МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРРО-ФЕРРИЦИАНИДНОЙ МЕДИАТОРНОЙ СИСТЕМЫ

АННОТАЦИЯ

Суммарная антиоксидантная активность (САОА) растительного сырья является интегральным показателем восстановительной способности смеси антиоксидантов (полифенолы, флавоноиды, аскорбаты, тиолы и др.). В работе представлена методика потенциометрического определения САОА на основе измерения смещения окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) в стабильной медиаторной системе [Fe(CN)_6]³⁻/[Fe(CN)₆]⁴⁻ после добавления экстракта. Разработаны расчётные формулы, выведенные из уравнения Нернста, позволяющие рассчитывать количество восстановленного феррицианида и выражать САОА в единицах ммоль e⁻/г и мг AAE/г сухого сырья. Приведены результаты для 15 лекарственных растений при стандартных условиях экстракции и измерения. Обсуждены факторы, влияющие на точность, и рекомендации по валидации.

ABSTRACT

The total antioxidantactivity (TAA) of plantraw materials is an integralindicator of the reducingability of a mixture of antioxidants (polyphenols, flavonoids, a scorbates, thiols,etc.).The paper presents a method for the potentiometric determination of TAAbased on measuring the redoxpotential (ORP) shift in a stablemediatorsystem[Fe(CN)₆]^3-/[Fe(CN)₆]^4- afteradding the extract. Calculation formulas derived from the Nernst equation have been developed that allowcalculating the amount of reduced ferricyanide and expressing CAOA inunits of mmole⁻/gandmg AAE/g of dryraw materials. The results are presented for 15 medicinal plantsunder standard xtractionand measurement  conditions. Factors affecting accuracy and recommendations for validation are discussed.

Ключевые слова: суммарная антиоксидантная активность, потенциометрия, ферро-феррицианид, ОВП, лекарственные растения, AAE.

Keywords: total antioxidant activity, potentiometry, ferro-ferricyanide, ORP, medicinal plants, AAE.

Введение

Проблема корректного количественного выражения антиоксидантных свойств растительного сырья остаётся актуальной. Растительные экстракты представляют собой сложные многокомпонентные системы восстановителей, реализующих антиоксидантное действие по различным механизмам, включая перенос электрона и/или атома водорода, хелатирование ионов переходных металлов, ингибирование цепных радикальных реакций и комбинированные эффекты [1,2].

Для оценки антиоксидантной активности традиционно применяются спектрофотометрические методы (DPPH, ABTS, FRAP, CUPRAC), которые получили широкое распространение в анализе растительного сырья и продуктов его переработки [3]. Однако данные тесты чувствительны к мутности и собственной окраске экстрактов, а также требуют строгой стандартизации условий анализа, что существенно ограничивает их применимость при работе со сложными растительными матрицами [4].

Альтернативой оптическим методам являются электрохимические подходы, основанные на регистрации изменений потенциала или тока в модельных окислительно-восстановительных системах, позволяющие напрямую оценивать восстановительную способность исследуемых образцов [4,5].

Среди электрохимических методов особый интерес представляет потенциометрия, так как она основана на измерении равновесного или квазирaвновесного смещения электродного потенциала и не предъявляет требований к прозрачности раствора [6].

Развитие потенциометрической оценки антиоксидантной активности тесно связано с использованием медиаторных редокс-систем, обеспечивающих воспроизводимый и интерпретируемый аналитический сигнал [7,8].

Наибольшее распространение в подобных исследованиях получила медиаторная система гексацианоферратов. Ферро-феррицианидная редокс-пара характеризуется высокой химической стабильностью, быстрым установлением равновесия и возможностью строгого количественного описания результатов на основе уравнения Нернста.

Использование данной медиаторной системы лежит в основе ряда электрохимических методов определения суммарной антиоксидантной активности, включая хронопотенциометрические и хроноамперометрические подходы, успешно применяемые для анализа жидких и растительных образцов [9,10].

Стандартные редокс-потенциалы системы Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4- и особенности их использования в аналитической практике подробно рассмотрены в современных работах, что обеспечивает корректность термодинамической интерпретации потенциометрических данных.

Отдельное внимание в литературе уделяется влиянию мешающих компонентов растительных матриц на результаты потенциометрических измерений и путям повышения селективности метода при использовании гексацианоферратного медиатора [11].

