РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ В СУХОМ ЭКСТРАКТЕ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОМ ВЭЖХ

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты сравнительного исследования качественного и количественного состава флаволигнанов в шроте расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.), произрастающей в Узбекистане. Объектами исследования послужили три типа экстрактов, полученных из вторичного сырья после холодного прессования семян: прямой спиртовый экстракт, водный экстракт (распылительная сушка) и очищенный спиртовый экстракт. Анализ проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Agilent-1200 с использованием обращенно-фазной колонки Eclipse XDB C18 и диодно-матричного детектирования. В ходе работы проведена идентификация и количественное определение силибина и изосилибина относительно рабочих стандартных образцов (РСО). Установлено, что наиболее эффективным методом извлечения целевых компонентов является прямая спиртовая экстракция, обеспечивающая максимальное суммарное содержание флаволигнанов.

ABSTRACT

The article presents the results of a comparative study on the qualitative and quantitative composition of flavolignans in milk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn.) meal originating from Uzbekistan. The objects of the study were three types of extracts obtained from secondary raw materials after cold pressing of seeds: direct alcoholic extract, aqueous extract (spray-dried), and purified alcoholic extract. The analysis was performed using high-performance liquid chromatography (HPLC) on an Agilent-1200 system equipped with an Eclipse XDB C18 reverse-phase column and diode-array detection. In the course of the work, silybin and isosilybin were identified and quantified relative to working standard samples (WSS). It was established that direct alcoholic extraction is the most efficient method for recovering target components, providing the maximum total content of flavolignans.

Ключевые слова: Расторопша пятнистая, шрот, флаволигнаны, силибин, изосилибин, ВЭЖХ, стандартный образец, распылительная сушка, очистка экстрактов.

Keywords: Silybum marianum, milk thistle, meal, flavolignans, silybin, isosilybin, HPLC, reference standard, spray drying, extract purification.

Введение

Современный фармацевтический анализ базируется на внедрении высокотехнологичных физико-химических методов, которые позволяют проводить комплексную и прецизионную оценку качества лекарственного растительного сырья [4, 5]. Ключевую роль в изучении состава и характеристик фитопрепаратов на всех этапах — от технологической разработки до финальной стандартизации — играют высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ИК- и УФ-спектроскопия, а также масс-спектрометрия. [1]. Сочетание данных методов позволяет успешно разделять сложные многокомпонентные смеси и определять качественное и количественное содержание отдельных биологически активных веществ в биологических объектах.

Определение состава лекарственных веществ осуществляется согласно современным требованиям фармакопейных статей методом ВЭЖХ. Перспективность использования данного метода заключается в возможности с высокой степенью точности идентифицировать компоненты в суммарных растительных препаратах и продуктах их переработки [2, 3]. Для проведения анализа требуется минимальное количество пробы, а время определения измеряется минутами, что делает метод ВЭЖХ наиболее эффективным для стандартизации экстрактов из порошкообразных форм (шротов) [6].

При использовании метода ВЭЖХ для анализа соединений в растительных объектах (на примере расторопша пятнистая) удается получить достоверные результаты по содержанию основных групп действующих веществ без необходимости предварительного выделения индивидуальных соединений, что значительно упрощает фармацевтический контроль согласно нормативным документам [7, 8].

Цель работы: разработать методику и изучить качественный и количественный состав шрота (полученного в виде порошка после прессования семян) Silybum marianum (L.) Gaertn. методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Методы и материалы

Объектом исследования послужил шрот семян расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.), заготовленный в Джизакской области (Республика Узбекистан). Сырье было получено в качестве вторичного продукта после извлечения жирного масла методом холодного шнекового прессования.

Для сравнительного анализа качественного и количественного состава на основе полученного шрота было подготовлено три типа опытных образцов:

Образец №1: Спиртовый экстракт шрота.

Образец №2: Водный экстракт, полученный с использованием технологии распылительной сушки.

Образец №3: Водный экстракт, очищенный от полисахаридов методом вакуумной фильтрации, подвергнутый трехкратной промывке бензином для удаления гидрофобных примесей и перегнанный в чистом метаноле.

Подготовка проб для ВЭЖХ-анализа. Для исследования качественного и количественного состава флаволигнанов была разработана методика экстракции из трех образцов шрота (спиртовый, водный после распылительной сушки и очищенный спиртовый).

На аналитических весах отвешивали по 1 г каждого образца и помещали в плоскодонные колбы объемом 300 мл. В качестве экстрагента использовали 50 мл 70% раствора этанола. Экстракцию проводили при температуре 70°C в течение 1 часа при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, оснащенной обратным холодильником. После нагревания смесь перемешивали при комнатной температуре еще 2 часа.

