работы могут быть использованы для стандартизации данного сырья и его включения в реестр перспективных фармакопейных растений флоры Узбекистана.

Благодарность

Работа выполнена в рамках прикладного гранта AL-8624042469 «Создание антибактериальных композиций на основе биологически активных экстрактов и эфирных масел растений, перспективных для разработки гигиенических и антимикробных средств».

Список литературы:

1. World Health Organization. WHO traditional medicine strategy: 2014–2023. — Geneva: World Health Organization, 2013. — 76 p.
2. Loizzo M.R., Abouali M., Salehi P., Sonboli A., Kanani M., Menichini F., Tundis R. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of nine Salvia species // Natural Product Research. — 2014. — Т. 28. — Вып. 24. — С. 2278–2285. — doi: 10.1080/14786419.2014.939086.
3. Afzal T., Proćków J., Łyczko J. Bioactive chemical composition and pharmacological insights into Salvia species // Frontiers in Molecular Biosciences. — 2025. — Т. 12. — doi: 10.3389/fmolb.2025.1678109.
4. Dilgen M.N., Aydın B., Vural N., Koç M. Analysis of phytochemical profiles of different extracts of Salvia (S. sclarea, S. huberi, S. fruticosa and S. aethiopis) by HPLC-PDA, evaluation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity // Chemistry & Biodiversity. — 2025. — Т. 22. — Вып. 11. — e03218. — doi: 10.1002/cbdv.202403218.
5. Anagnostou M., Tomou E.-M., Krigas N., Skaltsa H. Phenolic constituents of Greek native Salvia species: a comprehensive review // Phytochemistry Reviews. — 2025. — Т. 24. — Вып. 5. — С. 3443–3522. — doi: 10.1007/s11101-024-10062-w.
6. Ksouri R., Ksouri W.M., Jallali I., Debez A., Magné C., Hiroko I., Abdelly C. Medicinal halophytes: potent source of health promoting biomolecules with medical, nutraceutical and food applications // Critical Reviews in Biotechnology. — 2012. — Т. 32. — Вып. 4. — С. 289–326. —  doi: 10.3109/07388551.2011.630647.
7. Mohiuddin A. Effect of environment on secondary metabolism of medicinal plants // OAJESS. — 2019. — Т. 2. — Вып. 1. — doi: 10.32474/OAJESS.2019.02.000126.
8. Lee T.D. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. — 2011. — Т. 22. — Вып. 1. — С. 196–196. — doi: 10.1007/s13361-010-0021-8.
9. Hazra K., Kumar D., Dutta S., Dighe D., Saha S., Mangal A.K., Singh R., Meena A.K., Babu G. Endurance of phytocompounds in classical preparation from the root of Rauvolfia serpentina: pharmaceutical dosage validation by HPTLC, HPLC–UV, and LC–MS/MS // Journal of Analytical Science and Technology. — 2024. — Т. 15. — С. 57. — doi: 10.1186/s40543-024-00472-y.
10. Fanali S., Chankvetadze B., Haddad P.R., Poole C., Riekkola M.-L. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation. — Amsterdam: Elsevier, 2023. — 960 p.
11. Moshari-Nasirkandi A., Iaccarino N., Romano F., Graziani G., Alirezalu A., Alipour H., Amato J. Chemometrics-based analysis of the phytochemical profile and antioxidant activity of Salvia species from Iran // Scientific Reports. — 2024. — Т. 14. — Ст. 17317.
12. Singh P., Singh A., Choudhary K.K. Revisiting the role of phenylpropanoids in plant defense against UV-B stress // Plant Stress. — 2023. — Т. 7. — Ст. 100143. — doi: 10.1016/j.stress.2023.100143.
13. Mahdavian K. Effects of ultraviolet radiation on plants and their protective mechanisms // Russian Journal of Plant Physiology. — 2024. — Т. 71. — Ст. 184.
14. Paje L.A., Choi J., Lee H.-D., Kim J., Yu A.R., Bae M.-J., Geraldino P.J.L.P., Lee S. Phenolic acids and flavonoids from Salvia plebeia and HPLC-UV profiling of four Salvia species // Heliyon. — 2022. — Т. 8. — Вып. 3. — e09046. — doi: 10.1016/j.heliyon.2022.e09046.
15. Ferreyra M.L.F., Serra P., Casati P. Recent advances on the roles of flavonoids as plant protective molecules after UV and high light exposure // Physiologia Plantarum. — 2021. — Т. 173. — Вып. 3. — С. 736–749. —  doi: 10.1111/ppl.13543.