ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ГЕМОСОРБЕНТ НА ОСНОВЕ ФИБРОИНА ШЕЛКА И ЕГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

АННОТАЦИЯ

В данной статье представлены результаты создания и изучения медико-биологических свойств волокнистого полифункционального гемосорбента, полученного из гидролизованного фиброина шелка. Гидролизованный фиброин был получен путем гидротермального гидролиза фиброина шелка при высокой температуре и давлении в среде чистой воды. Полученный гидролизованный фиброин был дополнительно подвергали ультразвуковому диспергированию и сверхвысокочастотному облучению для повышения его сорбционных свойств. Были проведены комплексные медико-биологические испытания гемосорбента для оценки острой и хронической токсичности, цитотоксичности, а также адсорбционной и абсорбционной способности. Также были проведены гистоморфологические исследования для изучения структуры и функциональности гемосорбента. Результаты показали, что созданный гемосорбент имеет значительный потенциал для медицинского применения благодаря своей биосовместимости и эффективным адсорбционным свойствам.

ABSTRACT

This article presents the results of the development and investigation of the medico-biological properties of a fibrous multifunctional hemosorbent obtained from hydrolyzed silk fibroin. The hydrolyzed fibroin was produced by hydrothermal hydrolysis of silk fibroin at high temperature and pressure in a pure water medium. The resulting hydrolyzed fibroin was additionally subjected to ultrasonic dispersion and ultra-high-frequency irradiation to enhance its sorption properties. Comprehensive medico-biological tests of the hemosorbent were carried out to evaluate acute and chronic toxicity, cytotoxicity, as well as its adsorption and absorption capacities. Histomorphological studies were also performed to examine the structure and functionality of the hemosorbent. The results demonstrated that the developed hemosorbent has significant potential for medical applications due to its biocompatibility and effective adsorption properties.

Ключевые слова: гидролизованный фиброин шелка, волокнистый гемосорбент, гидротермальный гидролиз, ультразвуковая дисперсия, адсорбционная способность, цитотоксичность, биосовместимость, гемоперфузия, медицинское применение

Keywords: Hydrolyzed silk fibroin, Fibrous hemosorbent, Hydrothermal hydrolysis, Ultrasonic dispersion, Adsorption capacity, Cytotoxicity, Biocompatibility, Hemoperfusion, Medical application

Введение

Гемосорбция – это метод удаления токсичных веществ средней молекулярной массы из организма путем перфузии крови через колонку с селективным или неселективным сорбентом. При непосредственном контакте с кровью сорбент, адсорбирует и поглощает токсичные вещества, затем очищенная кровь обратно возвращается в кровоток пациента. Гемосорбенты – предназначены для удаления из крови токсинов, которые связаны с альбуминами плазмы крови, а также белковыми токсинами и другими токсичными веществами из крови [1, 2].

Селективные сорбенты могут избирательно сорбировать токсичные вещества. В целях целенаправленного воздействия на лечебную функцию гемосорбентов можно изменить их пористую структуру и химию поверхности. Поскольку детоксикация организма, связанная с загрязнением окружающей среды и других факторов, имеет решающее значение, требует создание гемосорбентов для защиты внутренней среды человека посредством гемосорбции [3, 4].

Основным недостатком метода лечения с использованием известного угольного гемосорбента ВНИИТУ-1 является его низкая адсорбционная активность по отношению к азотсодержащим токсичным веществам, накапливающимся в организме при различных заболеваниях, в частности, к билирубину. Все известные угольные гемосорбенты неспецифичны и плохо адсорбируют белковые вещества и токсичные продукты [5].

Цель исследования – создание и изучение медико-биологических свойств волокнистого полифункционального гемосорбента, полученного гидролизом фиброина натурального шелка при высокой температуре и давлении в водной среде и его модификации под воздействием физических факторов как сверхвысокочастотное (СВЧ) облучение.

Экспериментальный часть. В качестве объектов исследований были выбраны шелковые нити, некондиционные коконы шелкопряда Bombyx mori и волокнистые отходы переработки шелка. Основные используемые реактивы были приобретены у фирмы Sigma Aldrich: Cпирт этиловый (96.0%, кат. № 1.59010), ацетон (кат. № 650501, 99.9%), хлороформ (кат. № 650498, 99.9%), тетрахлор метан (кат. № 270652, 99.9%). Для получения дистиллированной воды использовали дистилляторе DZ-10L11 (Китай).

