ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСНОГО СОЕДИНЕНИЯ ЖЕЛЕЗА (II) С ГИДРОЛИЗАТОМ КЕРАТИНА

АННОТАЦИЯ

Кератин, содержащийся в овечьей шерсти, является ценным биополимером, который может быть использован в биомедицине, косметике и сельском хозяйстве. В данной статье рассматривается метод щелочного гидролиза как эффективный способ извлечения кератиновых белков из шерсти. Описаны основные этапы процесса, влияние условий (концентрация щелочи, температура, время) на выход и свойства кератина, сложные соединения были получены путем реакции с ионами металлов. Щелочной гидролиз природного сырья проводился при нескольких процентных 0,3-6% концентрациях щелочи, и были определены условия гидролиза 90-120^оС и течение 6-12 ч. показывают, что щелочной гидролиз обеспечивает высокий выход кератина, хотя может влиять на его структурные характеристики.

Аминокислотный состав выделенного экстракта изучался на основе хроматограммы ВЭЖХ, и было установлено, что он состоит из 20 аминокислот. В зависимости от их количества наблюдалась следующая последовательность, мг: серин 128, 3307 > пролин 102,2582 > глицин 79,2932 > валин 55,6369 > аргинин 48,0637 > глутаминовая кислота 44,4464 > треонин 35,9329 мг > лейцин 33,1624 > аспарагиновая кислота 32,0314 > триптофан 28,0507 > аланин 24,7456 > изолейцин 18,8042 > тирозин 9,5433 > цистеин 8,5552 > фенилаланин 6,5692 > гистидин 5,4356 > метионин 2,9825 > лизин 1,5697.

Процесс разложения комплексного соединения протекает с эндо- и экзоэффектами. В этом случае сначала разлагаются гигроскопические и кристаллизационные воды, а затем разлагаются и олигомеризуются компоненты кератинового белка, перегруппировываясь. В качестве конечного продукта разложения выделяется оксид или сульфат железа.

На основе полученных результатов термических и спектроскопических исследований, было предположено, что катионы металлов (например, Fe²⁺)  замещают ионы H⁺ или Na⁺, связанные с кислыми функциональными группами, такими как –COOH или –OH. С другой стороны, неподеленные электронные пары на атомах N, O или S координируются непосредственно с ионами металлов, образуя стабильные комплексы.

ABSTRACT

Keratin, found in sheep wool, is a valuable biopolymer with potential applications in biomedicine, cosmetics, and agriculture. This article examines alkaline hydrolysis as an effective method for extracting keratin proteins from wool. The main stages of the process are described, as well as the influence of conditions (alkali concentration, temperature, and time) on the yield and properties of keratin. Complex compounds were obtained by reaction with metal ions. Alkaline hydrolysis of natural raw materials was conducted at alkali concentrations ranging from 0.3% to 6%. Hydrolysis conditions of 90-120°C and a duration of 6-12 hours were determined. These results demonstrate that alkaline hydrolysis provides a high yield of keratin, although it may affect its structural characteristics.

The amino acid composition of the isolated extract was studied based on the HPLC chromatogram and it was found that it consists of 20 amino acids. Depending on their amount, the following sequence was observed, mg: serine 128,3307 > proline 102,2582 > glycine 79,2932 > valine 55,6369 > arginine 48,0637 > glutamic acid 44,4464 > threonine 35,9329 > leucine 33,1624 > aspartic acid 32,0314 > tryptophan 28,0507 > alanine 24,7456 > isoleucine 18,8042 > tyrosine 9,5433 > cysteine ​​8,5552 > phenylalanine 6,5692 > histidine 5,4356 > methionine 2,9825 > lysine 1,5697.

The decomposition of the complex compound occurs with endo- and exo-effects. In this case, hygroscopic and crystallization waters decompose first, followed by the decomposition and oligomerization of the keratin protein components, which rearrange. Iron oxide or sulfate is released as the final decomposition product.

