АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СРЕДНЕЗАСОЛЁННЫХ ПОЧВ СЫРДАРЬИНСКОЙ ОБЛАСТИ, ПО ОТНОШЕНИЮ К ФИТОПАТОГЕННЫМ ГРИБАМ

АННОТАЦИЯ

В данной исследовательской работе оценивалась антагонистическая активность штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 против фитопатогенных грибов. В качестве объектов исследования были выбраны бактериальные изоляты, выделенные из среднесолонцеватых почв Сырдарьинской области (районы Янгиер и Баяут-1). Изоляты были систематически определены методом MALDI-TOF MS, а затем идентифицированы на основе последовательности гена 16S рРНК. Антагонистическая активность определялась в чашках Петри методом диффузии в лунки (Well diffusion test). В исследовании использовались такие фитопатогенные грибы, как Fusarium solani, F. oxysporum, F. culmorum, F. verticillioides, Alternaria alternata, Cladosporium sp., Penicillium chrysogenum и Aspergillus ochraceus. Результаты показали, что штаммы, относящиеся к родам Priestia и Bacillus, обладают высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов. Данные штаммы считаются перспективными для дальнейшего использования в качестве экологически безопасных биологических фунгицидов.

ABSTRACT

In this research work, the antagonistic activity of Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11, and Bacillus paralicheniformis Y13 strains against phytopathogenic fungi was evaluated. The study objects were bacterial isolates obtained from moderately saline soils of the Syrdarya region (Yangiyer and Bayaut-1 districts). The isolates were taxonomically characterized using MALDI-TOF MS and subsequently identified based on 16S rRNA gene sequence analysis. Antagonistic activity was assessed in Petri dishes using the well diffusion assay. The phytopathogenic fungi used in this study included Fusarium solani, F. oxysporum, F. culmorum, F. verticillioides, Alternaria alternata, Cladosporium sp., Penicillium chrysogenum, and Aspergillus ochraceus. The results demonstrated that strains belonging to the genera Priestia and Bacillus exhibited high antagonistic activity against phytopathogenic fungi. These strains are considered promising candidates for further development as environmentally friendly biological fungicides.

Ключевые слова: Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11, Bacillus paralicheniformis Y13, антагонистическая активность, фитопатогенные грибы, Well diffusion test, биологический контроль.

Keywords: Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11, Bacillus paralicheniformis Y13, antagonistic activity, phytopathogenic fungi, well diffusion test, biological control.

ВВЕДЕНИЕ

Большинство болезней растений в сельском хозяйстве вызывается фитопатогенными грибами. Они приводят к снижению урожайности, ухудшению качества продукции при хранении и значительным экономическим потерям, представляя серьёзную угрозу глобальной продовольственной безопасности [1,2]. Особенно опасными являются такие фитопатогенные грибы, как Fusarium spp., Alternaria alternata, Penicillium chrysogenum, Aspergillus ochraceus и Cladosporium spp., которые вызывают различные заболевания корней, стеблей и плодов растений [3,4]. Кроме того, данные фитопатогены способны длительное время сохраняться в почве в виде спор, нанося значительный ущерб сельскохозяйственным культурам.

Несмотря на эффективность традиционных химических фунгицидов в краткосрочной перспективе, их чрезмерное и бессистемное применение приводит к ряду негативных последствий, включая экологические проблемы, формирование устойчивости грибов к фунгицидам, а также угнетение и гибель полезных микроорганизмов почвы [5,6]. В связи с этим методы биологической борьбы, в частности использование антагонистических микроорганизмов, рассматриваются как актуальная и экологически безопасная альтернатива [7].

Бактерии, стимулирующие рост растений, оказывают влияние на развитие растений двумя путями — прямым и косвенным. Прямое воздействие включает синтез фитогормонов или облегчение усвоения питательных веществ. Косвенное воздействие реализуется за счёт снижения или предотвращения вредного влияния фитопатогенов, что достигается посредством продукции антагонистических веществ либо конкуренции с патогенами [8,9].

