ПОТЕНЦИАЛ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ БАЦИЛЛ УЗБЕКИСТАНА И БЕЛАРУСИ ДЛЯ БИОКОНТРОЛЯ ФИТОПАТОГЕНОВ

АННОТАЦИЯ

Повышение засоления орошаемых земель усиливает научный интерес к галотолерантным представителям Bacillaceae как к агентам биорекультивации и биоконтроля. В работе исследованы 17 штаммов Bacillus, Alkalihalobacillus и Virgibacillus, выделенных из засолённых экотопов Узбекистана и Беларуси, для оценки их РНКазной и антимикробной активности. Восемь штаммов проявили способность к гидролизу РНК, наиболее высокая активность отмечена у B. licheniformis BHa 02-R из семян саксаула черного. Пять штаммов продемонстрировали антагонизм к фитопатогенам: в отношении Pseudomonas syringae зоны задержки роста составили 16–30 мм, при этом максимальную антибактериальную активность проявил B. marisflavi Bhs-3 (30 мм). Антифунгальная активность против Fusarium oxysporum варьировала от 16 до 23 мм, а наиболее выраженное подавление показал B. licheniformis Bhs-25 (23 мм). Результаты подтверждают потенциал галотолерантных бацилл как основы адаптированных биопрепаратов двойного действия — повышения солеустойчивости растений и подавления патогенов.

ABSTRACT

Increasing salinization of irrigated lands has intensified interest in halotolerant Bacillaceae as agents of both bioremediation and biocontrol. In this study, 17 strains of Bacillus, Alkalihalobacillus, and Virgibacillus isolated from saline ecosystems of Uzbekistan and Belarus were examined for their RNase and antimicrobial activities. Eight strains demonstrated RNA-hydrolyzing ability, with the highest activity observed in B. licheniformis BHa 02-R isolated from black saxaul seeds. Five strains showed antagonism against phytopathogens: inhibition zones against Pseudomonas syringae ranged from 16 to 30 mm, with B. marisflavi Bhs-3 exhibiting the strongest antibacterial effect (30 mm). Antifungal activity against Fusarium oxysporum varied from 16 to 23 mm, and B. licheniformis Bhs-25 produced the highest inhibition (23 mm). These results highlight the potential of halotolerant Bacilli as a basis for adapted dual-action biopreparations that enhance plant salt tolerance and suppress pathogens.

Ключевые слова: галотолерантные бактерии, семейство Bacillaceae, РНКазная активность, антимикробная активность.

Keywords: halotolerant bacteria, Bacillaceae family, RNase activity, antimicrobial activity.

Введение

Глобальное увеличение засоления орошаемых земель усиливает научный интерес к галотолерантным бактериям как к агентам одновременной биорекультивации почв и биоконтроля фитопатогенов. Штаммы Bacillus и близких Firmicutes стимулируют рост растений при солевом стрессе и подавляют фитопатогены за счёт продукции антимикробных метаболитов и активации защитных реакций растения [10]. Поэтому локальные биопрепараты на основе бацилл, адаптированных к стрессовым условиям, могут стать альтернативной вспомогательной технологией для борьбы с фитопатогенами в условиях засоления почв.

В Узбекистане галотолерантные бактерии широко распространены в засолённых экотопах Приаралья, где выявлено разнообразие устойчивых к соли ризосферных микроорганизмов галофитов [2]. Бактерии из ризосферы Salicornia демонстрируют устойчивость к высоким концентрациям NaCl и колонизацию корней [1], а эндофиты семян солеустойчивых растений проявляют ферментативную активность и сохраняют рост при концентрации соли до 10 %, что делает их перспективными агентами биоконтроля [7]. В солончаковых почвах обнаружены протеазопродуцирующие штаммы B. licheniformis, потенциал которых связывают с разрушением структурных компонентов клеточных стенок грибов [3].

В Беларуси накоплен опыт применения Bacillus-содержащих биопрепаратов против болезней картофеля и овощей [4; 9]. Например, препарат «Бетапротектин» на основе B. velezensis BIM В-439 D снижает корневые гнили в защищённом грунте и повышает продуктивность, что демонстрирует стабильность бацилл при колебаниях факторов среды [15].