Метод [6] использовался для очистки волокнистых отходов шелка от органических и неорганических примесей. Для очистки волокнистых отходов шелка использовали последовательную обработку четырех хлористым углеродом и хлороформом трехкратно в течение 1 часа при температуре 60 °С. Далее использовалась смесь этанола и дистиллированной воды в соотношении 70:30 (об%) для трехкратного удаления минеральных примесей из волокнистых отходов шелка в течение 2 часа при температуре 60 °С.

Волокна шелка, очищенные от жиро-восковых примесей, обрабатывали при модуле 1:10 дистиллированной водой в автоклаве в плотно закрытом состоянии в течение 24 часов при давлении 0.143 МПа. После гидротермального гидролиза гидролизованный фиброин диспергируется с помощью ультразвука в течение 5 минут и затем гидролизуется при СВЧ-облучении в течение 10 минут мощностью 800 Вт для улучшения сорбционной способности. Приобретенный гидролизованный гемосорбент фильтруют через сито с размером пор 70 мкм, промывают водой и высушивают в сушильном шкафу в течение 90 минут при температуре 95–100 °С [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе известно [8-10] что шелковые волокна Bombyx mori, состоят из нерастворимого в воде фиброина 70–67%, водорастворимого серицина 25–30%, 0.5–1% жиро-восковых; 0.5–2.0 минеральных примесей.

На первом этапе изучены условия промывки волокнистых отходов натурального шелка от жиро-восковых и минеральных примесей с использованием органических, гидрофильных и гидрофобных растворителей [6, 14].

В зависимости от используемых растворителей в процессе отмывки волокнистых отходов натурального шелка от жиро-восковых и минеральных примесей определено изменение содержания жиро–восковых компонентов. При использовании четырёх хлористого метана, хлороформа и этилового спирта в качестве органического растворителя был достигнут высокий уровень чистоты волокнистых отходов от жиро-восковых и минеральных примесей. Степень чистоты волокон шелка Bombyx mori определяли по ГОСТ 5556-81.

Наличие ионов Cl⁻ в фильтрате контролировали качественной реакцией с AgNO₃. Степень чистоты волокон шелка Bombyx mori определена посредством установления его элементного состава на энергия-дисперсивном элементарном анализаторе ((EDS-Oxford Instrument) -Aztec Energy Advanced X-act SDD). Энергодисперсионный рентгеноспектральный анализ образцов показал наличие углерода, кислорода, азота и серы, отсутствие минеральных добавок.

С целью получения чистого фиброина и серицина из волокон натурального шелка, очищенных от жиро-восковых и минеральных примесей, проведен процесс гидролиза волокон натурального шелка в замкнутой системе, в водной среде при высокой температуре и давлении, без применения химических реагентов. Изучено влияние продолжительности гидролиза на выход серицина шелковых волокон под давлением в водной среде. Показано, что при постоянной температуре и давлении, изменение продолжительности гидролиза от 12 до 24 приводит увеличению выхода серицина с 14,2 до 29,8%. На основании полученных результатов в качестве оптимальных условий проведения процесса гидролиза для полного выделения серицина из шелковых волокон были выбраны температура - 110 ⁰С и время - 24 часа. Отсутствие серицина в гидролизованном шелковом волокне в оптимальных условиях определяли выпариванием гидролизата и измерением сухой массы. Установлено, что разработанным способом из шелковых волокон можно выделить чистый серицин. Изучены физико-химических свойств полученного чистого фиброина [11].

Процесс гидролиза повторяли для повышения сорбционных характеристик фиброина с целью его использования в качестве гемосорбента. Определено влияние изменения температуры и времени процесса гидролиза на параметры сорбции.

По результатам исследований гидротермального гидролиза фиброина сорбционные свойства полученного увеличиваются с 43,3 до 61 % при повышении температуры гидролиза. При этом, переход сорбента из волокна в порошок наблюдался при температуре выше 230 °С. Снижение выхода реакции с 97,8 до 91,2% при повышении температуры объясняется тем, что часть макромолекул распадается на водорастворимые олигомеры.

Изучена зависимость сорбционной способности от продолжительности гидролиза. На основании полученных результатов показано, что волокна фиброина подвергаются гидротермической деструкции в водной среде при высокой температуре и давлении. Также установлено, что в результате гидролиза образуются свободные аминокислоты, фракции олигомеров фиброина различной молекулярной массы вследствие разрыва пептидных связей в макромолекуле образуют свободные аминокислоты.