Based on the results of thermal and spectroscopic studies, it was suggested that metal cations (e.g., Fe²⁺) replace H⁺ or Na⁺ ions bound to acidic functional groups such as –COOH or –OH. Conversely, lone electron pairs on N, O, or S atoms coordinate directly with metal ions, forming stable complexes.

Ключевые слова: кератин, овечья шерсть, щелочной гидролиз, биополимеры, устойчивое производство.

Keywords: keratin, sheep wool, alkaline hydrolysis, biopolymers, sustainable production.

Введение

Продукты животного происхождения богаты органическими соединениями, а некоторые содержат большое количество структурных волокнистых белков, также называемых склеропротеинами [1-4]. Эти белки являются природными полимерами, выполняющими механические и защитные функции и не имеющими питательной ценности [5,6]. Среди всех продуктов животного происхождения несъедобные ткани, такие как перья, шерсть, копыта, рога, ногти, клювы, свиная шерсть, коровья шерсть и рыбья чешуя, в основном состоят из кератина [1,2]. У людей и животных этот склеропротеин выполняет множество функций, таких как водонепроницаемость, терморегуляция, когезия и структура тканей, амортизация глубоких тканей для защиты от механических повреждений и инфекций, заживление ран, восстановление нервной системы и удаление отходов и токсинов из подкожной ткани (кожи и ее придатков) [5,7]. С точки зрения биологической значимости, кератин является наиболее распространенным структурным белком в эпителиальных клетках и вторым по распространенности белком как у людей, так и у животных после коллагена [2, 5, 6]. Основными источниками кератина являются перья курицы, утки, гуся и индейки (90% кератина по весу), овечья и козья шерсть (95% кератина) и свиная шерсть (95% кератина) [1, 3, 4]. Однако этот потенциальный источник «сырья» в значительной степени растрачивается впустую. Побочные продукты переработки кератина должны утилизироваться путем сжигания или захоронения в специально отведенных местах. Однако такая утилизация, не говоря уже о том, что она часто осуществляется без соблюдения необходимых требований, приводит к образованию и выбросу значительных количеств вредных газов, таких как CO, CO2, SOx и NOx [7, 8].

Химическая структура шерсти, очищенной от различных загрязнений, представляет собой биополимер, называемый кератином, который относится к группе белков. Элементарный состав кератина шерсти в %: C – 50,3-52,5; H – 6,4-7,3; N – 16,2-17,7; O – 15,0-20,7; S – 0,7-5,0 [9]. Простейшая формула, соответствующая элементному составу шерсти, содержит 39 атомов углерода и совпадает с формулой кератина (C₃₉H₆₅N₁₁SO₁₃), поскольку химические свойства шерсти схожи со свойствами кератина [10]. В общей сложности шерстяное волокно состоит из 20 аминокислот, из которых 17 имеют наибольшее содержание: аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, валин, гистидин, глицин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, пролин, серин, треонин, тирозин, цистин и фенилаланин [9].

Экспериментальная часть

Материалы и методы исследования. Использовалась шерсть овец из района Навбахор. После предварительного расчесывания шерстяной продукции ее обрабатывали магнитом для удаления железосодержащих примесей. Затем, для удаления пыли и жира, ее промывали в слабом растворе соды или мыла и несколько раз ополаскивали чистой водой. Для гидролиза шерстяной продукции, содержащей креатин, готовили щелочные растворы натрия или калия различной процентной концентрации. Для определения оптимальных условий щелочного гидролиза была проведена серия экспериментов при следующих условиях: концентрация щелочного раствора 3, 5, 7%; размер частиц сырья 0,5-2 см; соотношение массы сырья к объему щелочи 1:3, 1:5, 1:10; время гидролиза 4-8 часов; температура 80-95°C. Для нейтрализации щелочного раствора использовали 40% ортофосфорную кислоту, pH раствора составлял 7-7,6.

