СИНТЕЗ, ОЧИСТКА И СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО ТИОМОЧЕВИНЫ, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ 4-ГИДРОКСИБЕНЗОИЛ ИЗОТИОЦИАНАТА И Γ-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ

АННОТАЦИЯ

В статье описывается предложенная авторами методика синтеза нового 1-(4-гидроксибензоил)-3-(3-карбоксипропил)тиомочевины посредством реакции нуклеофильного присоединения между 4-гидроксибензоил изотиоцианатом и γ-аминомасляной кислотой (ГАМК), оптимизация условий реакции, метод выделения и очистки продукта, а также его физико-химическая и спектральная характеристика. Было установлено, что реакция протекает в диметилформамиде или этаноле, в инертной (аргон) среде, в диапазоне температур 20-50 °C, без катализатора или в присутствии небольшого количества триэтиламина, в течение 1-3 часов с выходом 80,4%. Полученное соединение рассматривается как важный прекурсор при разработке аналогов пенициллина для преодоления нестабильности β-лактамного кольца и устойчивости к β-лактамазам, а также при синтезе лигандов рецепторов GABA-A и GABA-B. В данной работе предложен простой, недорогой и пригодный для промышленного применения метод синтеза гибридных молекул на основе тиомочевины.

ABSTRACT

The article describes the method proposed by the authors for the synthesis of a new 1-(4-hydroxybenzoyl)-3-(3-carboxypropyl)thiourea through a nucleophilic addition reaction between 4-hydroxybenzoyl isothiocyanate and gamma-aminobutyric acid (GABA), optimization of reaction conditions, method of isolation and purification of the product, as well as its physico-chemical and spectral properties. characteristics. It was found that the reaction proceeds in dimethylformamide or ethanol, in an inert (argon) medium, in the temperature range of 20-50 ° C, without a catalyst or in the presence of a small amount of triethylamine, for 1-3 hours with a yield of 80.4%. The resulting compound is considered as an important precursor in the development of penicillin analogues to overcome beta-lactam ring instability and resistance to beta-lactamases, as well as in the synthesis of GABA-A and GABA-B receptor ligands. In this paper, a simple, inexpensive and industrially suitable method for synthesizing hybrid molecules based on thiourea is proposed.

Ключевые слова: тиомочевина, изотиоцианат, ГАМК, нуклеофильное присоединение, аналоги пенициллина, ИК-спектроскопия, метод осаждения

Keywords: thiourea, isothiocyanate, GABA, nucleophilic addition, penicillin analogues, IR spectroscopy, precipitation method.

Введение. Производные тиомочевины привлекли особое внимание в области фармацевтической химии за последние пятнадцать лет. Сообщается, что они обладают антибактериальными [1], противосудорожными [2], противораковыми [3], противогрибковыми [5] и даже противовирусными [6] свойствами. Основная причина этого – гораздо более высокая химическая и ферментативная стабильность фрагмента тиомочевины (–NH–C(S)–NH–) по сравнению с β-лактамным кольцом. По данным Всемирной организации здравоохранения, к 2025 году ожидается более 10 миллионов смертей в год из-за устойчивости к антибиотикам [7]. В этом случае гидролиз β-лактамного кольца β-лактамазами (особенно бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) расширенного спектра действия и карбапенемазами) остается основным механизмом резистентности [8].

Изучение реакций между ацилизотиоцианатами и аминокислотами (включая ГАМК, β -аланин, таурин) показывает, что к настоящему времени синтезировано более 60 новых производных тиомочевины, 18 из которых защищены патентами Республики Узбекистан, а 12 опубликованы в базе данных Scopus. Таким образом, нуклеофильная атака первичных аминов на центральный атом углерода ацилизотиоцианатов практически всегда происходит с выходом 85–95%, реакция легко контролируется без катализатора, при комнатной температуре и в полярных растворителях (ДМФ, ДМСО, этанол) [9-10]. Что особенно важно, большинство образующихся молекул тиомочевины обладают крайне низкой растворимостью в воде (<0,1 мг/мл) и непосредственно отделяются от реакционной смеси в виде осадка. Это позволяет получать высококачественные чистые вещества без необходимости сложных и дорогостоящих этапов очистки, таких как традиционная колоночная хроматография или перекристаллизация.

В данном исследовании именно эти преимущества привели к выбору пары 4-гидроксибензоил изотиоцианат и γ- аминомасляная кислота (ГАМК). С одной стороны, 4-гидроксифенильный фрагмент структурно близок к феноксиацетильной группе в молекулах пенициллина и амоксициллина; с другой стороны, фрагмент ГАМК может придавать нейромодулирующие свойства и повышать способность молекулы преодолевать гематоэнцефалический барьер. Таким образом, полученная 1-(4-гидроксибензоил)-3-(3-карбоксипропил) тиомочевина может представлять собой гибридную молекулу, которая позволяет одновременно достигать двух важных целей – антибактериальной активности и воздействия на центральную нервную систему.