Образование свободных карбоксильных и аминогрупп в макромолекуле фиброина в результате разрыва пептидных связей при гидролизе определено методом кислотно-основного титрования. Вискозиметрических анализов средняя молекулярная масса гидролизованного фиброина составляет Mη≈280000.

Сорбционная активность гидролизованного фиброина изучена в модельных системах и установлено, что в результате гидролиза его сорбционные свойства возрастают, однако эти значения гидролизованного фиброина ниже, чем у существующих промышленных гемосорбентов, поэтому на следующем этапе исследований были получены волокнистые полифункциональные гемосорбенты с высокими сорбционными свойствами путем модификации гидролизованного фиброина ультразвуковым диспергированием и СВЧ-излучением.

При этом повышение степени набухания волокна в водной среде достигалась ультразвуковым диспергированием. Затем влажный гидролизованный фиброин модифицировали с помощью СВЧ. В процессе модификации с помощью СВЧ вода, содержащаяся в волокне, выходя из волокон приводит к растрескиванию волокон за счет взрыва (“эффект взрыва”) и образуя в них поры, тем самим в данных порах образуются реакционно-активные карбоксильные и аминогруппы в свободном состоянии. Путем модификации гидролизата фиброина под действием физических факторов получены полифункциональные волокнистые гемосорбенты с высокими сорбционными свойствами. Количество функционально активных карбоксильных групп в гемосорбенте оказалось в 3 раза выше, чем в исходном фиброине и составило 14,2%. По результатам вискозиметрических анализов средняя молекулярная масса гемосорбента составила М_η≈ 230000. При изучении сорбционных свойств гемосорбента в модельных системах установлено, что он сорбирует 95% активного вещества из состава раствора витамина В₁₂ [11].

Исследование адсорбционных и абсорбционных свойств гемосорбента в крови и плазмы крови человека и модельных животных

Венозную кровь брали из локтевой вены человека и ушной вены кроликов с помощью вакуумного контейнера с поршнем S-Monovette^® с К3ЭДТА. В контейнере антикоагулянт – калиевая соль этилендиамин-тетраацетат (ЭДТА) - нанесен на внутренние стенки пробирки в жидко-мелкодисперсном виде (разбавление при этом составляет менее 1%); количество внесенной К₃-ЭДТА соответствует конечной концентрации 1,6 мг ЭДТА на 1 мл крови. Роль антикоагулянта заключается в связывании ионов кальция, блокирующего каскад свертывания крови. Клетки крови (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) в образце цельной ЭДТА-стабилизированной крови стабильны до 24 часов.

Сразу после взятия крови в вакуумную пробирку с ЭДТА ее тщательно перемешивали, переворачивая 8–10 раз. Недостаточное перемешивание может привести к агрегации тромбоцитов, образованию микросгустков или коагуляции.

Гемосорбент (Гс) были заполнены двух кубовые шприцы и уплотнены до объемов от 0,1 мл³ до 0,6 мл³. Полученные объёмы Гс были взвешены и по формуле ρ=m*V (г/мл), где ρ – плотность, V – объем, m – масса, выведена плотность полученных мембран Гс. Через слой Гс пропускали по 3 мл растворов красителей – метиленовая синь и индигокармин в концентрациях 1 мг/мл, цельная человеческая кровь и кровь кроликов. Для этого поршни и иглы из шприцов изымались, а сами шприцы устанавливались в пробирки, куда самотёком стекали пропущенные через Гс различной плотности красители и кровь (рис.1 и таб. 1).

Рисунок 1. Пропускание раствора метиленовой синего через мембраны Гс различной плотности

Таблица 1.

Спектрофотометрическая оценка адсорбции красителей Гс разной плотности

Примечание: начиная с объема выше 0,3 мл для прохождения раствора через мембрану потребовался пресс в виде поршня шприца; по сравнению с растворами до Гс *Р≤0,002

Как видно из таблицы 1, адсорбционные свойства Гс увеличиваются пропорционально плотности забивки Гс в носитель, но с плотностью забивки выше 0,09-0,1 г/мл давления столба пропускаемой жидкости объёмом 3 мл недостаточно для самопроизвольного прохождения раствора сквозь Гс, а потому был использован пресс в виде поршней шприцов. Статистически высокая адсорбция наблюдалась при плотности Гс равной 0,09-0,1 г/мл.

