АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ И БИОСИНТЕЗ ВИНКАМИНА ЭНДОФИТНЫМ ГРИБОМ Penicillium sp. VM86S, АССОЦИИРОВАННЫМ С Vinca minor L.

АННОТАЦИЯ

Vinca minor L. (барвинок малый) — лекарственное растение семейства Apocynaceae, Эндофитные грибы рассматриваются как перспективный альтернативный источник фармакологически ценных вторичных метаболитов растений. Vinca minor L. является известным продуцентом индольного алкалоида винкамина, обладающего нейропротективными и антиоксидантными свойствами. В настоящем исследовании оценена способность эндофитного гриба Penicillium sp. VM86S, ассоциированного с V. minor, к биосинтезу винкамина, а также изучена антиоксидантная активность его метаболитов. Установлено, что содержание винкамина в биомассе гриба составляет 165,6 мкг/г сухой массы. Экстракт продемонстрировал выраженную антирадикальную активность (IC₅₀ = 138,7 мкг/мл) и умеренную общую антиоксидантную активность. Показано, что антиоксидантный эффект обусловлен не только присутствием винкамина, но и совокупным действием комплекса вторичных метаболитов. Полученные результаты подтверждают высокий биосинтетический потенциал эндофитных грибов и их перспективность как устойчивой платформы для получения фармацевтически значимых алкалоидов.

ABSTRACT

Vinca minor L. (lesser periwinkle) is a medicinal plant belonging to the Apocynaceae family. Endophytic fungi are considered a promising alternative source of pharmacologically valuable plant secondary metabolites. Vinca minor is a well-known producer of the indole alkaloid vincamine, which exhibits neuroprotective and antioxidant properties.

In the present study, the ability of the endophytic fungus Penicillium sp. VM86S, associated with V. minor, to biosynthesize vincamine was evaluated, and the antioxidant activity of its metabolites was investigated. The content of vincamine in the fungal biomass was found to be 165.6 µg/g of dry weight.

The extract demonstrated significant free radical scavenging activity (IC₅₀ = 138.7 µg/mL) and moderate total antioxidant capacity. It was shown that the antioxidant effect is not solely due to the presence of vincamine but also results from the combined action of a complex of secondary metabolites.

These findings confirm the high biosynthetic potential of endophytic fungi and highlight their promise as a sustainable platform for the production of pharmaceutically important alkaloids.

Ключевые слова: Penicillium sp.VM86S, Vinca minor, винкамин, эндофиты, антиоксидантная активность, индольные алкалоиды.

Keywords: Penicillium sp., Vinca minor, vincamine, endophytes, antioxidant activity, indole alkaloids.

Введение

Vinca minor L. является важным источником индольных алкалоидов, среди которых винкамин представляет особый интерес благодаря нейропротективным свойствам, способности улучшать мозговое кровообращение и снижать уровень окислительного стресса. Кроме того, винкамин характеризуется выраженной антиоксидантной активностью, что определяет его перспективность для фармакологического применения [1,2,3].

В последние годы эндофитные грибы привлекают значительное внимание как альтернативный источник биологически активных соединений. Эти микроорганизмы способны синтезировать или биотрансформировать вторичные метаболиты растений-хозяев, включая алкалоиды, фенольные соединения и другие вещества с антиоксидантной активностью [4,5,6]. Ранее показано, что эндофиты, ассоциированные с V. minor, способны продуцировать соединения, сходные по структуре и биологической активности с метаболитами растения [7,8]. Однако уровень продукции винкамина эндофитными грибами, а также вклад отдельных компонентов в формирование антиоксидантной активности остаются недостаточно изученными, что ограничивает их практическое использование в биотехнологии.

В связи с этим целью настоящего исследования явилась оценка способности эндофитного гриба Penicillium sp. VM86S к биосинтезу винкамина и анализ антиоксидантной активности его метаболитов.

Материалы и методы

Объект исследования. Эндофитный гриб Penicillium sp. VM86S выделен из стебля Vinca minor L., произрастающего в условиях Узбекистана, и депонирован в коллекции лаборатории биохимии и биотехнологии физиологически активных соединений [9].