Методические основы оценки восстановительной способности и антиоксидантной активности растительных объектов с применением концепции восстановления Fe(CN)₆^3- иона обобщены в ряде обзорных исследований, что подтверждает универсальность и аналитическую состоятельность данного подхода [12-15].

Целью настоящей работы является представление расширенной методики потенциометрического определения суммарной антиоксидантной активности (САОА) лекарственных растений с использованием медиаторной системы K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆], вывод расчётных зависимостей для пересчёта смещения потенциала (ΔE) в аналитический показатель САОА и экспериментальная оценка антиоксидантной активности некоторых лекарственных растений.

2. Материалы и методы

2.1. Реактивы и аппаратура

В работе использовали калия феррицианид K₃[Fe(CN)₆], калия ферроцианид K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O (чда).

В качестве фонового электролита использовали 0,1М фосфатный буферный раствор с рН 6,86, приготовленный из фиксаналов для калибровки рН метров

Для регистрации аналитического сигнала применяли двухэлектродную систему, состоящую из платинового электрода в виде проволоки и хлоридсеребряного электрода сравнения, подключенные к высокоомному вольтметру или иономеру-рН-метру И-130, работающего в режиме прецизионного милливольтметра.

2.2. Приготовление медиаторного раствора (пример стандарта)

Готовили раствор с равными концентрациями окисленной и восстановленной формы:

C_ox,0 = C_red,0 = 1,00ммоль/л,

где С_ox,0 концентрация[Fe(CN)₆]^3-; C_red,0–концентрация [Fe(CN)₆]^4-

Такой выбор обеспечивает высокий буферный редокс-емкостный диапазон и удобство расчетов

2.3. Экстракция лекарственных растений (унифицированная схема)

• Сухое сырьё измельчали до 0,5–1 мм.
• Навеска: m = 1,00 г.
• Экстрагент: 40% этанол (v/v).
• Объём экстрагента: 50,0 мл.
• Условия: 30 мин ультразвук, затем фильтрация.
• При необходимости — разбавление экстракта до попадания в линейный диапазон (Δ E).

2.4. Протокол потенциометрического измерения

1. В ячейку вносили (V₀ = 20,0) мл медиаторного ферро-ферроцианидного раствора, приготовленного на фоне 0,1М фосфатного буфера с рН 6,86.

2. Перемешивание + термостатирование (25 ± 1 °C).

3. Регистрировали исходный потенциал (E₀) (стабилизация 60–120 с).

4. Добавляли (V_s = 0,50) мл экстракта, фиксировали потенциал (E_s) после выхода на плато (обычно 2–3 мин).

5. Вычисляли (ΔE = E_s - E₀) (обычно отрицательное, т.к. система восстанавливается).

3. Расчётные формулы и обработка результатов

3.1. Уравнение Нернста для редокс-пары

Для реакции

[Fe(CN)₆]^3- + e^-→ [Fe(CN)6]^4-

При n =1

                                                                        (1)

где E^0' -формальный потенциал при данных условиях и ионной силе; R – газовая постоянная; T– температура; F – число Фарадея

3.2. Связь измеренного потенциала с изменением соотношения форм

Введём:

                                                                  (2)

До добавления образца:

                                                                                (3)

После добавления образца: часть феррицианида восстанавливается. Пусть (x) (ммоль/л) — количество ([Fe(CN)₆]^-3 восстановленного антиоксидантами(в пересчёте на объём смеси).

Тогда:

  , =C_red,0 – x                                                           (4)

и

= r                                                                            (5)

Отсюда ключевая формула:

                                                                     (6)

Если выбрано С_ox,0 = C_red,0 = C₀ то делается упрощение:

                                                                       (7)

В таблице 1 приведены значения потенциала ферро-феррицианидной системы при различных соотношениях ингредиентов относительно хлоридсеребряного электрода при 25⁰ С

Таблица 1.

Значения потенциала ферро-феррицианидной системы отн. Ag/AgCl

3.3. Пересчёт в антиоксидантную ёмкость в эквивалентах аскорбиновой кислоты

Аскорбиновая кислота (AA) — двухэлектронный восстановитель (условно 2 e⁻ на 1 молекулу в большинстве редокс-моделей), поэтому:

                                                                       (8)

Количество электронов, переданных антиоксидантами восстановленному ферроцианид-иону составит:

n(e^-) = x‧V_mix                                                                              (9)

где V_mix– общий объем в ячейке после добавки (л).