Аликвоты цельной крови человека были изучены, как до проведения через сорбент, так и после проведения через Гс для определения развернутых показателей крови (табл. 2) на гематологическом анализаторе ВС-3000 (Mindray, P.R.China). Далее от аликвот крови (объёмом 3 мл), проведенных через разные объемы Гс и от аликвот крови, не пропущенной сквозь фиброин, были отделены сыворотки и изучены на наличие белковых фракций, липидных и билирубиновых фракций, а также глюкозы и мочевина, в сравнительном аспекте. Биохимические показатели сыворотки крови определяли унифицированными методами: общий белок (TP) – колоримет-рическим биуретовым методом; альбумин (Alb) - колориметрическим методом с бромкрезоловым зелёным красителем; холестерин (Chol) – ферментативно-колориметрическим методом; общий и прямой билирубин (TBil, DBil) – колориметрическим методом с ДМСО; глюкозу (Glu) – колориметрическим ферментативным глюкозооксидазным методом; мочевину (Urea) – колориметрическим ферментативным методом (наборы реактивов фирмы CYPRESS Diagnostics, Бельгия) на биохимическом анализаторе ВА-88 А (Mindray, P.R.China).

Результаты проведенных исследований показали, что практически все объемы Гс в той или иной степени абсорбируют клеточные элементы цельной крови человека (табл. 2) и белки, липиды и билирубин крови, а также глюкозу и мочевину (табл. 3).

Показатели, приведенные в табл. 2 показывают, что объём Гс 0,2-0,6 мл статистически значимо (Р≤0,0001) абсорбирует тромбоциты, лейкоциты, лимфоциты, смесь моноцитов, базофилов и эозонофилов. Абсорбция эритроцитов относительно низкая. На количество гемоглобина и гематокрит воздействие Гс не значительное. По данным, приведенным в табл. 3 можно отметить абсорбцию всеми объемами Гс общего белка крови и альбумина. Следует отметить, что Гс объемом 0,2-0,3 мл абсорбируют белковые и липидные фракции в районе статистической погрешности. Кроме того, при пропускание цельной крови через объёмы Гс выше 300 мкл приходилось задействовать поршни шприцов с целью продавливания крови через объемы Гс, в то время как через Гс объёмами 0,1-0,3 мл цельная кровь проходила самотёком. В этой связи сыворотки аликвот крови, пропущенных через объёмы Гс выше 0,3 мл имели гемолиз в той или иной степени, а потому показатели по фракциям билирубина в этих сыворотках нельзя учитывать. Статистически значимая адсорбция мочевины и глюкозы наблюдалось при использовании Гс объемом 0,3 мл.

Таблица 2.

Показатели крови человека, до и после проведения через различные объемы Гс (n = 3, M ± m)

Примечание: по сравнению с показателями крови в норме, без использования Гс *Р≤0,002, **Р≤0,0001

Таблица 3.

Показатели белковых, липидных и биллирубиновых фракций крови человека, до и после проведения через различные объемы Гс (n = 3, M ± m)

Примечание: по сравнению с показателями сыворотки крови в норме, без использования ГГ *Р>0,05, **Р≤0,05

Таким образом, Гс, как сорбент наиболее активен в объёмах 0,2-0,3 мл, с плотностью 0,03-0,1 г/мл, как Гс его объем и плотность не должны превышать 0,2 мл и 0,03 г/мл, соответственно.

Адсорбция и абсорбция иммуноглобулинов классов А и Е

Адсорбционные и абсорбционные свойства Гс оценены по содержанию иммуноглобулинов (Ig А и E) крови человека до и после проведения через различные объемы Гс (табл. 4).

Таблица 4.

Содержание иммуноглобулинов классов Ig А и E крови человека до и после проведения через различные объемы Гс (n = 6, M ± m)

Примечание: по сравнению с показателями крови в норме, без использования Гс *Р<0,05

Установлено, что объем Гс 0,1 мл недостоверное снижает количество Ig А в 1,02 раза и Ig E в 0,63 раза. Объемы Гс в диапазоне 0,2 – 0,4 мл, достоверно снижает концентрацию иммуноглобулинов от 1,53 до 3,98 раза. При объеме 0,6 мл Гс сорбирует изученные классы иммуноглобулинов на 100%.

