ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОСИНТЕЗ АЛКАЛОИДОВ ЭНДОФИТНЫМИ ГРИБАМИ Chelidonium majus L.

АННОТАЦИЯ

В исследовании оценивалась способность эндофитных грибов, изолированных из различных частей растения Chelidonium majus L., к синтезу алкалоидов и влияние состава питательной среды на их биосинтез. Из 28 выделенных эндофитов 12 показали активную продукцию алкалоидов. Наибольшая продуктивность была зафиксирована у Plectosphaerella sp. FK14 (2,134 мг/г) и Paramyrothecium  sp. CS8 (1,967 мг/г). Ферментация проводилась на различных питательных средах: картофельно-декстрозном бульоне (PDB), дрожжевой среде (YESD), среде Чапека–Докса и среде с солодовым экстрактом (MEB). Содержание алкалоидов измеряли в динамике роста культур. Установлено, что в присутствии органических источников азота (пептон, экстракт дрожжей) продукция алкалоидов увеличивается, при этом максимальный выход алкалоидов составил 43,15 мг/г в Plectosphaerella sp. FK14 на среде YESD. Однако, не было выявлено прямой корреляции между ростом биомассы и продукцией алкалоидов в ходе исследования. Полученные результаты подтверждают потенциал эндофитных грибов C. majus в качестве источника биологически активных алкалоидов для биотехнологических применений.

ABSTRACT

The study evaluated the ability of endophytic fungi, isolated from different parts of Chelidonium majus L., to synthesize alkaloids and the effect of culture media composition on their biosynthesis. Out of 28 isolated endophytes, 12 demonstrated active alkaloid production, with the highest yields of 2.134 mg/g and 1.967 mg/g observed in Plectosphaerella sp. FK14 and Paramyrothecium sp. CS8, respectively. Fermentation was carried out in potato-dextrose broth (PDB), yeast extract sucrose medium (YESD), Czapek–Dox medium, and malt extract broth (MEB), and alkaloid content was measured during the growth dynamics of the cultures. It was found that the presence of organic nitrogen sources (peptone, yeast extract) enhanced alkaloid production, with a maximum yield of 43.15 mg/g in Plectosphaerella sp. FK14 on YESD medium. However, no direct correlation between biomass growth and alkaloid production over time was observed. The results confirm the potential of Chelidonium majus endophytes as a source of biologically active alkaloids for biotechnological applications.

Ключевые слова: Chelidonium majus, алкалоиды, OSMAC, эндофитные грибы, Plectosphaerella sp, Paramyrothecium sp.

Keywords: Chelidonium majus, alkaloids, OSMAC, endophytic fungi, Plectosphaerella sp, Paramyrothecium sp.

Введение

В последние годы выявление новых источников биологически активных вторичных метаболитов является важным направлением современной биотехнологии и фармацевтики [1,2]. Особенно большой интерес вызывает симбиотическое взаимодействие растений с эндофитными грибами, которые являются перспективным источником различных алкалоидов, фенольных соединений, терпенов и других биоактивных веществ. Эндофиты могут синтезировать соединения, обладающие биологической активностью, аналогичной или даже более высокой, чем у их хозяев-растений [3].

Chelidonium majus L. (семейство Chelidonium majus L. (чистотел большой) - растение, произрастающее в природе в Европе, Азии и Южной Америке. Хотя это растение ядовито, оно содержит  ценные биологически активные вещества, в частности,           препараты из чистотела содержат алкалоиды, которые подавляют рост грибков, бактерий, вирусов, простейших. Оно имеет множество терапевтических применений, а также противоопухолевые свойства [4]. Установлено, что отмеченные свойства чистотела обусловлены алкалоидами  бензофенантридином и изохинолином (sanguinarin, chelidonin, berberine и другие), которые проявляют антимикробные, цитотоксические и  противовоспалительные свойства [4,7]. Однако, эндофиты C. majus как продуценты алкалоидов изучены слабо. В работе Marchut-Mikolajczyk и др. показано, что эндофитные микроорганизмы, выделенные из C. majus, обладают хорошими эмульгирующими свойствами, что имеет решающее значение для производства биосурфактантов [5]. В другом исследовании одиннадцать культивируемых эндофитных грибов были выделены из корней, стеблей и листьев C. majus. Семь из них были идентифицированы как Colletotrichum, а три из них были идентифицированы как Fusarium по морфологическим признакам и молекулярно-биологическим технологиям. Тест на противогрибковую активность показал, что все протестированные грибы проявляли некоторую ингибирующую активность в отношении пяти распространенных патогенов растений (C. gloeosporioides, Curvularia lunata, Pyricularia oryza, Alternaria alternate и A. brassicae) [6].