Тогда масса эквивалента аскорбиновой кислоты составит:

                                                          (10)

Если нужно выразить САОА в мг AAE/г сухого сырья при навеске (m) (г) и объёме экстракта (V_ext) (л), с учётом того, что в ячейку внесён объём (V_s) (л), то:

САОА (мг ААЕ/г) =                                          (11)

где множитель масштабирует результат от внесённой алико́ты к целому экстракту.

3.4. Практическое получение (r) без определения (E₀)

Чтобы не определять (E₀) явно, используют разность потенциалов:

Из уравнения Нернста следует:

                                     (12)

и, опять-таки, при С_ox,0 = C_red,0r₀ = 1, тогда:

                                                               (13)

При 25⁰С                           (14)

4. Результаты и обсуждение

Приведенные теоретические выкладки были использованы для определения антиоксидантной активности экстрактов аптечных сборов некоторых лекарственных растений.

С этой целью 1,00 г сырья заливали 50 мл 40% этанола и подвергали 30 минутному воздействию ультразвука, для чего использовали ультразвуковую ванну при температуре термостатирования 25 °C. Полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр. 0,5 мл экстракта вносили в электрохимическую ячейку, содержащую рабочий электрод в виде платиновой проволоки и насыщенный хлоридсеребряный электрод сравнения, погруженные в 20 мл медиаторного раствора, содержащего по 1,00 мМ ферро- и феррицианидов калия в фосфатном буфере с рН 6,86.

Измерения проводили с точностью ±1 мв при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Время установления постоянного значения потенциала не превышало 30 -40 секунд. Каждое измерение проводили по три раза о определяли среднее значение ΔЕ.

В таблице 2 приведены результаты определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов относительно эквивалента аскорбиновой кислоты.

Таблица 2.

Результаты определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов лекарственных растений

^*Примечание: x вычисляли через r = exp(ΔE/0,025693) и x = C₀(1-r)/(1+r) приC₀=1,00 ммоль/л. Пересчет в мг AAE/г — по формуле (11).

Полученные и представленные в таблице 2 результаты, можно прокомментировать следующим образом:

Наибольшая САОА в приведённом наборе ожидаемо наблюдается для шиповника (аскорбаты + фенольные соединения), а также для трав, богатых полифенолами (зверобой, крапива, мелисса/мята/шалфей).

У корневого сырья (валериана, солодка) вклад часто смещается в сторону отдельных групп веществ (сапонины/глицирризин и др.), поэтому САОА может быть умеренной, но стабильной.

Для цветков (ромашка, календула) антиоксидантный профиль определяется флавоноидами и каротиноидами; потенциометрия фиксирует суммарный восстановительный вклад, однако может быть менее чувствительна к соединениям, проявляющим антиоксидантность через нефарадеевские механизмы.

4.1. Факторы, влияющие на результат измерения

1. pH и ионная сила (влияют на формальный потенциал и активность форм медиатора).
2. Время до плато (важно фиксировать потенциал после установления квазирaвновесия).
3. Цвет/мутность — не критично для потенциометрии, что является преимуществом по сравнению со спектрофотометрией.
4. Потенциальные мешающие вещества (сильные восстановители/окислители, комплексообразователи) — рекомендуется оценивать вклад матрицы, использовать разбавления и стандартные добавки.

По влиянию первого фактора следует отметить, что в нашем конкретном случае использовали растворы, приготовленные на 0,1М фосфатном буфере с рН 6,86, приготовленные из фиксаналов, предназначенных для калибровки рН метров. Этот прием позволяет нивелировать негативное влияние рН и ионную силу экстрактов.

Фиксирование потенциала (второй фактор) следует проводить приблизительно за один и тот же промежуток времени. Однако и здесь отмечаем, что потенциал устанавливался в пределах одной минуты в условиях одинаковой интенсивности перемешивания.

При указанных условиях и использовании эквимолярных соотношений ферро-феррициадной системы [Fe(CN)₆]^3- = [Fe(CN)₆]^4- = 0,001M начальный потенциал относительно насыщенного Ag/AgCl составляет +0,228 ± 0,002 В.

Для валидации предлагаемого метода следует поступить следующим образом:

Построить калибровочный график для аскорбиновой кислоты (или другого, если требуется, антиоксиданта, например Trolox) в диапазоне Δ 5-100 мВ для установления его линейности.

Оценить повторяемость метода RSD ≤ 3–5% (n=5) на уровне средней САОА.