Для полноты извлечения действующих веществ к остатку дважды добавляли по 25 мл 70% этанола и проводили повторную экстракцию. Объединенные фильтраты переносили в мерные колбы объемом 100 мл и доводили до метки экстрагентом. Перед вводом в хроматограф растворы центрифугировали в течение 20 минут со скоростью 8000 об/мин, для анализа отбирали верхнюю часть (супернатант).

Стандартные образцы. В качестве рабочих стандартных образцов (РСО) использовали силибин (Silibin) и изосилибин (Izosilibin) с чистотой не менее 98%. Растворы стандартов готовились в концентрации 1 мг/мл в 70% этаноле и фильтровались через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм.

Условия хроматографирования. Качественный и количественный анализ осуществляли методом ВЭЖХ на системе Agilent 1200, укомплектованной автосамплером и диодно-матричным детектором. Разделение целевых соединений проводили в обращенно-фазном режиме на колонке Eclipse XDB C18 (5 мкм, 4,6 х 250 мм) при температуре 30 °C. Детектирование сигналов велось при длинах волн 290 нм и 340 нм. Ввод пробы объемом 10 мкл выполнялся со скоростью потока элюента 0,8 мл/мин. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора, подаваемую в градиентном режиме:

• 0–5 мин — 95:5;
• 6–12 мин — 70:30;
• 12–13 мин — 50:50;
• 13–15 мин — 95:5.

Перед анализом рабочих растворов в систему вводились растворы рабочих стандартных образцов (РСО) силибина и изосилибина.

Результаты и обсуждение

В ходе проведения исследований качественный состав и количественное содержание флаволигнанов в экстрактах шрота Silybum marianum (L.) Gaertn. определялись методом ВЭЖХ. Идентификация целевых соединений осуществлялась путем сопоставления времен удерживания (R_t) и УФ-спектров пиков на хроматограммах испытуемых растворов с соответствующими характеристиками рабочих стандартных образцов (РСО) силибина и изосилибина.

Рисунок 1.  ВЭЖХ-хроматограмма РСО силибина и изосилибина

На рисунке 1 представлена хроматограмма стандартного раствора, на которой четко фиксируются два основных пика, соответствующих силибину

(R_t ≈  12,5 мин) и изосилибину (R_t ≈  13,2 мин). Чистота и симметричность пиков на данном рисунке подтверждают пригодность выбранной градиентной системы (фосфатный буфер: ацетонитрил) для анализа флаволигнанов.

При анализе исследуемых образцов шрота было установлено, что способ предварительной обработки сырья оказывает решающее влияние на чистоту хроматографической картины и концентрацию действующих веществ.

Для оценки эффективности различных технологических подходов к переработке шрота расторопши пятнистой (Silybum marianum) был проведен сравнительный анализ качественного и количественного состава флаволигнанов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Сравнительный анализ представленных хроматограмм (рис. 2–4) свидетельствует о существенных различиях в компонентном составе в зависимости от способа пробоподготовки:

Рисунок 2. ВЭЖХ-хроматограмма флаволигнанов в спиртовом экстракте шрота (Образец №1)

Рисунок 3. ВЭЖХ-хроматограмма флаволигнанов в водном экстракте после распылительной сушки (Образец №2)

Образец №1 (Спиртовый экстракт). Данный образец продемонстрировал наилучшие результаты по выходу целевых компонентов. Хроматографический профиль характеризуется высокой интенсивностью пиков силибина и изосилибина. Несмотря на наличие незначительных сопутствующих сигналов в области малых времен удерживания, прямая спиртовая экстракция позволяет максимально полно извлечь комплекс флаволигнанов из растительного сырья.

Образец №2 (Водный экстракт, распылительная сушка). Метод водной экстракции с последующей сушкой оказался менее эффективным. Визуальный анализ хроматограммы выявил существенное снижение высоты основных пиков и дрейф базовой линии. Это обусловлено присутствием балластных водорастворимых веществ (полисахаридов), которые затрудняют идентификацию и снижают долю активных соединений в порошке.

Рисунок 4. ВЭЖХ-хроматограмма флаволигнанов в очищенном спиртовом экстракте шрота (Образец №3)

Образец №3 (Очищенный спиртовый экстракт). Применение дополнительных стадий очистки, таких как вакуумная фильтрация и промывка бензином, привело к значительному снижению содержания флаволигнанов по сравнению с исходным экстрактом. Хотя использование данных методов позволяет добиться высокой четкости пиков и устранить гидрофобные примеси, глубокая технологическая обработка сопровождается неоправданными потерями действующих веществ.