Эндофитные грибы признаны ценным источником разнообразных вторичных метаболитов. Однако в условиях аксенического культивирования синтез этих метаболитов в эндофитах часто снижается из-за криптического состояния их синтеза. Одним из эффективных подходов к регуляции вторичного синтеза метаболитов, включая алкалоиды, является метод "Один штамм - много соединений" (OSMAC, One Strain–Many Compounds), который предполагает активацию криптических путей синтеза через изменение условий ферментации и состава питательной среды [8,9].

Цель данного исследования заключается в изоляции эндофитных грибов из различных частей растения Chelidonium majus L. и оценке их способности к продукции алкалоидов при ферментации в различных питательных средах.

Полученные результаты позволят расширить возможности получения биологически активных алкалоидов из эндофитных грибов и их дальнейшего биотехнологического применения.

Материалы и методы

1. Выделение эндофитов из растения Chelidonium majus

Здоровые листья, корни и стебли растения Chelidonium majus сначала тщательно промывали под проточной водопроводной водой, затем стерилизовали в 70 % этаноле в течение 2 минут и в 1 % растворе гипохлорита натрия в течение 30 секунд. После этого образцы повторно промывали в 70 % этаноле в течение 5 секунд. Далее части растения трижды промывали стерильной дистиллированной водой и разрезали на небольшие фрагменты.

Небольшие кусочки помещали в чашки Петри диаметром 9 см и размещали на поверхность картофельно-декстрозного агара (PDA), содержащего 0,2 г/л цефтриаксона натрия. Чашки Петри инкубировали при температуре 28°C в тёмных условиях. Через несколько дней наблюдался рост грибов из фрагментов растения. Отдельные гифальные кончики различных грибов выделяли и переносили на новую среду PDA, после чего инкубировали при 28 °C не менее 7 дней [10].

2. Ферментация эндофитных грибов по подходу OSMAC

Для оценки влияния состава питательной среды на синтез алкалоидов использовался подход «Один штамм — множество соединений» (OSMAC). Чистые культуры эндофитов инкубировали в четырех различных жидких питательных средах при 28 °C:

1. Среда Чапек–Докса (g/L): NaNO₃ – 2.0, K₂HPO₄ – 1.0, MgSO₄ – 0.5, KCl – 0.5, FeSO₄ – 0.01, сахароза – 20.0, объем доводили до 1 л дистиллированной водой.
2. Картофельно-декстрозный бульон (PDB, g/L): картофель – 200.0, глюкоза – 20.0, экстракт дрожжей – 5.0, MgSO₄ – 0.01, объем доводили до 1 л дистиллированной водой.
3. Мальт-экстрактный бульон (MEB, g/L): мальт-экстракт – 20.0, пептон – 2.0, сахароза – 10.0, объем доводили до 1 л дистиллированной водой.
4. YESD-бульон (g/L): пептон – 20.0, сахароза – 20.0, экстракт дрожжей – 5.0, объем доводили до 1 л дистиллированной водой.

Ферментацию проводили с постоянным перемешиванием в течение 16 дней. Образцы для анализа биомассы и содержания алкалоидов отбирали на 7-й, 10-й, 13-й и 16-й день.