Таким образом, изученные объёмы Гс (0,2-0,6 мл) статистически значимо (Р≤0,05) абсорбируют иммуноглобулины классов А и Е. Результаты полученных исследований выявили высокую сорбционную емкость Гс относительно иммуноглобулины классов А и Е. Следовательно, высокая сорбционная емкость Гс относительно иммуноглобулинов классов А и Е может найти широкое применение при заболеваниях, имеющих Ig E-зависимого патогенеза.

Установлено, что Гс в объемах, соответствующих 0,2-0,3 мл абсорбируют белковые и липидные фракции на уровне статистической погрешности. Кроме того, при пропускании цельной крови через объёмы Гс выше 300 мкл приходилось задействовать поршни шприцов с целью продавливания крови через объемы Гс, в то время как через Гс объёмами 0,1-0,3 мл цельная кровь проходила самотёком. В этой связи сыворотки аликвот крови, пропущенных через объёмы Гс выше 0,3 мл имели гемолиз в той или иной степени, поэтому показатели по фракциям билирубина в этих сыворотках нельзя учитывать. Статистически значимая адсорбция мочевины и глюкозы наблюдалось при использовании Гс объемом 0,3 мл.

Таким образом, Гс, как сорбент наиболее активен в объёмах 0,2-0,3 мл с плотностью 0,09-0,1 г/мл.

Результаты исследований острой токсичности гемосорбента при внутрибрюшинном введении белым мышам.

Гс вводили внутрибрюшинном белым мышам 1 группы однократно в исходной дозе 125 мг/кг, 2 группы в дозе 250 мг/кг (двукратная исходная доза с интервалом 1 час), 3 группы в дозе 375 мг/кг (трехкратная исходная доза), 4 группы в дозе 500 мг/кг (четырехкратная исходная доза), 5 группы в дозе 625 мг/кг (пятикратная исходная доза и 6 группы в дозе 750 мг/кг (шестикратная исходная доза). Животным контрольной группы вводили эквивалентный объем изотонического физиологического раствора.

За весь период опытов при внутрибрюшинном введении гибели животных не отмечено даже при максимально вводимой дозе 750 мг/кг. Из-за отсутствия гибели животных установить ЛД₅₀ гемосорбента не представилось возможным [12].

Значения показателей периферической крови: лейкоциты, абсолютное содержание лимфоцитов, абсолютное содержание смеси моноцитов, базофилов и эозинофилов, количество гранулоцитов, гемоглобин, гематокрит, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, тромбоциты в абсолютных числах, эритроциты, тромбокрит в опытных группах не превышали достоверно аналогичные показатели контрольной группы.

На основании результатов экспериментальных исследований по изучению отечественного Гс в условиях «острого» опыта при внутрибрюшинном введении белым мышам, Гс согласно классификации веществ по токсичности относится к 4-му классу – практически нетоксичное вещество.

Результаты исследований острой токсичности гемосорбента при внутрибрюшинном введении белым крысам.

Гемосорбента вводили внутрибрюшинном белым крысам 1 группы однократно в исходной дозе 125 мг/кг, 2 группы в дозе 250 мг/кг (двукратная исходная доза), 3 группы в дозе 375 мг/кг (трехкратная исходная доза), 4 группы в дозе 500 мг/кг (четырехкратная исходная доза), 5 группы в дозе 625 мг/кг (пятикратная исходная доза и 6 группы в дозе 750 мг/кг (шестикратная исходная доза). Животным контрольной группы вводили эквивалентный объем изотонического физиологического раствора.

Наблюдение за общим состоянием животных велось ежечасно в течение 14 суток опытов. Результаты проведенных исследований показали, что в 6 опытных группах в течение всего периода экспериментов не наблюдались заметные признаки интоксикации. Интегральные показатели (общее состояние животных, потребление пищи и воды, особенности поведения, координация движений, реакция на внешние раздражители, состояние шерстного и кожного покрова, окраска слизистых оболочек, количество и вид фекальных масс) не отличались от показателей контрольной группы. За весь период опытов при внутрибрюшинном введении гибели животных не отмечено даже при максимально вводимой дозе 750 мг/кг. Из-за отсутствия гибели животных установить ЛД₅₀ гемосорбента не представилось возможным.

На основании результатов экспериментальных исследований по изучению отечественного гемосорбента в условиях «острого» опыта при однократном внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении белым крысам, гемосорбент согласно классификации веществ по токсичности относится к 4-му классу – практически нетоксичное вещество.

