МОНИТОРИНГ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ВЭЖХ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ КОРНЯ СОЛОДКИ ОТ СЫРЬЯ ДО ШРОТА

АННОТАЦИЯ

Цель работы: Разработка и валидация метода обращенно-фазовой ВЭЖХ-УФ для количественного определения глицирризиновой кислоты (Гк) на всех стадиях переработки корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.), включая технологические отходы (шрот). Метод предназначен для мониторинга технологического процесса и оценки потенциала вторичного использования отходов. Методы: Использован метод обращенно-фазовой ВЭЖХ-УФ с детектированием при 254 нм. В качестве подвижной фазы применяли смесь ацетонитрила и 5% водного раствора уксусной кислоты (40:60, об./об.). Проведена оптимизация параметров экстракции Гк из сырья водными растворами этанола, варьируя концентрацию, время, степень измельчения, соотношение “сырьё: экстрагент”. Результаты. Валидированная методика продемонстрировала хорошие метрологические характеристики (линейность в диапазоне 30-298 мкг/мл, R²=0,9995). Установлены оптимальные условия экстракции: 50% этанол, время 60 мин, соотношение 1:30, размер частиц <0,25 мм. Содержание Гк в продуктах переработки изменялось от 5,19% в исходном сырье до 24,83% в технической Гк. В шроте, образующемся после получения густого экстракта, обнаружено 3,43% Гк, что превышает минимальные требования ряда фармакопей к лекарственному сырью. Вывод: Разработанный ВЭЖХ-метод пригоден для скрининга содержания ГК в корне солодки и продуктах его переработки.  Шрот после стадии получения густого экстракта является перспективным вторичным сырьём для извлечения биологически активных соединений, что соответствует принципам безотходных технологий.

ABSTRACT

Aim: Development and validation of a reversed-phase HPLC-UV method for quantitative determination of glycyrrhizic acid (GA) at all stages of licorice (Glycyrrhiza glabra L.) root processing, including post-extraction residue. The method is intended for monitoring the technological process and assessing the potential for secondary use of waste. Methods: A reversed-phase HPLC-UV method with detection at 254 nm was used. The mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile and 5% aqueous solution of acetic acid (40:60, v/v). Parameters for GA extraction from raw material using aqueous ethanol solutions (concentration, time, particle size, solid-to-liquid ratio) were optimized. Results: The validated method demonstrated good metrological characteristics (linearity in the range of 30-298 µg/ml, R²=0,9995). The optimal extraction conditions were established: 50% ethanol, extraction time of 60 min, solid-to-liquid ratio of 1:30, particle size of  <0,25 mm. The GA content was determined in processed products: from 5,19% in raw roots to 24,83% in crude GA. Post-extraction residue obtained after thick extract production contained 3,43% GA, which exceeds the minimum requirements of several pharmacopoeias. Conclusion: The developed HPLC method is suitable for screening GA content in licorice root and its processed products. Post-extraction residue from the thick extract production is a promising secondary raw material for the extraction of biologically active compounds, which aligns with the principles of waste-free technology.

Ключевые слова: Glycyrrhiza glabra L., сухой экстракт, густой экстракт, шрот, глицирризиновая кислота, ВЭЖХ-УФ, валидация, экстракция, оптимизация.

Keywords: Glycyrrhiza glabra L., dry extract, thick extract, post-extraction residue, glycyrrhizic acid, HPLC-UV, validation, extraction, optimization.