Согласно данным мировых исследователей, бактерии, способствующие снижению распространения заболеваний растений, чаще всего рассматриваются как агенты биологического контроля, тогда как микроорганизмы, проявляющие антагонистическую активность по отношению к патогенам, называются антагонистами [10]. Ризосферная среда и бактериальная антагонистическая активность характеризуются следующими механизмами:

Гидролитические ферменты (протеазы, липазы) разрушают клетки фитопатогенных грибов [11,12].

Конкуренция за питательные вещества и колонизация поверхности корней растений [13,14].

Регуляция уровня этилена в растениях посредством фермента ACC-деаминазы [15,16].

Синтез сидерофоров и антибиотических веществ.

Бактерии, относящиеся к родам Bacillus и Priestia, широко распространены в почве и ризосферной микрофлоре и подавляют рост фитопатогенных грибов за счёт продукции липопептидов, сидерофоров, протеаз и других биологически активных соединений [17,18,19]. В частности, эндофитные и ризосферные штаммы Bacillus paralicheniformis и Priestia endophytica способны вступать в симбиотические взаимоотношения с различными растениями, играя важную роль в стимуляции их роста и повышении устойчивости к заболеваниям [20,21].

Бактерии рода Bacillus, в том числе Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus paralicheniformis, характеризуются выраженными антифунгальными, антибактериальными и ростстимулирующими свойствами [22,23]. Липопептиды (сурфактин, итурин, фенгицин), продуцируемые данными бактериями, воздействуют на клеточные мембраны патогенных грибов, ингибируя их рост и развитие [24].

Бактерия Priestia endophytica также вступает в симбиотические взаимоотношения с растениями, способствуя стимуляции их роста и обеспечивая защиту от фитопатогенов. Антифунгальная активность данного вида, особенно по отношению к Fusarium spp. и Alternaria alternata, до настоящего времени остаётся недостаточно изученной, что обуславливает необходимость проведения дальнейших исследований в этом направлении [25].

Антагонистические бактерии подавляют фитопатогенные грибы посредством следующих механизмов:

– синтез антифунгальных соединений (липопептиды, продуцируемые Bacillus subtilis);

– ферментативное разрушение клеточных стенок патогенов (продукция хитиназ и глюканаз у Streptomyces spp.);

– конкурентное вытеснение за экологическую нишу (конкуренция Pseudomonas fluorescens в ризосфере);

– индукция системной устойчивости растений (Induced Systemic Resistance, ISR) [26,27,28].

Целью настоящего исследования являлась оценка антагонистической активности штаммов Bacillus paralicheniformis M1 и Priestia endophytica N6, выделенных из ризосферы растений, по отношению к различным фитопатогенным грибам в условиях in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовались фитопатогенные грибы Fusarium solani, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum, Cladosporium sp., Penicillium chrysogenum, Fusarium culmorum, Fusarium verticillioides и Aspergillus ochraceus. Штаммы Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 были выделены из образцов среднезасолённых почв и идентифицированы на основе анализа гена 16S рРНК. Антагонистическая активность оценивалась методом диффузии в агар с использованием лунок (well diffusion test) в чашках Петри [29]. Для каждого фитопатогенного гриба в чашки Петри вносили бактериальные культуры, после чего проводили наблюдение за ростом грибных колоний.

Инкубирование фитопатогенных грибов и бактерий

При изучении антагонистических свойств бактерий по отношению к фитопатогенным грибам на первом этапе была приготовлена питательная среда Чапека для культивирования грибов (K₂HPO₄ — 1 г/л, MgSO₄ — 0,5 г/л, KCl — 0,5 г/л, FeSO₄ — следовые количества, сахароза — 30 г/л, NaNO₃ — 2 г/л, агар — 20 г/л). Параллельно бактериальные культуры выращивали в жидкой питательной среде MPB (Nutrient Broth), содержащей пептон — 5 г/л, NaCl — 5 г/л, мясной экстракт — 1,5 г/л, экстракт дрожжей — 1,5 г/л, pH 7,4, в течение 3 суток при температуре 28–30 °C.