3.Экстракция алкалоидов

Из каждого образца эндофита брали по 5 г влажной биомассы и проводили экстракцию в 50 мл этанола в течение 48 часов. Полученные экстракты фильтровали, после чего растворитель упаривали под вакуумом до объёма 20 мл, а затем доводили объём до 50 мл дистиллированной водой. Раствор подкисляли 1N HCl до pH 2–3. Затем образцы очищали хлороформом (3 × 50 мл). После этого водную фазу подщелачивали 25 % раствором аммиака до pH 9,5–10 и алкалоиды экстрагировали хлороформом (3 × 50 мл). После испарения органического растворителя сухие экстракты растворяли в 5 мл метанола (MeOH) [11].

4. Качественное определение алкалоидов

Для выявления алкалоидов использовали реактив (KBiI₄). Экстракт гриба (5 мл) доводили до pH 2–2,5 с помощью разбавленной HCl и добавляли 2 мл реактив Драгендорфа. Образование оранжево-коричневого осадка указывало на присутствие алкалоидов. Осадок центрифугировали и промывали спиртом для удаления посторонних веществ. Этот метод позволяет быстро оценить наличие алкалоидов в экстракте [12].

5. Количественное определение алкалоидов

Для измерения содержания алкалоидов применяли стандартный комплекс висмут–тиокарбамид. После осаждения алкалоидов реактивом Драгендорфа, висмут из образовавшегося комплекса полностью выделяли динатрий-сульфидом. Осадок растворяли при необходимости в концентрированной HNO₃ и доводили объем до 10 мл дистиллированной водой. 1 мл раствора смешивали с 5 мл тиокарбамида, и абсорбцию комплекса измеряли при длине волны 435 нм.

Линейная зависимость абсорбции от концентрации висмута (R² = 0,9901) использовалась для расчета содержания алкалоидов, так как комплекс висмут–алкалоид образуется в соотношении 1:1. Таким образом, количество висмута точно отражает количество алкалоидов в экстракте. Метод обеспечивает точность и повторяемость результатов, а комплекс устойчив более 24 часов, что позволяет надежно определять продуктивность эндофитов в различных средах [12].

Результаты и их обсуждение

Из корней, стеблей и листьев Chelidonium majus было выделено 28 эндофитных грибов, из которых 12 проявили способность к синтезу алкалоидов при скрининге с использованием реагента Драгендорфа. Количественное определение общего содержания алкалоидов показало диапазон 0,215–2,134 мг/г. Количественное определение алкалоидов проводилось с использованием стандартного комплекса висмут–тиокарбамид и реагента Драгендорфа (KBiI₄). В кислой среде нитрат висмута образует желтый комплекс {Bi[CS(NH₂)₃]}(NO₃)₃,  а затем алкалоиды полностью выделяются динатрий-сульфидом. Калибровочная зависимость концентрация–абсорбция была линейной (R² = 0,9901), что позволяет точно определять содержание алкалоидов по количеству висмута [12]. (рисунок 1).

Рисунок 1. Абсорбционный спектр комплекса нитрата  висмута – тиокарбамида

Наибольшая продуктивность была зарегистрирована у изолятов Plectosphaerella sp. FK14 и Paramyrothecium sp. CS8, с показателями 2,134 и 1,967 мг/г соответственно, что сделало их кандидатами для дальнейших исследований (табл. 1).

Согласно литературным данным, эндофитные грибы рода Plectosphaerella, выделенные из растения Cynanchum auriculatum, способны синтезировать значительное количество вторичных метаболитов с выраженной цитотоксической активностью (например, caudatin - до 31,8 мг) [13]. В настоящем исследовании установлено, что эндофит Plectosphaerella sp. FK14, изолированный из корней Chelidonium majus, также обладает способностью к синтезу алкалоидов в количестве 2,134 мг/г биомассы.

Из эндофитного гриба Paramyrothecium roridum, выделенного из растения Gynochthodes officinalis, впервые был обнаружен новый изоиндолиноновый алкалоид - Pararorine A, который продемонстрировал высокую цитотоксическую активность (значения IC₅₀ от 1,69 до 8,95 μM) [16]. Данное обстоятельство может объяснять высокую метаболическую активность изолята Paramyrothecium sp. CS8, который в условиях проведённого эксперимента продуцирует алкалоиды в количестве 1,967 мг/г биомассы (рисунок 2).