Для определения количества аминокислот в полученных гидролизатах использовали ВЭЖХ-хроматографию. ВЭЖХ: хроматограф Agilent Technologies 1200 s с детектором DAD, колонка 75x4,6 мм Discovery HS C18. Раствор А: 0,14 М CH3COONa + 0,05% TEA, pH 6,4, В: CH3CN. Скорость потока 1,2 мл/мин, поглощение 269 нм. Градиент %B/мин: 1-6%/0-2,5 мин; 6-30%/2,51-40 мин; 30-60%/40,1-45 мин; 60-60%/45,1-50 мин; 60-0%/50,1-55 мин [11].

Для определения состава функциональных групп в составе гидролизата путем его переведения в жидкое и твердое состояния был получен ИК-спектр в диапазоне 400-4000 см-1 на таблетке KBr с использованием аппарата Shumadze IRSpirit, а видимый и ультрафиолетовый спектры были получены с использованием спектрофотометра UV 755 [12].

Для изучения процессов термического разложения комплексных соединений, полученных на основе кератинового гидролизата, были получены их дериватограммы на дериватографе «Синхронный термоанализатор DTG-60/60H» со скоростью 10 об/мин [13].

Результаты исследования и обсуждение.

1. Изучение аминокислотного состава гидролизата кератина. При переработке овечьей шерсти был выбран метод обработки сырья водным раствором гидроксида натрия при температуре 90 °C (n=10). При экстракции шерсти 0,5%-ным раствором гидроксида степень экстракции кератина составляла не более 3% (шерсть практически не растворяется). При обработке шерсти при 90 °C с экстракцией в течение 1 часа 6%-ным раствором гидроксида натрия степень экстракции кератина составляла 95-97% (почти полное растворение шерсти). Для изучения состава выделенного раствора кератина была получена хроматограмма ВЭЖХ и определен его аминокислотный состав (рис. 1 и табл. 1).

Результаты таблицы показывают, что кератин содержит 20 аминокислот. В зависимости от их количества наблюдалась следующая последовательность: серин 128,3307 мг > пролин 102,2582 > глицин 79,2932 > валин 55,6369 > аргинин 48,0637 > глутаминовая кислота 44,4464 > треонин 35,9329 мг > лейцин 33,1624 > аспарагиновая кислота 32,0314 > триптофан 28,0507 > аланин 24,7456 > изолейцин 18,8042 > тирозин 9,5433 > цистеин 8,5552 > фенилаланин 6,5692 > гистидин 5,4356 > метионин 2,9825 > лизин 1,5697 [11].

Таблица 1.

Содержание аминокислот, полученное на основе хроматографии ВЭЖХ

Эти показатели свидетельствуют о том, что количество полезных аминокислот в гидролизатах, полученных из шерсти, достаточно и указывают на возможность приготовления питательных веществ и микроудобрений из этого белкового гидролизата в будущем [12].

Рисунок 1. Хроматограмма кератина

2. Анализ ИК-спектров гидролизатов кератинового белка.

Были получены ИК-спектры изолированных и щелочных экстрактов кератинового белка (рис. 2-3). В спектре в следующих областях появились линии поглощения: 3250-3600 см⁻¹, соответствующие валентным колебаниям карбоксильных групп и ОН-группы молекулы воды, которые образуют широкую вогнутую линию из-за их большого количества в олигомере. Двойной максимум поглощения в области 1300-1400 см⁻¹ соответствует деформационным колебаниям ОН-группы и валентным колебаниям связи S-O.

Линии поглощения в области 3100-2850 см⁻¹ в спектре связаны с водородными связями, а также соответствуют валентным колебаниям группы NH₂ в этой области, а колебания внутренних водородных связей появляются в области 1650-1680 см⁻¹. Кроме того, глубокая линия поглощения в области 1550-1700 см⁻¹ в спектре принадлежит карбоксильной группе ионов.