После инкубации в стерильных условиях ламинарного бокса грибы суспендировали в стерильной дистиллированной воде. Спустя 10 минут по 200 мкл суспензии, полученной из активно растущих грибных колоний, наносили на поверхность чашек Петри, предварительно залитых 40 мл среды Чапека, и равномерно распределяли с помощью стерильного шпателя. Через 20 минут после адсорбции суспензии на поверхность среды в центральной части чашек формировали лунку. В образованную лунку вносили по 330 мкл трёхсуточных культур штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13, выращенных в среде Nutrient Broth. Посевы инкубировали при температуре 28 °C в течение 3 суток.

Рост фитопатогенных грибов контролировали ежедневно, измеряя диаметр зоны ингибирования (мм). Обозначение «–» указывало на отсутствие роста бактериальной колонии.

Измерение диаметра роста бактерий

После инкубации диаметр роста бактериальных колоний на чашках Петри измеряли линейкой в горизонтальном и вертикальном направлениях, после чего рассчитывали среднее значение. Для каждого вида гриба эксперимент повторяли трижды.

Расчет зоны воздействия (%)

Площадь, подавленная бактерией (зона ингибирования), определяли как разность между общим диаметром чашки Петри (80 мм) и диаметром роста бактерий. Процент зоны воздействия рассчитывали по следующей формуле [30]:

Площадь зоны воздействия = ∙100                                  (1)

Каждое измерение проводилось с точностью ±3 мм, исследование повторялось трижды, а средние значения представлены в таблице.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследовании была оценена антифунгальная активность штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 по отношению к восьми фитопатогенным грибам. Антифунгальная активность определялась методом диффузии в агар с использованием лунок (well diffusion test) путём измерения диаметра роста бактерий и расчёта процента зоны воздействия. Диаметр роста бактерий и рассчитанный процент зоны воздействия представлены в Таблице 1.

Полученные результаты показали, что штамм Priestia endophytica N6 проявлял высокую антагонистическую активность по отношению к различным фитопатогенным грибам (Рис. 1). Исключением стал только Penicillium chrysogenum, по отношению к которому антагонистическая активность не была зарегистрирована. В первый день роста бактерии наблюдалась зона воздействия 12,5%, однако на второй день гриб покрыл колонию бактерий. В таблице данное воздействие обозначено знаком «–». Антифунгальная активность данного штамма по остальным грибам достигала максимальных значений на третий день.

Для следующих грибов: Alternaria alternata (50%), Penicillium chrysogenum (51,25%), Fusarium verticillioides (53,75%) и Fusarium solani (57,5%). В отношении Fusarium culmorum, Cladosporium sp. и Aspergillus ochraceus зоны воздействия составили соответственно 43,75%, 41,25% и 30%. При этом процент зоны воздействия выше 50% был зафиксирован для Fusarium solani и Fusarium verticillioides.

Рисунок 1b. Антифунгальная активность штамма Priestia endophytica N6 по отношению к фитопатогенным грибам

Антифунгальная активность штамма Bacillus paralicheniformis M11 достигала максимального ингибирующего эффекта на третий день. Данный штамм проявлял антагонистическую активность против всех исследуемых фитопатогенных грибов. Процент зоны воздействия выше 50% был зафиксирован для Alternaria alternata и Fusarium culmorum (53,75%), Fusarium verticillioides (60%) и Fusarium solani (56,25%). По отношению к Aspergillus ochraceus (43,75%) и Fusarium oxysporum (47,5%) активность была ниже, а минимальные значения наблюдались для Cladosporium sp. и Penicillium chrysogenum (по 25%) (Рис. 2).

Рисунок 2. Антагонистическое воздействие штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 на рост фитопатогенных грибов (мм)

Таблица 1.

Антагонистическое воздействие штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 на рост фитопатогенных грибов (мм).

Таблица 2.

Ингибирование роста колоний фитопатогенных грибов различными бактериальными штаммами Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13.

Влияние штаммов представлено в таблице 2. Антифунгальная активность штамма Bacillus paralicheniformis Y13 достигала максимального ингибирующего эффекта на третий день. Данный штамм не проявлял антагонистической активности только по отношению к Aspergillus ochraceus. В первый день наблюдался рост бактериальной колонии (площадь воздействия — 18,75%), однако на второй день гриб полностью перекрыл бактериальную колонию. В таблице данный результат обозначен знаком «–». По отношению ко всем остальным фитопатогенным грибам штамм проявлял антагонистическую активность.