Результаты изучения хронической токсичности. Хронической токсичность Гс изучена в условиях длительного введения per os белым крысам в дозах 125, 375 и 750 мг/кг.

Результаты проведенных исследований показали, что длительное внутрижелудочное введение Гс в изученных дозах хорошо переносится подопытными животными. Показатели общего состояния, поведения, прироста массы тела, гематологические и биохимические показатели опытных животных не отличались от контрольных значений. Так, наблюдение за динамикой изменения массы тела животных показало, что при исходной массе тела 124,0±2,56 через 30 дней внутрижелудочной затравки отмечается прирост в массе тела до 158,7±3,99 (в процентах прирост составляет в среднем +27,9%).

Изучение динамики гематологических показателей периферической крови после воздействия Гс не выявило статистически значимых различий у животных опытных групп по сравнению с контрольными данными. Результаты представлены в табл. 5.

Результаты изучения биохимических показателей сыворотки крови опытных и контрольных животных после воздействия Гс представлены в табл. 6.

Анализ полученных данных показал, что у опытных животных показатели общего билирубина, общего белка, креатинина, холестерина, АЛТ, АСТ в сыворотке крови существенно не отличались от контрольных значений.

Таким образом, отечественный Гс при длительном внутрижелудочном введении экспериментальным животным в изученных дозах не оказывает токсического воздействия на гематологические и биохимические показатели.

Таблица 5.

Гематологические показатели крови крыс после длительного введения per os Гс в дозах 125, 375 и 750 мг/кг.

Таблица 6.

 Биохимические показатели крови крыс после длительного введения per os Гс в дозах 125, 375 и 750 мг/кг.

Результаты гистоморфологических исследований внутренних органов белых крыс. Удаленные органы животных фиксировали в 10% забуференном растворе формалина в течение 24 часов для дальнейших гистологических исследований. Органы после фиксации запускались в гистопроцессор «Thermo Fisher STP 120» для дегидратации, пропитки и парафинизации. Готовые срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятому методу. Полученные гистологические препараты изучали при разных увеличениях микроскопа Axio Lab.A1 (Carl Zeiss) и фотографировали с помощью цифровой видеокамеры SDPTOP.

При гистоморфологическом исследовании, проведенном через 1 мес. после внутрижелудочной затравки Гс в дозах 125, 375 и 750 мг/кг, у животных контрольной и опытных групп, анатомическое расположение и структура внутренних органов соответствовали норме. Внешний вид, размеры и макроскопическая структура внутренних органов визуально не отличались от нормы.

На основании сравнительного гистоморфологического исследования органов и тканей контрольных и опытных животных, можно сделать вывод о том, что длительное внутрижелудочное введение отечественного Гс в дозах 125, 375 и 700 мг/кг не оказывает токсического влияния на внутренние органы экспериментальных животных.

Результаты гематологических, биохимических и гистоморфологических исследований внутренних органов подтверждают, что Гс при длительном внутрижелудочном введении доз 125, 375 и 750 мг/кг не оказывает токсического воздействия на организм экспериментальных животных.

Оценка цитотоксичности Гс. Оценку цитотоксичности Гс проводили методами in vitro на культурах клеток фибробластов. Для исследований клетки фибробластов получали методом эксплантат [13] из биоптатов дермы новорожденных лабораторных крыс. С культуральных флаконов при пассажах переносили клетки, снимая смесью Версена и трипсина. После пятого пассажа, клетки были перенесены в 96 луночные планшеты, где на дно лунок были иммобилизованы кусочки Гс по 50-800 мкг/мл (триплетами), для оценки цитотоксичности колориметрическим методом. Клетки высевали на Гс в полной среде RPMI-1640 и инкубировали в течение 24 часов. После инкубации оценивали жизнеспособность клеток с использованием колориметрического метода с нейтрально красным красителем (рис. 2).

Рисунок 2. Процент живых клеток фибробластов, через 24 часа совместного культивирования с разным количеством Гс.

Как видно из рисунка 10 культивирование клеток совместно с Гс в концентрации 800 мкг/мл приводит к полному угнетению жизнеспособности клеток фибробластов, а 50% ингибирование клеток IC₅₀ наблюдается в концентрации 400 мкг/мл. Показатель IC₅₀ коррелируется с LD₅₀ только при внутривенном введение, и в результате LD₅₀ при внутривенном введение для Гс будет находиться в пределах 400 мг/кг, что необходимо будет подтвердить исследованиями in vivo.