В ИК-спектре в области 2450 см⁻¹ появляется слабоинтенсивная линия поглощения, соответствующая связям S-H и -S-S-. Валентные колебания дисульфидных и C-S связей появляются в области 600-670 см⁻¹. Линии поглощения в области 1100-1200 см⁻¹ соответствуют группам P=O и P-O [12].

Рисунок 2. ИК-спектр щелочного экстракта кератинового белка

На основании результатов ИК-спектроскопии можно сделать вывод, что состав экстракта, полученного из шерсти, подтвержден аминокислотами.

Таким образом, результаты ВЭЖХ и ИК-спектроскопии подтверждают друг друга, и экстракт, полученный из шерсти, состоит из олигомеров аминокислот.

Рисунок 3. ИК-спектр нейтрального раствора гидролизата кератинового белка

3. Изучение металлокомплексов, полученных на основе гидролизата кератина.

Изучено взаимодействие гидролизата кератинового белка с ионами железа(II). Растворы ионов металла с концентрацией 0,01 моль/л смешивали с раствором гидролизата кератина в течение 1-2 часов. Затем смесь полировали в фарфоровой ступке при температуре 40-50 °C, смешивали со спиртом, и соединение выделяли в твердом виде. Микроскопические изображения полученных соединение представлена рисунке 4.

Рисунок 4. Микроскопическое изображение кристаллов FeSO₄ + Ker.hyd

3.1. Анализ результатов термического анализа.

При термическом анализе комплексного соединения, полученного на основе гидролизата кератина с ионом Fe²⁺, были получены следующие результаты (табл. 2, рис. 5).

Из диаграммы производных видно, что в начальном процессе разложения наблюдаются три эндотермических состояния: 1) начальная температура составляет 114,2°C, а конечная температура — 121,4°C. Максимум разложения — 119,4°C, а значение энтальпии — 0,0631 Дж/г; 2) начальная температура — 130,8°C, максимум разложения — 132,4°C, а конечная температура — 145,8°C; этот процесс также является эндотермическим, а значение энтальпии — 5,3995 Дж/г; 3) в этом эндотермическом процессе Tисх. — 145,8°C, Tmax. — 149,7°C, Tконеч. — 167,4°C, а значение энтальпии — 19,3971 Дж/г, и общая масса разложившегося вещества составляет 18,40 мг (38,50%). Эти значения указывают на выделение гигроскопической и кристаллизационной воды в комплексе.

Таблица 2.

Значения термического разложения комплекса Fe²⁺ +гидролизата кератина:

t = -10°C/мин; T = 24,50–740,10°C; m = 47,792 мг.

Можно также сказать, что это частично соответствует началу процесса олигомеризации в результате разрушения гидролизатов кератинового белка, поскольку на следующем этапе наблюдается экзотермический процесс.

Рисунок 5. Дериватограмма комплексного соединения железа (2+).

В ходе экзотермического процесса на дериватограмме наблюдаются следующие параметры: Tисх. - 293,4°C, Tконеч.- 333,3°C, Tmax - 318,2°C, значение энтальпии составляет 4,2283 Дж/г, а общая масса разложившегося вещества соответствует ТГ - 2,01 мг (4,21%).

Последующие экзотермические процессы происходят в температурном диапазоне 582,0-740,0°C, а значения температурных изменений следующие: T_исх. - 655,4°C, T_конеч. - 698,8°C, T_max - 681,1°C. Значение энтальпии составляет 3,7077 Дж/г, а общая масса разложившегося вещества - 10,04 мг (21,1%). Это можно объяснить полным разложением органического вещества и образованием оксидов и сульфидов металлов [11].

Таким образом, на основании результатов термического анализа можно сделать вывод, что процесс разложения комплексного соединения протекает с эндо- и экзоэффектами. В этом случае сначала разлагаются гигроскопические и кристаллизационные воды, а затем разлагаются и олигомеризуются компоненты кератинового белка, перегруппировываясь. В качестве конечного продукта разложения выделяется оксид или сульфат железа.