Таблица 1.

Определение общего содержания алкалоидов у эндофитных грибов Chelidonium majus.

Примечание: В таблице  даны средние значения  трех  экспериментов

Для изучения влияния условий культивирования на синтез алкалоидов, изоляты Plectosphaerella sp. FK14 и Paramyrothecium sp. CS8 подвергались ферментации в различных питательных средах (PDB, YESD, Чапек–Докса и MEB) с применением подхода OSMAC. Данные, представленные в таблице 2, демонстрируют динамику роста биомассы и синтеза алкалоидов у этих эндофитных грибов в различных питательных средах, в течение 7, 10, 13 и 16 дней ферментации.

Для изолята Plectosphaerella sp. FK14 на среде YESD наблюдалось наибольшее накопление алкалоидов — максимальное значение 43,15 мг/г биомассы за 13 дней ферментации, несмотря на относительно низкую биомассу (13,87 г/л). На среде MEB также фиксировался высокий уровень алкалоидов (35,65 мг/г при биомассе 135,01 г/л). В средах PDB и Чапек–Докса синтез алкалоидов был ниже, с максимальными значениями 15,68 мг/г и 6,01 мг/г соответственно.

Изолят CS8 демонстрировал схожие тенденции. На среде YESD максимальное содержание алкалоидов достигало 31,68 мг/г при биомассе 30,07 г/л. Среда MEB обеспечивала высокие показатели алкалоидов (26,30 мг/г при биомассе 51,32 г/л), тогда как PDB и Чапек–Докса демонстрировали более низкий синтез алкалоидов — 14,94 мг/г и 1,68 мг/г соответственно (табл.2).

Рисунок 2. Рост наиболее активных эндофитных грибов: Fusarium sp. CS8; (1) и Plectosphaerella sp. FK14 (2) на различных питательных средах: A – KDB, B – Чапек–Докса, C – YESD, D – MEB.

Эти данные подтверждают, что состав питательной среды оказывает существенное влияние на продукцию алкалоидов эндофитами. Высокая продукция алкалоидов на YESD и MEB, вероятно, связана с наличием органических источников азота (пептон, дрожжевой экстракт), которые активируют биосинтез вторичных метаболитов у эндофитов [14]. Анализ данных показал, что не существует прямой корреляции между массой биомассы и уровнем синтеза алкалоидов: в ряде случаев максимальная продукция алкалоидов наблюдалась при относительно низкой биомассе. Это согласуется с представлением о том, что синтез вторичных метаболитов преимущественно активен в стационарной фазе роста [15].

В целом полученные результаты показывают, что эндофитные грибы, находящиеся в симбиотической связи с Chelidonium majus, являются важным биотехнологическим источником получения биологически активных алкалоидов. В дальнейшем целесообразно провести идентификацию индивидуальных алкалоидов, синтезируемых отобранными изолятами, с использованием хроматографических методов (HPLC, LC–MS), а также оценить их биологическую активность.

Заключение

Результаты исследования показали, что эндофитные грибы, живущие в симбиозе с Chelidonium majus, являются значимым источником для биосинтеза алкалоидов. Из 28 выделенных эндофитов 12 проявили способность к синтезу алкалоидов, при этом Plectosphaerella sp. FK14 и Paramyrothecium sp. CS8 демонстрировали наибольшую метаболическую активность. Ферментационные эксперименты, выполненные по подходу OSMAC, показали, что состав питательной среды, особенно наличие источников органического азота, значительно стимулирует биосинтез алкалоидов.

Кроме того, установлено, что продукция алкалоидов не всегда прямо пропорциональна росту биомассы, что подтверждает активный синтез вторичных метаболитов преимущественно в стационарной фазе роста. В целом, полученные данные демонстрируют перспективность эндофитных грибов как альтернативного и стабильного биотехнологического источника алкалоидов.