Введение

Солодка (Glycyrrhiza) является ценным лекарственно-техническим растением и важным источником биологически активных соединений [7, 16]. Основным компонентом корней солодки является глицирризиновая кислота, которая рассматривается как главный фармакологически активный ингредиент данного вида сырья. Противовоспалительные, противовирусные и антиаллергические свойства глицирризиновой кислоты подтверждены результатами экспериментальных и клинических исследований [5]. В настоящее время известно около 15 видов рода Glycyrrhiza, четыре из которых произрастают на территории Туркменистана [15]. Наибольшее промышленное значение имеет солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), широко распространённая вдоль берегов Амударьи и характеризующаяся высоким содержанием биологически активных веществ (БАВ) [18]. Континентальный аридный климат Туркменистана способствует интенсивному синтезу биологически активных соединений в растениях, что обуславливает высокую фармакологическую ценность местного растительного сырья [17]. В Лебапском регионе Туркменистана функционирует Агропромышленный комплекс «Буян» объединения «Türkmendermansenagat» МЗ и МПТ, где осуществляется промышленное выращивание и переработка корня солодки для внутреннего рынка и на экспорт. В технологическом процессе получают густой и сухой экстракты, а также техническую ГК (рис. 1). Существенным недостатком действующей технологической схемы является образование значительного количества отходов (шрота), доля которых достигает 50 % от массы исходного сырья, что создаёт дополнительную экологическую нагрузку. По данным ряда исследований, шрот корня солодки сохраняет значительные количества вторичных метаболитов, включая флавоноиды и сапонины, обладающих выраженной биологической активностью [21]. Эти соединения представляют интерес использования в медицине, косметологии и пищевой промышленности, что определяет их практическую ценность и экологическую целесообразность повторного вовлечения шрота в переработку в качестве источника ценных природных соединений. Такой подход согласуется с современными принципами «зелёной химии» и безотходных технологий [4]. Продукция из корня солодки, получаемая в Туркменистане, занимает заметное место на мировом рынке, в связи с чем, вопросы контроля качества на основе анализа химического состава приобретают стратегическое значение. В связи с этим особую актуальность приобретает совершенствование методов количественного определения основных компонентов состава корня солодки и продуктов его переработки, а также приведение этих методов в соответствие с международными стандартами. Показателем качества корня солодки и получаемых из него продуктов служит, прежде всего, содержание глицирризиновой кислоты. Для количественного определения содержания Гк в растительном сырье и экстрактах применяют ряд методов, включая ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрию и тонкослойную хроматографию [2, 3, 11, 13, 19, 20]. Среди них метод ВЭЖХ считается одним из наиболее селективных и воспроизводимых [12]. В литературе описаны различные варианты ВЭЖХ-определения Гк, различающиеся составом подвижной фазы и природой экстрагента [12]. В частности, показано, что использование этанола может быть более эффективным по сравнению с метанолом для экстракции Гк из корней солодки [8]. В связи с этим в данной работе для экстракции был выбран этанол.

Рисунок 1. Продукты, получаемые при переработке корня солодки в Агропромышленном комплексе “Буян”

Цель работы — разработка и валидация метода ВЭЖХ для количественного определения содержания глицирризиновой кислоты в корне солодки (Glycyrrhiza glabra L.), произрастающем в Туркменистане, а также в продуктах его переработки (густом и сухом экстрактах, технической глицирризиновой кислоте) и производственных отходах (шроте) с целью оценки эффективности переработки и поиска путей рационального использования шрота.

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследования использовали корни солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.), заготовленные в 2025 году на предприятии Агропромышленного комплекса «Буян», также продукты её переработки: густой экстракт, сухой экстракт, техническую глицирризиновую кислоту и побочный продукт – шрот (производственные отходы, образующиеся при переработке корней солодки при различных условиях). Предоставленные для анализа пробы шрота характеризовались высокой влажностью, что затрудняло проведение исследований. В связи с этим шрот корня солодки высушивали в сушильном шкафу BINDER ED-53 (Германия) при температуре 40 ºС до достижения влажности меньше 5%. Влажность растительного сырья определяли на анализаторе влажности “Ohaus MB-25”. Высушенные образцы шрота и корня измельчали ​​на мельнице FRITSCH (Cutting meal combination) и разделяли на фракции по размеру частиц с помощью виброситовой установки «Retsch AS 200» (Россия). В качестве рабочего стандартного образца использовали глицирам – монозамещенную аммониевую соль глицирризиновой кислоты (Monoammonium Glycyrrhizinatе working standard, Date of expiry: 2026-12-17, Lot number: 2024012401). Для хроматографического анализа использовали реактивы класса чистоты “для ВЭЖХ”: ацетонитрил (ВЭЖХ-градация), этанол (ВЭЖХ-градация), бидистиллированная вода (ВЭЖХ-градация). Уксусную кислоту (SIGMA-ALDRICH 99,8-100%) использовали в качестве добавки к подвижной фазе. Экстракцию биологически активных веществ из измельченного корня солодки и шрота проводили с использованием этанола различной концентрации (40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%) при варьируемом соотношении “сырье: экстрагент” (1:30, 1:50, 1:100). Процесс экстракции осуществляли методом нагревания с обратным холодильником в круглодонной колбе в течение 30-120 минут. Полученные экстракты фильтровали через сухой беззольный фильтр.