3.2. Анализ результатов ИК-спектров.

ИК-спектр синтезированных соединений показал линии поглощения в следующих областях: 3000-3600 (широкая вогнутая), 2300-2390 (интенсивная), 1600-1640, 1410, 1370-1310, 1200, 1100, 900, 700-800 (вогнутая), 670, 600, 520, 480 см⁻¹.

3000-3600 см⁻¹ относятся к валентным колебаниям карбоксильных групп и группы OН молекулы воды, которые образуют широкую вогнутую линию из-за их большого количества в олигомере. Двойной максимум поглощения в области 1310-1410 см⁻¹ соответствует деформационным колебаниям группы OH и валентным колебаниям связи C-O. Линии поглощения в области 3100-2850 см⁻¹ в спектре принадлежат водородным связям, а также соответствуют валентным колебаниям группы NH₂ в этой области. Если колебания внутренних водородных связей также видны в области 1650-1680 см⁻¹ в гидролизате кератина, то в спектре комплексного соединения они появляются при 1600-1640 см⁻¹, что указывает на взаимодействие этих групп с ионами металлов (табл. 3).

Таблица 3.

ИК-спектральная характеристика гидролизата кератина и её комплекса с железой(2+).

Слабые линии поглощения, соответствующие связям S-H и -S-S-, появляющиеся в ИК-спектре при 2450 см⁻¹ и в области 2300-2390 см⁻¹, указывают на то, что эти группы также связаны с ионами металлов. Колебания растяжения дисульфидных и C-S связей появляются в области 600-670 см⁻¹. Линии поглощения в области 1100-1200 см⁻¹ соответствуют группам P=O и P-O [12-15].

Кератин содержит множество аминокислот, имеющих разнообразные функциональные группы, такие как аминогруппы (−NH₂, −NH₃⁺), карбоксильные группы (−COOH), амидные группы (−CONH−), гидроксильные группы (−OH) и дисульфидные связи (-S-S-). Это основные группы, ответственные за координации ионы металлов (табл.3).

Основной механизм характеризуется координационными взаимодействиями между ионами металла (Fe²⁺) и гидроксильными и аминогруппами, присутствующими на основе кератина, что приводит к образованию стабильных комплексов металл-лиганд.

На основе полученных результатов термических и спектроскопических исследований, было предполложено, что катионы металлов (например, Fe²⁺)  замещают ионы H⁺ или Na⁺, связанные с кислыми функциональными группами, такими как –COOH или –OH. С другой стороны, неподеленные электронные пары на атомах N, O или S координируются непосредственно с ионами металлов, образуя стабильные комплексы. Также имело место электростатическое взаимодействие между положительно заряженными ионами металла и отрицательно заряженными функциональными группами гидролизата кератина.

Схематическое представление возможного механизма координации иона железа (2+) на кератина:

Заключение

На основании проведенных экспериментов были сделаны следующие выводы:

1. Щелочной гидролиз природного сырья проводился при нескольких процентных 0,3-6% концентрациях щелочи, и были определены условия гидролиза 90-120^оС и течение 6-12 ч.

2. Аминокислотный состав выделенного экстракта изучался на основе хроматограммы ВЭЖХ, и было установлено, что он состоит из 20 аминокислот. В зависимости от их количества наблюдалась следующая последовательность, мг: серин 128,3307 > пролин 102,2582 > глицин 79,2932 > валин 55,6369 > аргинин 48,0637 > глутаминовая кислота 44,4464 > треонин 35,9329 > лейцин 33,1624 > аспарагиновая кислота 32,0314 > триптофан 28,0507 > аланин 24,7456 > изолейцин 18,8042 > тирозин 9,5433 > цистеин 8,5552 > фенилаланин 6,5692 > гистидин 5,4356 > метионин 2,9826 > лизин 1,5697.