Культивирование. Штамм выращивали на картофельно-декстрозном агаре при 28 °C в течение 7 суток, после чего переносили в жидкую кукурузную среду и инкубировали на шейкере (140 об/мин) при 28 °C в течение 7 суток. Полученную биомассу вместе с культуральной жидкостью лиофилизировали.

Экстракция вторичных метаболитов. Сухую биомассу экстрагировали хлороформом (1:5) в течение 24 часов. Экстракт фильтровали и концентрировали на роторном испарителе, затем растворяли в 70% этаноле и дополнительно очищали фильтрацией через мембранный фильтр (0,45 мкм).

Определение алкалоидов. Общее содержание алкалоидов определяли с использованием реакции Драгендорфа. Оптическую плотность измеряли при 435 нм; калибровочная зависимость характеризовалась высокой линейностью (R² = 0,9901).

Определение общей антиоксидантной активности (ФМ-метод) Антиоксидантную активность экстрактов измеряли фосфомолибденовым методом. Пробу (0,3 мл) смешивали с 3 мл реакционной смеси (0,6 М серная кислота, 28 мМ натриевый фосфат, 4 мМ молибдат аммония), инкубировали 90 мин при 95 °C. Оптическую плотность измеряли при 695 нм, результаты выражали в эквивалентах аскорбиновой кислоты (EAA/мл).

Определение антирадикальной активности (DPPH) Экстракты растворяли в этаноле (1 мг/мл) и готовили концентрации 100–500 мкг/мл. Смешивали с 0,2 мМ DPPH и инкубировали 30 мин при 37 °C. Оптическую плотность измеряли при 517 нм, вычисляли % ингибирования:

Стандарты: аскорбиновая кислота и препарат Vinebral® (винкамин). Значения IC₅₀ образцов, концентрация, необходимая для ингибирования 50% свободных радикалов, были рассчитаны с использованием калибровочной кривой методом нелинейной регрессии.

ВЭЖХ и LC–MS/MS Количественное определение винкамина проводили на Agilent 1100 с колонкой Discovery HS-C18 (2,7 мкм, 150×4,6 мм) при λ = 274 нм. Для LC–MS/MS использовали систему Agilent 1200 с CHIP-Q-TOF, градиент элюирования 0–60% раствор B (12–18 мин), идентификацию проводили совместно с Институтом биоорганической химии АН РУз.

Рисунок 1. Абсорбционный спектр комплекса нитрата  висмута – тиокарбамида

Результаты и их обсуждение

Современные исследования подтверждают, что эндофитные грибы обладают способностью синтезировать или биотрансформировать вторичные метаболиты, характерные для растения-хозяина, включая фармакологически значимые алкалоиды, что делает их перспективным источником природных биологически активных соединений [16]. В частности, показано, что эндофитные штаммы, выделенные из Vinca minor L., способны продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов. Так, ранее было установлено, что гриб Fusarium sp. VM40 синтезирует алкалоидные соединения, что подтверждает высокий биосинтетический потенциал эндофитов данного растения [8].

В настоящем исследовании проведена оценка биомассы и содержания алкалоидов, включая винкамин, у эндофитного гриба Penicillium sp. VM86S (табл. 1). Полученные результаты показали, что при культивировании в заданных условиях штамм характеризуется интенсивным ростом: влажная биомасса составила 47,89 г/л, а сухая — 12,14 г/л. Данные показатели свидетельствуют о высокой продуктивности культуры и её пригодности для биотехнологического получения вторичных метаболитов.

Таблица 1.

Оценка биомассы и содержания алкалоидов, включая винкамин, у эндофитного гриба Penicillium sp. VM86S

Примечание: данные представлены как средние значения трёх экспериментов.

Общее содержание алкалоидов достигало 360,75 мкг/г сухой биомассы, что указывает на выраженную активность вторичного метаболизма у данного штамма. При этом содержание винкамина составило 165,6 мкг/г сухой биомассы (0,017%), что подтверждено методом ВЭЖХ. В пересчёте на объём культуральной среды концентрация винкамина достигала 2010,4 мкг/л, что характеризует Penicillium sp. VM86S как потенциально эффективный продуцент данного алкалоида в условиях глубинного культивирования.