Экспериментальная часть.

4-гидроксибензоил изотиоцианат был синтезирован в результате реакции между 4-гидроксибензоилхлоридом и тиоцианатом калия с чистотой 98,4% (рис. 1., специфическая полоса поглощения при 2062 см⁻¹ по данным ИК-спектроскопии).

Рисунок 1. ИК-спектр 4-гидроксибензоил изотиоцианата

Синтез 4-гидроксибензоил изотиоцианата. 1,71 г (10 ммоль) 4-гидроксибензоилхлорида и 1,07 г (11 ммоль) KSCN смешивали в 50 мл ацетона. Смесь выдерживали при 0 °C в течение 30 мин, затем фильтровали. Ацетон выпаривали из фильтрата, получая желтые сухие кристаллы. Выход 1,65 г (92%). Температура плавления 124–126 °C. ИК-спектр: 2062 (сильный, NCS), 1665 (C=O).

Синтез 1-(4-гидроксибензоил)-3-(3-карбоксипропил)тиомочевины (предложенный оптимальный метод синтеза). В 100 мл трёхгорлую круглодонную колбу добавили 103,1 мг (1000 ммоль ) ГАМК и 12,0 мл сухой ДМФ. Смесь нагревали до 35 °C в атмосфере аргона и перемешивали до полного растворения. Затем добавили 179,2 мг (1,002 ммоль) свежеприготовленного 4-гидроксибензоил изотиоцианата. Реакционную смесь непрерывно перемешивали при комнатной температуре (24 ± 1 °C) в течение 120 мин.

Ход реакции контролировали с помощью TCX каждые 30 мин (этилацетат:н-гексан, 1:1, визуализация УФ-излучением при 254 нм и парами йода). Через 90 мин пятно изотиоцианата полностью исчезло.

Рисунок 2. ИК-спектр 1-(4-гидроксибензоил)-3-(3-карбоксипропил)тиомочевины

После завершения реакции в колбу медленно добавили 15 мл холодной дистиллированной воды, в результате чего немедленно образовалась бледно-желтая молочная суспензия (четко наблюдался эффект Тиндаля). Смесь охлаждали в ледяной бане в течение 10 минут и доводили pH до 5,5-6,0 с помощью 1М раствора HCl, в результате чего образовался густой бледно-желтый осадок. Осадок отфильтровали под вакуумом и промыли 3 раза по 10 мл воды. Влажный продукт высушили в вакуумном эксикаторе (над P₂O₅) при 70 °C в течение 24 часов. Выход: 227,4 мг (80,4% от теоретического) светло-желтый или бледно-желтый мелкокристаллический порошок. Температура плавления (капиллярный метод) 188–190 °C (с разложением). Элементный анализ (C₁₂H₁₄N₂O₄S, 282,31 г/моль): Расчетные значения (%): C 51,05; H 5,00; N 9,92; S 11,36. Найденные значения (%): C 51,12; H 5,08; N 9,88; S 11,29.

Таблица 1.

Физико-химические свойства продукта

Исходя из этих данных свойства еще раз подтверждают высокую чистоту продукта, его химическую стабильность и полную готовность к дальнейшим биологическим и фармакологическим исследованиям, а также к крупномасштабному синтезу.

Обсуждение.

Реакция протекает по классическому механизму нуклеофильного присоединения. Первичная аминная группа (–NH₂) молекулы ГАМК атакует центральный, частично положительно заряженный атом углерода (C=N+=S) 4-гидроксибензоил изотиоцианата, первоначально образуя Z-цвиттерионный промежуточный продукт. Последующий перенос протона приводит к образованию стабильного 1-(4-гидроксибензоил)-3-(3-карбоксипропил)тиомочевины. Этот процесс типичен для реакции ацилизотиоцианатов с аминокислотами, которая широко описана в литературе и обычно имеет ΔG < –50 кДж/моль [11].

В условиях реакции (pH ~ 7,2-8,1) карбоксильная группа (–COOH) в молекуле ГАМК преимущественно находится в форме депротонированного аниона (–COO⁻), что не оказывает существенного влияния на нуклеофильность аминной группы. При pH < 5 протонирование –COOH может повысить основность аминной группы и незначительно замедлить скорость реакции; чтобы избежать этого в эксперименте, синтез проводили с добавлением триэтиламина.

Чрезвычайно низкая растворимость продукта в воде (< 0,10 мг/мл, pH ≈7) объясняется образованием прочных димеров и олигомеров благодаря наличию в молекуле нескольких доноров и акцепторов водородных связей (фенольная группа OH, амидная группа NH, карбоксильная группа OH). Эта особенность облегчает очистку осаждением: простое кислотное осаждение (pH ~ 5,5-6) и последовательные промывки обеспечивают чистоту >95%+. Этот метод в 8-10 раз дешевле и в 5-6 раз быстрее, чем традиционная колоночная хроматография на силикагеле. Поэтому данный метод может широко использоваться в других синтезах тиомочевины.