Количественное определение глицирризиновой кислоты во всех образцах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе “Hitachi UVR Chromaster” (Япония), оснащенной ультрафиолетовым детектором (5410 UV detector). Методику выполняли в соответствии с ОФС.1.2.1.2.0005 “Высокоэффективная жидкостная хроматография” [14]. Анализ проводили в изократическом режиме на обращенно-фазовой колонке в следующих условиях: стальная колонка ACE Excel 3 C18, 150x4,6 mm; подвижная фаза – ацетонитрил: 5% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 40:60 об./об., скорость потока – 1,000 мл/мин, объем ввода пробы – 20 мкл, температура колонки – 40°C. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 254 нм. Для управления системой, сбора и обработки данных использовали программное обеспечение ChromAssist Data Station.

Перед анализом все образцы и подвижная фаза фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0.45 мкм (нейлон или PTFE).

Содержание глицирризиновой кислоты (в %) вычисляли по формуле:

,

где  S – среднее значение площади пика глицирризиновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора;  – среднее значение площади пика глицирама вычисленное из хроматограмм стандартного раствораглицирама;  – объём извлечения, мл;  – объём вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;  – объём раствора ГСО глицирама, мл;  – объём вводимой пробы раствора ГСО глицирама, мкл; m – масса сырья, г;  – масса ГСО глицирама, г; W – влажность сырья, %; P – чистота стандартного образца глицирама, на долях единицы; 822 – молярная масса глицирризиновой кислоты; 839 – молярная масса глицирама.

Результаты и их обсуждение

При разработке методики ВЭЖХ в качестве подвижной фазы была выбрана система растворителей ацетонитрил – 5% водный раствор уксусной кислоты в соотношении 40:60. Для проверки пригодности хроматографической системы проводили пятикратное хроматографирование раствора экстракта корней солодки объёмом 5 мкл. Рассчитывали следующие показатели: эффективность колонки, разрешение между пиками, фактор асимметрии пика. Полученные значения соответствовали нормативным требованиям, изложенным в ОФС.1.2.1.2.0005 “Высокоэффективная жидкостная хроматография” [14].

На хроматограммах исследуемых образцов корней солодки время удерживания пика глицирризиновой кислоты совпадало с временем удерживания пика стандартного образца глицирама (4,95±0,007; 4,9604±0,074 мин соответственно) (рис. 2, 3), что подтверждает специфичность методики.

Рисунок 2. ВЭЖХ хроматограмма стандартного образца глицирама

Рисунок 3. ВЭЖХ хроматограмма  испытуемого раствора корня солодки

Зависимость площади пика глицирама от её концентрации в растворе была линейной в диапазоне концентрации от 30 мкг/мл до 298 мкг/мл коэффициентом детерминации R²=0,9995 (уравнение калибровочной прямой y=16158x+16676), что свидетельствует о высокой линейности калибровочной зависимости (рис. 4).

Были также определены следующие параметры валидации: пределы обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) составившие 0,21 и 0,64 мкг/мл соответственно; внутрисуточная (n=5) и межсуточная (n=3, 3 дня) прецизионность (RSD) для образца с содержанием ГК ~100мкг/мл не превышала 1,5% и 2,5%; правильность, оцененная методом “найденного-добавленного” (recovery) находилась, в диапазоне 98,5-101,2%. В пересчёте на абсолютно сухое сырьё (с учётом условий экстракции: соотношение 1:30) это соответствует LOD=6,6·10^-4% и LOQ=2,0·10^-3%. Полученные данные подтверждают пригодность методики для решение поставленных аналитических задач.