Провести сравнение с альтернативным электрохимическим методом.

5. Заключение

Представлен потенциометрический метод оценки суммарной антиоксидантной активности лекарственного растительного сырья с использованием медиаторной системы [Fe(CN)₆]^3-/[Fe(CN)₆]^4-. Получены расчётные формулы, позволяющие переводить смещение потенциала (ΔE) в количество восстановленного феррицианида (x), а затем — в мг AAE/г сухого сырья. Приведён пример результатов для 15 лекарственных растений, демонстрирующий возможность ранжирования объектов по суммарной восстановительной способности. Метод перспективен для экспресс-контроля качества, сравнительного скрининга и стандартизации фитосырья при корректной валидации и учёте матричных эффектов.

Список литературы:

1. Pisoschi A.M., Pop A. The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: A review // European Journal of Medicinal Chemistry. – 2015. – Vol. 97. – P. 55–74. doi:10.1016/j.ejmech.2015.04.040.
2. Haque A., Morozova K., Ferrentino G., Scampicchio M. Electrochemical methods to evaluate the antioxidant activity and capacity of foods: A review // Electroanalysis. – 2021. – Vol. 33, No. 6. – P. 1–15. doi:10.1002/elan.202060600.
3. Skotti E., Anastasaki E., Kanellou G., Polissiou M., Tarantilis P.A. Total phenolic content, antioxidant activity and toxicity of aqueous extracts from selected Greek medicinal and aromatic plants // Industrial Crops and Products. – 2014. – Vol. 53. – P. 46–54. doi:10.1016/j.indcrop.2013.12.013.
4. Bard A.J., Faulkner L.R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. 2nd ed. // New York: Wiley. – 2001. – 864 p.
5. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Майстренко В.Н. Модифицированные электроды для вольтамперометрии в химии, биологии и медицине. 5-е электронное изд. // М.: Лаборатория знаний. – 2024. – 419 с.
6. Brainina K.Z., Ivanova A.V., Sharafutdinova E.N., Lozovskaya E.L., Shkarina E.I. Potentiometry as a method of antioxidant activity investigation // Talanta. – 2007. – Vol. 71, No. 1. – P. 13–18. doi:10.1016/j.talanta.2006.03.018.
7. Shahidi F., Zhong Y. Measurement of antioxidant activity // Journal of Functional Foods. – 2015. – Vol. 18. – P. 757–781. doi:10.1016/j.jff.2015.01.047.
8. Брайнина Х.З., Иванова А.В., Шарафутдинова Е.Н. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии // Известия вузов. Пищевая технология. – 2004. – № 4. – С. 73–75.
9. Brainina K.Z., Varzakova D.P., Gerasimova E.L. A chronoamperometric method for determining total antioxidant activity // Journal of Analytical Chemistry. – 2012. – Vol. 67, No. 4. – P. 364–369. doi:10.1134/S1061934812020050.
10.  Muthuri L.K., Nagy L., Nagu G. Chronopotentiometric method for assessing antioxidant activity: A reagentless measuring technique // Electrochemistry Communications. – 2021. – Vol. 122. – Art. 106907. doi:10.1016/j.elecom.2020.106907.
11. Герасимова Е.Л., Салимгареева Е.Р., Елтышева Е.А., Иванова А.В., Матерн А.И. Оценка влияния матрицы на результаты потенциометрического определения антиоксидантной емкости // Журнал аналитической химии. – 2024. – Т. 79, № 1. – С. 24–31. doi:10.31857/S0044450224010036.
12. Sochor J., Dobes J., Krystofova O., et al. Electrochemistry as a tool for studying antioxidant properties // International Journal of Electrochemical Science. – 2013. – Vol. 8. – P. 8464–8489.
13. Аронбаев Д.М., Мусаева С.А., Аронбаев С.Д., Шертаева А.А. Электрохимические методы и приборы для определения антиоксидантов // Молодой учёный. – 2017. – № 18 (122). – С. 25–30.
14. Hotta H., Matsumoto K. Evaluation of antioxidant activity by flow injection analysis with electrochemical detection // Journal of Flow Injection Analysis. – 2018. – Vol. 35, No. 2. – P. 49–55.
15. Ivanova A.V., Markin A.M.G. Portable device for potentiometric determination of antioxidant capacity // Sensors. – 2023. – Vol. 23, No. 18. – Art. 7845. doi:10.3390/s23187845.