Следует отметить, что доля винкамина составляет значительную часть от общего содержания алкалоидов, что свидетельствует о направленности метаболических процессов в сторону синтеза именно этого соединения. Это может быть обусловлено как генетическими особенностями штамма, так и влиянием растения-хозяина, с которым эндофит находится в тесной симбиотической связи.

Сравнительный анализ с литературными данными показывает, что содержание винкамина в надземных частях Vinca minor L. составляет около 0,057% от сухой массы растения, что примерно в три раза превышает аналогичный показатель для исследуемого эндофита [10]. Данный результат является ожидаемым, поскольку растение является естественным продуцентом винкамина. Однако важно подчеркнуть, что значения, полученные для Penicillium sp. VM86S, находятся в сопоставимом диапазоне, что имеет принципиальное значение с точки зрения биотехнологии.

В отличие от растений, эндофитные грибы обладают рядом преимуществ, включая высокую скорость роста, возможность контролируемого культивирования и независимость от сезонных и экологических факторов. Это позволяет рассматривать их как перспективную альтернативу традиционным источникам получения алкалоидов.

В исследовании Hong Yin & Yu‑Hong Sun  10 штаммов эндофитных грибов были изолированы из различных частей Vinca minor. Один из них (Vm‑J2) показал положительную реакцию на алкалоиды и был подтверждён по TLC и HPLC как продуцирующий винкамин, совпадающий по времени удерживания с аутентичным винкамином из растения‑хозяина [7].

Подобные результаты наблюдаются и в нашем исследовании. В результате анализа хлороформного экстракта эндофитного гриба Penicillium sp. VM86S методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещённой с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ–МС/МС), был обнаружен и идентифицирован алкалоид винкамин (рис. 2). В масс-спектре соответствующего пика наблюдался ион с m/z 355 [M+H], что соответствует молекулярной массе винкамина (354 Да), а также характерные фрагментные ионы, согласующиеся с литературными данными для данного алкалоида. Совпадение времени удерживания и масс-спектральных характеристик с таковыми для стандартного образца подтверждает достоверность идентификации. Полученные результаты указывают на способность данного штамма синтезировать монотерпен-индольные алкалоиды, типичные для растения-хозяина.

(а)

(б)

 (в)

Рисунок 2. Идентификация винкамина в экстракте Penicillium sp. VM86S: а — ВЭЖХ-хроматограмма; б — сравнение со стандартом винкамина; в —  результаты LC–MS, показывающие значение m/z 355 для винкамина.

Результаты настоящего исследования согласуются с литературными данными. Так, Koel и соавт. показали, что индольные алкалоиды, включая винкамин, катарантин и виндолин, могут быть надёжно идентифицированы и количественно определены методом HPLC-MS/MS в растениях семейства Apocynaceae [11]. Кроме того, Ren Na и соавт. установили наличие алкалоидов типа винкамина в эндофитных грибах, выделенных из Nerium indicum [12]. Это подтверждает, что эндофиты, ассоциированные с представителями данного семейства, способны к биосинтезу сходных по структуре вторичных метаболитов.

Несмотря на то что Vinca minor L. остаётся более эффективным природным продуцентом винкамина по содержанию в растительной ткани, эндофитный гриб Penicillium sp. VM86S демонстрирует сопоставимый порядок величин, что представляет значительный интерес с точки зрения биотехнологии. Возможность контролируемого культивирования микроорганизмов делает их перспективной альтернативной платформой для получения данного алкалоида.

Известно, что винкамин и его производные обладают широким спектром биологической активности, включая антиоксидантное, гипогликемическое и гиполипидемическое действие. Экспериментальные исследования in vivo показали, что данные соединения способны снижать уровень перекисного окисления липидов и повышать активность антиоксидантных ферментов, тогда как in vitro исследования демонстрируют их способность подавлять воспалительные процессы и уменьшать продукцию активных форм кислорода (ROS) [13,14,15].

В связи с этим была проведена оценка антиоксидантной активности экстракта Penicillium sp. VM86S с использованием фосфомолибденового (ФМ) метода и метода улавливания свободных радикалов DPPH. По результатам ФМ-анализа установлено, что антиоксидантная активность всех исследуемых образцов возрастает с увеличением концентрации (100–500 мкг/мл), что свидетельствует о выраженном дозозависимом эффекте.