Рисунок 4. Калибровочный график зависимости площади пика глицирама от ее концентрации в растворе

В работе исследовали влияние основных факторов на выход Гк из корня солодки, таких как концентрация этанола в экстрагенте, степень измельчения сырья, соотношение массы сырья к объему экстрагента, время экстракции. Результаты представлены в таблице 1. Сравнительное изучение экстрагирующей способности этанола различной концентрации (40, 50, 60, 70, 80, 90%) показало, что максимальный выход глицирризиновой кислоты достигается при использовании 50% этанола. Согласно литературным данным, для экстракции ГК часто рекомендуются 40% этанол [12]. В нашем исследовании максимальный выход был достигнут при использовании 50% этанола. Это расхождение может быть связано с особенностями сырья (географическое происхождение) или методологией экстракции (в данной работе – нагревание с обратным холодильником, в литературном источнике [12] – ультразвуковая обработка). Полученный результат указывает на необходимость эмпирического подбора экстрагента для конкретного типа сырья и целевого продукта.

Таблица 1.

Оптимальные параметры экстрации глицирризиновой кислоты из корня солодки

Наилучшими параметрами экстракции были признаны: экстрагент – 50% этанол, время – 60 минут, степень измельчения сырья – менее 0,25 мм, соотношение сырья и экстрагента – 1:30. С использованием валидированной методики был проанализирован ряд образцов корня солодки и продуктов его переработки (табл. 2). Наибольшее содержание глицирризиновой кислоты было обнаружено в порошке неочищенном (техническом) ГК (24,83%), затем в густом (11,39%) и сухом (8,63%) экстрактах. В исходном сырье содержание составило 5,19%.

Таблица 2.

Содержание глицирризиновой кислоты в корне солодки и продуктах его переработки

(Примечание: Шрот 1 – отход после получения густого экстракта; Шрот 2 – отход после получения сухого экстракта; Шрот 3 – отход после получения технической глицирризиновой кислоты).

Рисунок 5. Сравнительные ВЭЖХ-хроматограммы содержания глицирризиновой кислоты в производственных остатках (шротах) корня солодки: 1 – шрот 1, 2 – шрот 2, 3 – шрот 3

Особый интерес представляют технологические отходы – шроты. Как показали результаты (рис. 5 и табл. 2), в шроте 1 (образующемся после получения густого экстракта методом экстракции горячей водой) сохраняется значительное количество глицирризиновой кислоты (3,43%). Это превышает минимально нормируемый уровень для лекарственного сырья в ведущих зарубежных фармакопеях (ЕС США Китай Япония), где содержание глицирризиновой кислоты стандартизировано на уровне 2–4% [1, 6, 9, 10]. Данный факт позволяет рассматривать шрот 1 не просто как производственный отход, а как потенциальное вторичное сырьё для дополнительного извлечения биологически активных соединений.

Выводы

1. Разработана и валидирована селективная и воспроизводимая методика количественного определения глицирризиновой кислоты методом обращённо-фазовой ВЭЖХ-УФ.
2. Установлено, что для экстракции Гк из изученного сырья оптимальными являются следующие параметры: экстрагент – 50% этанол, время – 60 мин, соотношение “сырьё: экстрагент” – 1:30, измельчения <0,25 мм.
3. Показано, что технологические отходы (шрот), особенно образующиеся после стадии получения густого экстракта, содержат значительное количество Гк (3,43%), превышающее минимальные фармакопейные требования. Это подтверждает целесообразность их вовлечения во вторичную переработку как источник ценных биологически активных соединений. 