Процент зоны воздействия выше 50% был зарегистрирован только для Fusarium solani (55%). В отношении Alternaria alternata (43,75%), Fusarium verticillioides (46,25%), Fusarium culmorum (37,5%) и Fusarium oxysporum (37,5%) отмечалась умеренная активность, тогда как минимальные значения были зафиксированы для Cladosporium sp. (18,75%) и Penicillium chrysogenum (18,75%) (Рис. 3).

Рисунок. Антифунгальная активность штамма Bacillus paralicheniformis Y13 по отношению к фитопатогенным грибам

ОБСУЖДЕНИЕ

Антагонистическая активность трёх бактериальных штаммов, использованных в данном исследовании, была установлена на основе их ингибирующего воздействия на рост восьми фитопатогенных грибов. При сравнении антифунгальной активности трёх штаммов наибольшие показатели продемонстрировал штамм Bacillus paralicheniformis M11, который проявлял антифунгальную активность по отношению ко всем восьми исследуемым фитопатогенным грибам. Максимальный процент зоны воздействия был зафиксирован для Fusarium verticillioides и составил 60% на третий день инкубации. Средние значения антифунгальной активности составили: Priestia endophytica N6 — 40,94%, Bacillus paralicheniformis M11 — 45,63%, Bacillus paralicheniformis Y13 — 32,19%. Полученные результаты согласуются с данными ранее проведённых исследований. Так, Chen и соавт. (2009) показали, что усиление антифунгального эффекта у штаммов рода Bacillus связано с продукцией липопептидов, таких как итурин, фенгицин и сурфактин, которые нарушают структурную целостность клеточных мембран грибов [31].

Изменение антифунгальной активности в течение инкубационных суток связано с динамикой продукции бактериальных метаболитов, а также с условиями конкуренции в питательной среде [32]. Кроме того, сидерофоры, продуцируемые штаммом P. endophytica N6, способны связывать ионы железа, тем самым ограничивая рост фитопатогенных грибов. Протеазные и хитиназные ферменты разрушают клеточные стенки грибов, ингибируя их развитие [33]. Индол-3-уксусная кислота (IAA) способствует стимуляции роста растений и повышению их устойчивости к стрессовым факторам [34].

Антагонистическая активность бактериальных штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 свидетельствует об их высоком потенциале в борьбе с фитопатогенными грибами. Подобные бактерии могут быть использованы в сельском хозяйстве в качестве природного и эффективного средства защиты сельскохозяйственных культур. В предыдущих исследованиях была установлена антагонистическая активность штамма Priestia megaterium по отношению к Fusarium oxysporum [35]. Кроме того, значимость настоящего исследования заключается в том, что в нём впервые была проведена оценка антифунгального потенциала местных штаммов Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 на фоне локальных изолятов фитопатогенных грибов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что штаммы Priestia endophytica N6, Bacillus paralicheniformis M11 и Bacillus paralicheniformis Y13 обладают высокой антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам. Особенно выраженный ингибирующий эффект наблюдался в отношении Fusarium solani, Alternaria alternata и Fusarium verticillioides. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данных бактериальных штаммов в сельском хозяйстве в качестве экологически безопасных агентов биологического контроля, а также обосновывают необходимость более глубокого изучения потенциала ризосферных микроорганизмов в борьбе с фитопатогенами.

Список литературы:

1. Annual Review of Phytopathology, 01 Sep 2005, Vol. 43, Issue 1, pp. 83–116.
2. Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S. K. (2016). Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, 6(2), 71–79.
3. Dean, R. et al. (2012). The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, 13(4), 414–430.
4. Gopalakrishnan, S. et al. (2011). Biological control of soil-borne diseases in legumes: Prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology, 21(2), 139–153.
5. Brent, K.J., & Hollomon, D.W. (2007). Fungicide resistance in crop pathogens: How can it be managed? FRAC Monograph No. 1.
6. Ghorbanpour, M. et al. (2018). Mechanisms underlying the biological control potential of beneficial bacteria in the rhizosphere. Biological Control, 120, 20–29.
7. Compant, S. et al. (2005). Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, mechanisms of action, and future prospects. Applied and Environmental Microbiology, 71(9), 4951–4959.
8. Glick BR (1995) The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Can J Microbiol, 41:109–117.
9. Patten CL and Glick BR (2002) Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system. Appl Environ Microbiol, 68:3795–3801.
10. Beattie GA (2006) Plant-associated bacteria: Survey, molecular phylogeny, genomics and recent advances. In: Gnanamanickam SS (ed) Plant-Associated Bacteria. Springer, Dordrecht, pp 1–56.
11. Neeraja C et al. (2010) Biotechnological approaches to develop bacterial chitinases as a bioshield against fungal diseases of plants. Crit Rev Biotechnol, 30:231–241.
12. Maksimov IV et al. (2011) Plant growth promoting rhizobacteria as alternative to chemical crop protectors from pathogens (Review). Appl Biochem Microbiol, 47:333–345.
13. Stephens PM et al. (1993) Selection of pseudomonad strains inhibiting Pythium ultimum on sugarbeet seeds in soil. Soil Biol Biochem, 25:1283–1288.
14. Kamilova F et al. (2005) Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ Microbiol, 7:1809–1817.
15. Kushiev Kh. et all (2025) Pathogen Management in Glycyrrhiza glabra: Microbial Interactions and Phylogenetic Insights. Journal of Phytopathology. https://doi.org/10.1111/jph.70057
16. Van Loon LC (2007) Plant responses to plant growth-promoting rhizobacteria. Eur J Plant Pathol, 119:243–254.
17. Caulier, S. et al. (2019). Versatile antagonistic activities of Bacillus amyloliquefaciens GA1 against phytopathogens. Frontiers in Microbiology, 10, 1438.
18. Ongena, M., & Jacques, P. (2008). Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends in Microbiology, 16(3), 115–125.
19. Zhao, Y. et al. (2021). Priestia gen. nov., a novel genus reclassified from Bacillus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 71(2).
20. Berg, G. et al. (2013). The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science, 18(11), 478–486.
21. Liu, Y. et al. (2020). Endophytic bacterial communities in plants and their role in plant development and stress tolerance. Journal of Integrative Plant Biology, 62(11), 1551–1564.
22. Gleason, M. et al. (2019). Annual Review of Phytopathology Stealth Pathogens: The Sooty Blotch and Flyspeck Fungal Complex. Annual Review of Phytopathology, 57, 1–7.
23. Leslie, J. et al. (2008). Mycotoxins: Detection methods, management, public health and agricultural trade.
24. Magan, N. & Aldred, D. (2004). The Role Of Spoilage Fungi In Seed Deterioration. Fungal biotechnology in agricultural, food and environmental application.
25. Gupta, R. et al. (2021). Taxonomy and functional role of genus Priestia: a review. Current Microbiology, 78, 1349–1358.
26. Ongena, M. & Jacques, P. (2008). Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends in Microbiology, 16, 115–125.
27. Palaniyandi, S.A. et al. (2013). Aktinobakteriyalarning o'simlik kasalliklarini bostirish va o'sishni rag'batlantirishga ta'siri. Appl Microbiol Biotechnol, 97, 9621–9636.
28. Van Loon, L.C. et al. (1998). Rizosfera bakteriyalari tomonidan qo'zg'atilgan tizimli qarshilik. Annu. Rev. Phytopathol., 36, 453–483.
29. Pitt, J. & Hocking, A. (2009). Fungi and Food Spoilage.
30. Zhao, Y. et al. (2021). Priestia gen. nov., a novel genus reclassified from Bacillus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 71(2).
31. Chen, X.H. et al. (2009). Structural and functional characterization of fengycin synthetase from Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology, 75(2), 632–640.
32. Leslie, J.F. & Summerell, B.A. (2006). The Fusarium Laboratory Manual.
33. Santoyo, G. et al. (2016). Plant growth-promoting bacterial endophytes. Microbiological Research, 183, 92–99.
34. Elanchezhiyan, K. et al. (2018). Evaluation of antifungal activity of bacterial endophytes against Fusarium oxysporum causing wilt disease. Current Agriculture Research Journal, 12(1), 1–9.
35. Ongena, M., & Jacques, P. (2008). Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends in Microbiology, 16(3), 115–125.