Анализ хроматограмм показал, что чистота разделения и интенсивность пиков существенно варьируют в зависимости от способа технологической обработки шрота. Результаты качественного и количественного определения представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты ВЭЖХ-анализа качественного и количественного состава флаволигнанов в исследуемых образцах (мг/г и %)

Обсуждение. Сравнительный анализ данных показал, что наиболее эффективным методом извлечения действующих веществ является прямая спиртовая экстракция (Образец №1). Этот образец продемонстрировал максимальное накопление флаволигнанов, значительно превосходя остальные пробы по интенсивности целевых пиков на хроматограмме.

В то же время, использование водной экстракции с распылительной сушкой (Образец №2) привело к ухудшению качества сигнала и дрейфу базовой линии из-за высокого содержания балластных полисахаридов. Применение же глубокой очистки в Образце №3 (вакуумная фильтрация и промывка бензином), несмотря на получение визуально «чистой» хроматограммы, привело к двукратному падению концентрации силибина и изосилибина по сравнению с первым образцом.

Заключение

В результате проведенного исследования разработана эффективная методика качественного и количественного анализа флаволигнанов в шроте расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.), произрастающей в Узбекистане, с использованием метода ВЭЖХ.

Сравнительный анализ трех способов технологической обработки сырья показал, что предварительная очистка оказывает решающее влияние на выход целевых компонентов. Установлено, что наиболее рациональным методом получения гепатопротекторной субстанции является прямая спиртовая экстракция (Образец №1). Данный способ обеспечивает максимальный выход целевых компонентов — силибина и изосилибина, сохраняя высокую концентрацию биологически активных веществ в конечном продукте.

Сравнительный анализ показал, что использование водной экстракции с распылительной сушкой (Образец №2) ведет к значительному накоплению балластных полисахаридов, затрудняющих анализ. В свою очередь, глубокая очистка экстракта (Образец №3) признана нецелесообразной для промышленного внедрения: несмотря на визуальную чистоту хроматограмм, дополнительные стадии вакуумной фильтрации и промывки бензином приводят к двукратному падению содержания действующих веществ.

Таким образом, для стандартизации и производства высокоэффективных препаратов на основе сырья из Узбекистана рекомендуется использование технологии, примененной для Образца №1, как обеспечивающей наибольший количественный выход флаволигнанов.

Список литературы:

1. Флора Узбекистана. В 6-ти томах. / Под ред. Р. Р. Шредера. — Ташкент: Изд-во АН УзССР, 1962. — Т. 6. — С. 345–347.
2. Куркин В. А. Расторопша пятнистая — источник ценных лекарственных средств // Фармация. — 2003. — № 3. — С. 10–12.
3. Холматов Х. Х., Ахмедов О. А. Лекарственные растения Узбекистана. — Ташкент: Ибн Сино, 1991. — 152 с.
4. Маев И. В., Дичева Д. Т. Гепатопротекторы в терапии заболеваний печени // Клиническая медицина. — 2011. — Т. 89, № 6. — С. 36–42.
5. Алексеева М. А., Эллер К. И. Определение полифенольных соединений с помощью ВЭЖХ // Химико-фармацевтический журнал. — 2004. — Т. 38, № 12. — С. 48–50.
6. Матазимов М. Т., Олимов Н. К. Разработка методики исследования качественного и количественного состава флавоноидов в сухом экстракте «Флегмен» с помощью метода ВЭЖХ // Фармацевтический журнал (Узбекистан). — 2019. — № 2. — С. 42–47.
7. Гаппаров А. М., Сагдуллаев Ш. Ш. Изучение химического состава семян расторопши пятнистой, произрастающей в Кашкадарьинской области // Доклады Академии наук Республики Узбекистан. — 2019. — № 4. — С. 58–62.
8. Рамазанов Н. С. Химия природных соединений: липиды, терпеноиды, флавоноиды. — Ташкент: Фан, 2015. — 240 с.
9. Тухтаев Б. Е. Интродукция лекарственных растений на засоленных землях Узбекистана. — Ташкент: Фан, 2009. — 158 с.
10. AbouZid S., Ahmed S. Silybum marianum (L.) Gaertn.: A review of its traditional uses, chemistry and pharmacology // Journal of Pharmacy and Pharmacology. — 2013. — Vol. 65, № 11. — P. 1577–1595.
11. Polyak S. J., Ferenci C., Pawlotsky J. M. Identification of hepatoprotective flavonolignans from silymarin // PNAS. — 2013. — Vol. 110, № 14. — P. 5582–5587.
12. Korpelainen H., Pietiläinen J. Genetic diversity of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae) // Journal of Medicinal Plants Research. — 2012. — Vol. 6, № 11. — P. 2110–2117.