Список литературы:

1. European Pharmacopoeia 7th edition: Liquorice root – Liquiritiae radix 01/2011: 0277.
2. ISO 11023:1999 (E) Liquorice extracts (Glycyrrhiza glabra L.) – Determination of glycyrrhizic acid content – Method using high-performance liquid chromatography
3. Karulkar A., Patadia Y. Development Of Novel TLC Method for Separation of Glycyrrhizic Acid from Aqueous Extract of Glycyrrhiza Glabra.// Int. J. of Pharm. Sci. // – 2025. – Vol. 3, Issue 3. – 2563-2570. DOI:10.5281/zenodo.15088873
4. Ke Ding, Yiyang Xu, Naijin Li, Haiyang Xu. Research on the Reuse of Licorice Residue // Highlights in Science, Engineering and Technology. MMTCS. 2022 Volume 14 (2022), 378-385 p.
5. Li F. et al. Review of constituents and biological activities of triterpene saponins from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and its solubilization characteristics //Molecules. – 2020. – Т. 25. – №. 17. – С. 3904.
6. Pharmacopoeia of the people’s republic of China. 2005. V. 1.P. 207–2009
7. Ramalingam M. et al. Phytochemical and pharmacological role of liquiritigenin and isoliquiritigenin from radix glycyrrhizae in human health and disease models //Frontiers in aging neuroscience. – 2018. – Т.10. – С. 348.
8. Ravi Kumar, Vijay Kumar Singh, Charan Singh, Sapna Birania, Nitin Kumar. Efficient extraction of glycyrrhizic acid from liquorice powder (Glycyrrhiza glabra L.) using microwave-assisted extraction. //Kumar et al./Environmental Engineering and Management Journal 24 (2025), 8, 1609-1617.  http://doi.org/10.30638/eemj.2025.126
9. The Japanese Pharmacopoeia, 14 th ed. Ministry of Health, Labour and Welfare, Tokyo, Japan Part 2. 2002. P. 932–933.
10. The United States Pharmacopeia, USP30 NF25. 2009. V. 2. Liquorice. P. 2263.
11. Белова О. А., Куркин В. А., Рязанова Т. К. Актуальные вопросы стандартизации корней солодки //Аспирантский вестник Поволжья. 2021. № 5–6. С. 30–35. DOI: https://doi.org/10.55531/2072-2354.2021.21.3.30-35
12. Бровченко Б. В., Ермакова В. А., Кузьменко А. Н., Самылина И. А., Краснюк И. И. Оптимизация ВЭЖХ-методики количественного определения глицирризиновой кислоты в корнях солодки. // Фарм. Журнал. – 2018. - №3 (24). – с. 162-165.
13. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том 4. M.:2018. 1470 с. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.femb.ru/femb/pharmacopea.php.
14. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.femb.ru/femb/pharmacopea.php.
15. Бердымухамедов Г. М. Лекарственные растения Туркменистана. I том.  – A.: TДНГ, 2009. – 331 с.
16. Жакипбеков К. С., Буйкыт А. Т., Аширов М. З., Сейтова Ж. Д. Разработка технологии получения экстракта из корня солодки (Radices Glycyrrhizae) и оценка его качества. //Актуальные вопросы науки и образования. – 2025. – МЦНС«НАУКА И ПРОСВЕЩЕНИЕ» - 232-237 с.
17. Каррыев М. О. Справочник лекарственных растений Туркменистана. – А.: Издательство “Энциклопедия”, 1992. – 86 с.
18. Литвиненко В. И., Бойко М. М., Попова Н. В. Анализ биологически активных веществ солодки голой. // Фитотерапия – 2019. – №4. – C. 33-38.
19. Оленников Д. Н., Зилфикаров И. Н., Vennos C. Применение микроколоночной ВЭЖХ-УФ для анализа Glycyrrhiza uralensis и препаратов солодки // Химико-фармацевтический журнал. – 2018. – Т. 52, № 12.С. 24–29. DOI: 10.30906/0023-1134-2018-52-12-24-29
20. Павлова Л.В., Платонов И.А., Куркин В.А. и др. Определение глицирризиновой кислоты в корнях солодки методом ВЭЖХ с субкритической экстракцией //Аналитика и контроль. 2018. Т. 22, № 3. С. 229. DOI: 10.15826/analitika.2018.22.3.004
21. Халед Ш. М. Состав и свойства биологически активных веществ шрота Glycyrrhizae radices. Автореф. дисс. канд. фарм. наук: 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Казань, 2017; 20 с.