В последние годы было обнаружено, что галотолеранные Bacillus обладают и противовирусной активностью: штаммы B. velezensis, B. subtilis и B. licheniformis снижают накопление CMV, ToMV и PVY и повышают устойчивость растений при солевом стрессе [13; 19].

Таким образом, галотолерантные бациллы засолённых экосистем Узбекистана и Беларуси могут стать основой для разработки адаптированных биопрепаратов, направленных на повышение солеустойчивости и фитосанитарной стабильности агросистем двух регионов.

Основной целью работы явилось изучение способности к биоконтролю патогенов микробной и вирусной природы бактерий семейства Bacillaceae, ранее выделенных из засоленных природных объектов Узбекистана и Беларуси.

Экспериментальная часть

Объект исследования:

В работе исследовано 17 штаммов Bacillus и близких родов Alkalihalobacillus и Virgibacillus, выделенных из семян солеустойчивых и засухоустойчивых растений Приаралья саксаула черного, черкеза, кандыма, терескена серого, изеня и кандыми, из образцов почв Приаралья, а также из грунта вблизи соляных отвалов ПО «Беларуськалий» (Беларусь).

Выделение, изучение солеустойчивости и идентификация изолятов проведены в предыдущей работе авторов данной статьи [14].

Определение РНКазной активности

РНКазную активность определяли чашечным методом [11]. В чашки Петри вносили по 20 мл агаризованного питательного бульона с РНК, растворенном в 0,1 М РО₄ буфере (pH 8,0). После застывания агара стерильной петлей точечно наносили бактериальную культуру на поверхность среды. Инкубировали при 28^оС в течение 3 суток, затем заливали 60 % раствором HClO₄, оставляя на 5 минут. Результаты интерпретировали по наличию зон просветления вокруг колоний бактерий.

Определение антимикробной активности

Антимикробную активность штаммов бактерий определяли методом лунок [6]. Чашки Петри с 20 мл агаризованной среды с бульоном Хоттингера (массовая доля агара 2 %) заливали 4 мл среды Хоттингера (массовая доля агара 1,2 %), смешанной с 1 мл тест-культуры и оставляли для застывания. Затем в агаре с помощью стерильного пробочного сверла вырезали диски диаметром 10 мм на каждой чашке Петри, получая симметрично расположенные лунки. Затем в каждую из полученных лунок вносили по 0,1 мл жидкой двухсуточной культуры исследуемых бактерий. Их культивировали в зависимости от тест-культуры: Fusarium oxysporum БИМ F-346 при температуре 24 ^оС в течение 2 суток, и бактерии Pseudomonas syringae БИМ В-268 при температуре 28 ^оС в течение 1 суток. Результаты учитывали по диаметру зоны задержки роста тест-объекта.

Результаты и обсуждение

Нарушение физиологических процессов, вызванное солевым стрессом, снижает устойчивость растений к фитопатогенам, повышая их восприимчивость к инфекциям. В этой связи представляется актуальным поиск солеустойчивых микроорганизмов, обладающих выраженной антимикробной и противовирусной активностью. Согласно ряду исследований, бактерии рода Bacillus демонстрируют высокую антагонистическую активность в отношении фитопатогенов [5; 16] и широко рассматриваются как основа для разработки микробных биоудобрений [4]. Таким образом, поиск солеустойчивых представителей семейства Bacillaceae, способных подавлять патогены микробной и вирусной природы, может являться перспективным направлением биоконтроля фитозаболеваний в условиях засоления.

В данной работе авторами статьи изучена РНКазная и антимикробная активность выделенных ранее 17 галотолерантных штаммов (таблица 1). 

Как показано результатом исследования, из семнадцати культур восемь обладали способностью к расщеплению РНК, которая рассматривается авторами как один из маркеров потенциального противовирусного действия. РНКазная активность отмечена для эндофитов из саксаула BHa 01-R и BHa 02-R, из черкеза BSr 18-R, а также для почвенных бактерий Bhs-3/1, Bhs-3/t, Bhs-3, Bhs-25 и AS018. Три культуры бактерий проявляли умеренную активность, тогда как эндофит из саксаула B. licheniformis BHa 02-R оказался самым активным в отношении гидролиза РНК (таблица 1).