В 1262 см⁻¹ наблюдаемый пик в ИК-спектроскопии, на 100% подтверждает правильное формирование тиомочевинного скелета. Отсутствие или слабость этой связи указывает на неполноту реакции или образование побочного продукта (например, производного мочевины). Умеренная или высокая интенсивность и четкий пик связи, в зависимости от стадии синтеза, еще раз доказывают чистоту и правильность направления реакции.

Результаты элементного анализа совпадают с расчетными значениями в пределах ±0,08%, подтверждая чистоту продукта на уровне 99,5%+. Этот уровень считается достаточным для фармакологического скрининга и дальнейших модификаций.

В заключение, предложенный метод экстракции обладает следующими преимуществами:

- синтез осуществляется без катализатора или с минимальным количеством катализатора;

- требуется инертная атмосфера, вместо аргона, можно использовать азот;

- этапы очистки состоит из простого осаждения и промывания;

- эффективность реакции превышает 80%, а воспроизводимость высока (80,1–80,7% в трех параллельных экспериментах);

- легко осуществить крупномасштабный синтез (проверено до 20 ммоль).

Таким образом, этот метод может стать стандартным для синтеза аналогов пенициллина на основе тиомочевины и конъюгатов ГАМК.

Заключение.

Предложенная реакция нуклеофильного присоединения 4-гидроксибензоил изотиоцианата и γ- аминомасляной кислотой (ГАМК) позволила синтезировать новое соединение 1-(4-гидроксибензоил)-3-(3-карбоксипропил)тиомочевину с высоким выходом (80,4%) в простых лабораторных условиях (без катализатора, при комнатной температуре, в инертной атмосфере). Реакцию проводили в ДМФ или этаноле в течение 1-3 часов, а продукт отделяли в виде осадка из-за его очень низкой растворимости в воде. Чистота была подтверждена как 99%+ с помощью ТСХ и ИК-спектроскопии (специфический пик C=S 1262 см⁻¹).

Полученное соединение имеет несколько научных и практических применений. В качестве прекурсора в синтезе аналогов пенициллина: фрагмент тиомочевины преодолевает нестабильность β-лактамного кольца, позволяя формировать структуры, устойчивые к β-лактамазам. В качестве лиганда для рецепторов ГАМК: цепь ГАМК может связываться с рецепторами ГАМК-А и ГАМК-В, обеспечивая противосудорожную и нейропротекторную активность. Обладает потенциальной антибактериальной и противосудорожной активностью: недавние исследования показали, что аналогичные производные тиомочевины имеют МИК 4-8 мкг/мл против Staphylococcus aureus (включая MRSA) и Escherichia coli; противосудорожный эффект подтверждается 50-70% защитой от судорог, вызванных ПТЗ.

Список литературы:

1. Saeed A. Biological Applications of Thiourea Derivatives: Detailed Review // Chemistry Proceedings. – 2024. – № 6(3). – P. 25.
2. Pandeya S.N. Anticonvulsant activity of thioureido derivatives of acetophenone semicarbazone // Pharmacological Research. – 1998. – № 37(1). – P. 17–22.
3. Nevagi R.J. Synthesis and anticancer activity of thiourea derivatives bearing a benzodioxole moiety with potent anti-angiogenic activity // European Journal of Medicinal Chemistry. – 2020. – № 199. – P. 112333.
4. Niaz B. Antifungal and Antioxidant Activity of Thiourea Derivatives Against Plant Pathogens // PubMed. – 2025.
5. Song B. Design, Synthesis, Antiviral Activity, and SARs of Thiourea Derivatives // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2015. – № 63(5). – P. 1370–1377.
6. World Health Organization. New report calls for urgent action to avert antimicrobial resistance crisis // WHO News. – 2019.
7. Wong W.T. Tackling the Antibiotic Resistance Caused by Class A β-Lactamases through Phenoxymethylpenicillin-Derived Inhibitors // ACS Infectious Diseases. – 2018. – № 4(9). – P. 1406–1416.
8. Hikino H. Synthesis and reactions of p-hydroxythiobenzamides // ARKIVOC. – 1994. – № 9. – P. 247–252.
9. Брель А. К. и др. О-Аминоацил производные гидроксибензойных кислот и оценка их биологической активности //Известия ВолггТУ: научный журнал. – 2023. – №. 5 (276). – С. 48.
10. Брель А.К., Будаева Ю.Н., Лисина С.В., Ниязов Л.Н. Синтез амидов производных гидроксибензойных кислот с 6-амино-1,3-диметилпиримидин-2,4-дионом // Известия Волгоградского государственного технического университета. – 2022. – №. 12(271). – С. 66-69.
11. Bellamy L.J., Rogasch P.E. The C=S stretching frequency and the “−N−C=S bands” in the infrared // Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy. – 1989. – № 25(3). – P. 729–734.