3. Процесс разложения комплексного соединения протекает с эндо- и экзоэффектами. В этом случае сначала разлагаются гигроскопические и кристаллизационные воды, а затем разлагаются и олигомеризуются компоненты кератинового белка, перегруппировываясь. В качестве конечного продукта разложения выделяется оксид или сульфат железа.

4. На основе полученных результатов термических и спектроскопических исследований, было предполложено, что катионы металлов (например, Fe²⁺)  замещают ионы H⁺ или Na⁺, связанные с кислыми функциональными группами, такими как –COOH или –OH. С другой стороны, неподеленные электронные пары на атомах N, O или S координируются непосредственно с ионами металлов, образуя стабильные комплексы.

Cписок литературы:

1. Чен, Х.; Гао, С.; Ли, Ю.; Сюй, Х. Дж.; Ли, В.; Ван, Дж.; Чжан, Ю. Оценка отходов животного кератина: применение в сельском хозяйстве. Int. J. Environ. Res. Public Health 2022, 19, 6681.
2. Ферраро, В.; Антон, М.; Санте-Лутелье, В. «Сестринские» α-спирали коллагена, эластина и кератина из побочных продуктов животного происхождения: тенденции в функциональности, биоактивности и применении. Trends Food Sci. Technol. 2016, 51, 65–75.
3. Тиморшина, С.; Попова, Е.; Осмоловский, А. Устойчивое использование белков животных отходов. Polymers 2022, 14, 1601.
4. Vineis, C.; Varesano, A.; Varchi, G.; Aluigi, A. Выделение и характеристика кератина из различных видов биомассы. Кератин как белковый биополимер: выделение и применение из отходов биомассы; Sharma, S., Kumar, A., редакторы; Springer International: Берлин/Гейдельберг, Германия, 2019; стр. 35–76.
5. Sarma, A. Биологическое значение и фармацевтическая ценность кератина: обзор. Int. J Biol. Macromol. 2022, 219, 395–413.
6. Wang, B.; Yang, W.; Маккиттрик, Дж.; Майерс, М.А. Кератин: структура, механические свойства, наличие в биологических организмах и попытки биоинспирации. Prog. Mater. Sci. 2016, 76, 229–318.
7. Али М.Ф., Хоссейн М.С., Моин Т.С., Ахмед С., Чоудхури А.М.С. Производство экологически чистых и устойчивых композитных материалов с использованием куриных перьев. Clean. Eng. Technol. 2021, 4, 100190.
8. Шеляпина М.Г., Родригес-Изнага И., Петрановский В. Материалы для снижения выбросов CO2, SOx и NOx. В Справочнике по наноматериалам и нанокомпозитам для энергетики и экологии; под редакцией О. В. Харисовой, Л. М. Торрес-Мартинеса, Б. И. Харисовой; Шпрингер: Берлин/Гейдельберг, Германия, 2021 г.; стр. 2429–2458.
9. Новорадовская Т. С., Садова С. Ф. Химия и технология химической ваты, Легпромиздат, М. 1986. 200 с.
10. К.Х. Нуржанова, Н.Б. Бурамбаева, Шакарим атындагы СМУ Хабаршысы, 2 (54), 18-20 (2011)
11. 11.Steven A., Cohen Daviel J. Amino acid analysis utilizing phenylisothiocyanata derivatives // Jour. Analytical Biochemistry – 1988. – V.17.-№1.-P.1-16.
12. Б.Н. Тарасевич. ИК спектр основных классов органических соединений. Справочный материал. Москва 2012. 55с.
13. Алиев Т., Рахимова Ф., Хусенов К., Каримов З., Ахтамов Д. Очистка модельных растворов от ионов меди(2+) водными экстрактами гидролизатов белоксодержащего кератина. E3S конференций 548,08006 (2024)
14. Фролов В.Я. Физико-химические методы исследования координационных соединений. - М.: Химия, 2008.
15. Накамото К. Инфракрасные и рамановские спектры неорганических и координационных соединений. - 6-е изд. – Уайли, 2009.