Следует отметить, что литературных сведений о солеустойчивых бактериях-продуцентах РНКазы не было обнаружено, хотя известно, что данная характеристика оценивается при поиске микроорганизмов с противовирусной активностью для разработки препаратов против возбудителей вирусных заболеваний растений [8]. Так, в исследованиях Бурхановой с соавторами [8] и Шариповой с коллегами [18] изучена РНКазная активность бактерий рода Bacillus и ее ингибирующий эффект на развитие различных фитопатогенных вирусов [8; 18]. Авторы статьи полагают, что изучение РНКазной активности галотолерантных бактерий семейства Bacillaceae является относительно новым направлением исследований и позволяет рассматривать данную группу микроорганизмов как потенциальный объект для разработки препаратов биозащиты растений от фитопатогенов вирусной природы.

Таблица 1.

РНКазная активность бактериальных культур

- - активность отсутствует, + - слабая активность, ++ - умеренная активность, +++ - высокая активность

При изучении антимикробной активности установлено, что из 17 лишь 5 бацилл из образцов Беларуси (Bhs-3, Bhs-20, Bhs-25, Bhs-K3/1 и Bhs-K3/t) обладают умеренным или высоким антимикробных действием в отношении двух патогенов растений: Fusarium oxysporum БИМ F-346 и Pseudomonas syringae БИМ В-268 (таблица 2). Изучаемые бактерии способны к ингибированию тест-культуры Ps. syringae БИМ В-268, образуя зону задержки роста 16–30 мм. Наилучшей антибактериальной активностью характеризовался штамм B. marisflavi Bhs-3, образуя зону подавления роста 30 мм. Все штаммы, за исключением B. marisflavi Bhs-3 и B. marisflavi Bhs-20, обладают антифунгальным действием в отношении F. oxysporum БИМ F-346 с зонами задержки роста 16–23 мм. Наиболее высокую активность проявил штамм B. licheniformis Bhs-25, задерживая рост патогена на 23 мм.

Таблица 2.

Антимикробная активность бактериальных культур

К+ - положительный контроль, К- - отрицательный контроль

Полученные данные согласуются с ранее опубликованными результатами, где галотолерантные Bacillus демонстрировали выраженный антагонизм к бактериальным и грибным фитопатогенам в условиях солевого стресса [12; 17]. При этом, выделенные штаммы характеризовались одновременно PGP-свойствами, подобными нашим изолятам. Поэтому галотолерантные PGPB часто рассматриваются как агенты «двойного назначения», совмещающие повышение солеустойчивости растений и функции биоконтроля.

Заключение

Исследование показало, что галотолерантные бациллы, выделенные из природных источников Узбекистана и Беларуси, обладают выраженной РНКазной и антимикробной активностью, что делает их перспективными кандидатами для биоконтроля в условиях засоления. Полученные данные подчёркивают значимость местных солеустойчивых штаммов как источника новых биоконтролирующих организмов, обладающих устойчивостью к солевому стрессу и способностью подавлять фитопатогены микробной и вирусной природы.

Список литературы:

1. Бегматов Ш., Селицкая О., Васильева Л., Берестовская Ю., Манучарова Н., Дренова Н. Морфофизиологические особенности некоторых культивируемых бактерий засоленных почв Приаралья // Почвоведение. — 2020. — С. 81–88.
2. Жураева Р.Н. Галотолерантные бактерии в засоленных экотопах Узбекистана // Узбекский биологический журнал. — 2010. — Спец. вып. — С. 65–69.
3. Ишанходжаев Т.М., Рахмонов Р.А., Холиков А.Ф., Муртозоев А.К., Саъдуллаев Ш.Т., Пулатова О.М., Алимова Б.Х., Махсумханов А. Скрининг продуцентов протеаз рода Bacillus при различных условиях культивирования // International Scientific Journal Science and Innovation. — 2023. — С. 1499–1504.
4. Коломиец Э., Сверчкова Н., Мандрик-Литвинкович М. Экологически безопасные биотехнологии для сельского хозяйства // Наука и инновации. — 2019. — № 3(193).
5. Кузьмина Л.Ю., Архипова Т.Н., Актуганов Г.Э., Галимзянова Н.Ф., Четвериков С.П., Мелентьев А.И. Бактерии родов Advenella, Bacillus и Pseudomonas – перспективная основа биопрепаратов для растениеводства // Биомика. — 2018. — Т. 10. — № 1. — С. 16–19.
6. Сеги Й. Методы почвенной микробиологии. — М.: Колос, 1983. — 296 с.
7. Суярова Р.А., Кондрашева К.В., Новицкий З.Б., Гулямова Т.Г. Галотолерантность и ферментативная активность эндофитов из семян солеустойчивых растений // Universum: химия и биология. — 2023. — № 12-1(114).
8. Burkhanova G., Sorokan’ A., Cherepanova E., Sarvarova E., Khairullin R., Maksimov I. Endophytic Bacillus bacteria with RNase activity in the resistance of potato plants to viruses // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. — 2019. — Vol. 23.
9. Busko I.I., Kolomiets E.I., Ananyeva I.N., Molchan O.V. Bactosol biopreparation efficiency in control of potato diseases during vegetation period // Potato Growing. — 2013. — Vol. 21. — № 1. — P. 220–227.
10. Fira D., Dimkić I., Berić T., Lozo J., Stanković S. Biological control of plant pathogens by Bacillus species // Journal of Biotechnology. — 2018. — Vol. 285. — P. 44–55.
11. Hole R.C., Singhal R.S., Melo J.S., D'Souza S.F. A rapid plate screening technique for extracellular ribonuclease producing strains // BARC Newsletter. — 2004. — Iss. 249. — P. 91–97.
12. Iqbal S., Qasim M., Rahman H., Khan N., Zafar R., Bhatti M., Javed A., Janjua H. Genome mining, antimicrobial and plant growth-promoting potentials of halotolerant Bacillus paralicheniformis ES-1 isolated from salt mine // Molecular Genetics and Genomics. — 2022. — Vol. 298. — P. 1–14.
13. Khezri M., Habibi P., Koohi-Habibi M., Rahimian H., Farzadfar S. Effect of Bacillus subtilis on potato virus Y (PVY) disease: soil application induces systemic resistance and reduces virus accumulation // European Journal of Plant Pathology. — 2023. — P. 1–12.
14. Kondrasheva K., Suyarova R., Levchenko D., Mandryk-Litvinkovich M., Kuptsov V., Gulyamova T., Kalamiyets E. Biotechnological potential of Bacillaceae inhabiting halophytes and salty soils of Uzbekistan and Belarus // Acta Microbiologica Bulgarica. — 2025. — Vol. 41. — № 3. — P. 415–422.
15. Mandryk-Litvinkovich M.N., Sviridov A.V., Kuptsov V.N., Shinkorenko E.G., Ostapchik V.V. et al. Bacteria Bacillus velezensis BIM B-439D as the basis of biopreparation “Betaprotectin” to control root rots of cucumber // Agri Research & Technology: Open Access Journal. — 2023. — Vol. 27. — № 3. — P. 556370.
16. Petrillo C., Castaldi S., Lanzilli M., Selci M., Cordone A. et al. Genomic and physiological characterization of new plant growth promoting Bacilli isolated from salt-pans // Frontiers in Microbiology. — 2021. — Vol. 12.
17. Rafanomezantsoa P., El Hasan A., Voegele R. T. Potential of Bacillus halotolerans in mitigating biotic and abiotic stresses: a comprehensive review // Stresses. — 2025. — Vol. 5. — No. 2. — P. 24.
18. Sharipova M., Rockstroh A., Balaban N., Mardanova A., Toymentseva A. et al. Antiviral effect of ribonuclease from Bacillus pumilus against phytopathogenic RNA-viruses // Agricultural Sciences. — 2015. — Vol. 6. —P. 1357–1366.
19. Xu C., Zhang Y., Lin M., Chen Z., Shen Q. Bacillus velezensis HN-2: a potent antiviral agent against pepper veinal mottle virus // Frontiers in Plant Science. — 2024. — Vol. 15. — Art. 1403202.