Наибольшую активность проявила аскорбиновая кислота, используемая в качестве стандарта. Экстракт Penicillium sp. VM86S продемонстрировал умеренную антиоксидантную активность, значения которой возрастали в исследуемом диапазоне концентраций, тогда как винкамин показал более низкие значения. В соответствии с этим, по уровню общей антиоксидантной активности (ФМ-метод) образцы можно расположить в следующем порядке: аскорбиновая кислота > экстракт Penicillium sp. VM86S > винкамин (рис. 3).

Рисунок 3. Оценка общей антиоксидантной активности экстракта Penicillium sp. VM86S по фосфомолибдату.

Результаты DPPH-теста показали, что исследуемый экстракт обладает выраженной способностью к нейтрализации свободных радикалов. При концентрации 500 мкг/мл уровень ингибирования достигал около 85%, что сопоставимо с активностью стандартных антиоксидантов. Винкамин, исследованный в аналогичных условиях, демонстрировал умеренную активность (10–80% ингибирования), уступая как экстракту, так и аскорбиновой кислоте.

Сравнительный анализ показал, что при высоких концентрациях антирадикальная активность экстракта в DPPH-тесте приближается к активности винкамина, тогда как по ФМ-методу она остается ниже. Данные различия, вероятно, связаны с особенностями используемых методов: DPPH-тест отражает способность соединений к донорству электронов или атомов водорода, тогда как ФМ-метод характеризует суммарный восстановительный потенциал (рис.4).

Рисунок 4. Удаление свободных радикалов экстрактом Penicillium sp. VM86S методом DPPH

Значение IC₅₀ для экстракта Penicillium sp. VM86S в DPPH-тесте составило 138,7 мкг/мл, что указывает на его высокую антирадикальную активность. В ФМ-методе значение IC₅₀ было выше (около 400 мкг/мл), что свидетельствует о более умеренной общей антиоксидантной активности. Для сравнения, IC₅₀ винкамина и аскорбиновой кислоты составили около 310 и 680 мкг/мл соответственно (рис.5).

Таким образом, антиоксидантная активность экстракта Penicillium sp. VM86S обусловлена не только присутствием винкамина, но и совокупным действием других вторичных метаболитов, включая фенольные соединения и флавоноиды. Вероятно, синергетический эффект этих компонентов обеспечивает более высокую антирадикальную активность экстракта по сравнению с отдельными соединениями.

Рисунок 5. Значения IC₅₀ антиоксидантной активности

Заключение

Проведённое исследование показало, что эндофитный гриб Penicillium sp. VM86S способен к биосинтезу винкамина (165,6 мкг/г сухой биомассы), демонстрируя высокий уровень вторичного метаболизма.

Экстракт гриба проявляет выраженную антиоксидантную активность, особенно в реакции с радикалом DPPH (IC₅₀ = 138,7 мкг/мл), что свидетельствует о его значительном биоактивном потенциале. Установлено, что данный эффект обусловлен не только присутствием винкамина, но и синергетическим действием комплекса вторичных метаболитов.

Полученные данные подтверждают перспективность эндофитных грибов как альтернативного источника фармакологически ценных алкалоидов и основы для разработки устойчивых биотехнологических процессов. В дальнейшем представляется целесообразным проведение исследований, направленных на оптимизацию условий культивирования, повышение выхода целевых метаболитов и детальное изучение механизмов их биосинтеза.

Список литературы:

1. Vas A., Gulyas B. Eburnamine derivatives and the brain // Medicinal Research Reviews. – 2005. – Vol. 25, No. 6. – P. 737–757. – https: doi: 10.1002/med.20043.
2. Vrabec R., Drasar P., Opletal L., Kosturko S., Blunden G., Cahlikova L. Alkaloids from the genus Vinca L. (Apocynaceae): a comprehensive biological and structural review // Phytochemistry Reviews. – 2025. – Vol. 24. – P. 3665–3735. – https: doi: 10.1007/s11101-025-10102-z.
3. Vrabec R., Marikova J., Locarek M., Korabecny J., Hulcova D., Hostalkova A., Kunes J., Chlebek J., Kucera T., Hrabinova M., Jun D., Soukup O., Andrisano V., Jenco J., Safratova M., Novakova L., Opletal L., Cahlikova L. Monoterpene indole alkaloids from Vinca minor L. (Apocynaceae): identification of new structural scaffold for treatment of Alzheimer’s disease // Phytochemistry. – 2022. – Vol. 194. – P. 113017. – https: doi: 10.1016/j.phytochem.2021.113017.
4. Asomadu R. O., Ezeorba T. P. C., Ezike T. C., Uzoechina J. O. Exploring the antioxidant potential of endophytic fungi: a review on methods for extraction and quantification of total antioxidant capacity (TAC) // 3 Biotech. – 2024. – Vol. 14. – P. 127. – https:doi: 10.1007/s13205-024-03970-3.
5. Manganyi M. C., Ateba C. N. Untapped potentials of endophytic fungi: a review of novel bioactive compounds with biological applications // Microorganisms. – 2020. – Vol. 8, No. 12. – P. 1934. – https:doi: 10.3390/microorganisms8121934.
6. Zhao J., Zhou L., Wang J., Shan T., Zhong L., Liu X., Gao X. Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants // In: Méndez Vilas A. (ed.) Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. – Badajoz: Formatex Research Center, 2010. – Vol. 1. – P. 567–576.
7. Yin H., Sun Y.-H. Vincamine-producing endophytic fungus isolated from Vinca minor // Phytomedicine. – 2011. – Vol. 18, No. 8–9. – P. 802–805. – https:doi: 10.1016/j.phymed.2011.01.005.
8. He T., Li X., Iacovelli R., Hackl T., Haslinger K. Genomic and metabolomic analysis of the endophytic fungus Fusarium sp. VM-40 isolated from the medicinal plant Vinca minor // Journal of Fungi. – 2023. – Vol. 9, No. 7. – P. 704. – https:doi: 10.3390/jof9070704.
9. Abdulmyanova L. I., Ruzieva D. M., Sattarova R. S., Gulyamova T. G. Vinca alkaloids produced by endophytic fungi isolated from Vinca plants // International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. – 2018. – Vol. 7, No. 6. – P. 2244–2250. – https: doi: 10.20546/ijcmas.2018.706.267.
10. Farahanikia B., Akbarzadeh T., Jahangirzadeh A., Yassa N., Ardekani M. R. Sh., Mirnezami T., Hadjiakhoondi A., Khanavi M. Phytochemical investigation of Vinca minor cultivated in Iran // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. – 2011. – Vol. 10, No. 4. – P. 777–785. – https:doi: 10.22037/ijpr.2011.992.
11. Koel M., Kuhtinskaja M., Vaher M. Extraction of bioactive compounds from Catharanthus roseus and Vinca minor // Separation and Purification Technology. – 2020. – Vol. 252. – P. 117438.
12. Naa R., Jiajia L., Dongliang Y., Yingzi P., Juan H., Xiong L., Nana Zh., Jing Zh., Yitian L. Identification of vincamine indole alkaloids producing endophytic fungi isolated from Nerium indicum (Apocynaceae) // Microbiological Research. – 2016. – Vol. 192. – P. 114–121. – https:doi: 10.1016/j.micres.2016.06.008.
13. Ren Y., DeRose K., Li L., Gallucci J. C., Yu J., Kinghorn A. D. Vincamine: from an antioxidant and a cerebral vasodilator to its anticancer potential // Bioorganic & Medicinal Chemistry. – 2023. – Vol. 92. – P. 117439. – https: doi: 10.1016/j.bmc.2023.117439.
14. Wu L., Ye M., Zhang J. Vincamine prevents lipopolysaccharide-induced inflammation and oxidative stress via thioredoxin reductase activation in human corneal epithelial cells // American Journal of Translational Research. – 2018. – Vol. 10, No. 7. – P. 2195–2204.
15. Nandini H. S., Naik P. R. Antidiabetic, antihyperlipidemic and antioxidant effect of vincamine in streptozotocin-induced diabetic rats // European Journal of Pharmacology. – 2019. – Vol. 843. – P. 233–239. – https:doi: 10.1016/j.ejphar.