Таблица 7.

Оценка жизнеспособности клеток фибробластов при совместном культивирование с Гс.

Результаты оценки цитотоксичности отечественного сорбента на основе фиброина шелка с использованием методами in vitro на культурах клеток фибробластов показали, что культивирование клеток совместно с Гс в концентрации 800 мкг/мл приводит к полному угнетению жизнеспособности клеток фибробластов, а 50% ингибирование клеток IC₅₀ наблюдается в концентрации 400 мкг/мл. Показатель IC₅₀ коррелируется с LD₅₀ только при внутривенном введение, следовательно, LD₅₀ при внутривенном введение для изучаемого Гс будет находиться в пределах 400 мг/кг, что необходимо будет подтвердить исследованиями in vivo.

Выводы

Результаты «острого» опытов при однократном внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении белым крысам гемосорбента в дозах 125, 250, 375, 500, 625 и  750 мг/кг, согласно классификации веществ по токсичности относится к 4-му классу – практически нетоксичное вещество.

Результаты исследований в условиях «хронической» токсичности при введении per os белым крысам в дозах 125, 375 и 750 мг/кг показали, что отечественный гемосорбент не оказывает токсического воздействия на гематологические и биохимические показатели экспериментальных животных. Отсутствие вредного воздействия подтверждено результатами патоморфологических исследований внутренних органов.

Исследованиями установлено, что объёмы гемосорбента «Гемосорб» в диапозоне 0,2-0,6 мл³ статистически значимо (Р≤0,0001) абсорбирует тромбоциты, лейкоциты, лимфоциты, смесь моноцитов, базофилов и эозонофилов. Абсорбция эритроцитов относительно низкая. На количество гемоглобина и гематокрит воздействие Гс не значительное. Изученные объемы Гс адсорбируют общий белок крови и альбумин. Гс объемом 0,2-0,3 мл абсорбируют белковые и липидные фракции в районе статистической погрешности. Статистически значимая адсорбция мочевины и глюкозы наблюдалось при использовании Гс объемом 0,3 мл. Через Гс объёмом 0,1-0,3 мл³ цельная кровь проходила самотёком. Объем Гс выше 0,3 мл препятствовал прохождению крови. В этой связи сыворотки аликвот крови, пропущенных через объёмы Гс выше 0,3 мл имели гемолиз в той или иной степени. Результаты оценки цитотоксичности отечественного сорбента на основе фиброина шелка с использованием методами in vitro на культурах клеток фибробластов показали, что культивирование клеток совместно с Гс в концентрации 800 мкг/мл приводит к полному угнетению жизнеспособности клеток фибробластов, а 50% ингибирование клеток IC₅₀ наблюдается в концентрации 400 мкг/мл. Показатель IC₅₀ коррелируется с LD₅₀ только при внутривенном введение, следовательно, LD₅₀ при внутривенном введение для изучаемого Гс будет находиться в пределах 400 мг/кг, что необходимо будет подтвердить исследованиями in vivo.

Финансирование работы

Исследования выполнены рамках прикладного проекта AL-18-722212919 “Разработка технологии получения оригинальных, полифункциональных гемосорбентов на основе волокнистых отходов предприятий по переработке коконов” при поддержке Агентства инновационного развития Республики Узбекистан.

Список литературы:

1. Лужников Е. А., Гольдфарб Ю. С. Гемосорбция в лечении острых отравлений //Токсикологический вестник. – 2007. – №. 2 (83). – С. 2-12.
2. Нуралы А. М. и др. Эффективность применения сорбентов из растительного сырья //Новости науки Казахстана. – 2019. – №. 2. – С. 116-126.
3. Morozov A. S. et al. Sorbents for extracorporeal removal of toxic substances and molecules with adverse biological activity //General reanimatology. – 2017. – Т. 12. – №. 6. – С. 82-107.
4. Рачковская Л. Н. и др. Модифицированные сорбенты для практического здравоохранения //Сибирский научный медицинский журнал. – 2015. – Т. 35. – №. 2. – С. 47-54.
5. Nuraly A. et al. Comparative analysis of hemosorbents obtained at different modes //Matéria (Rio de Janeiro). – 2020. – Т. 25. – №. 04. – С. e-12893.
6. Sarymsakov A. A., Yarmatov S. S., Yunusov K. E. Preparation and Physicochemical Properties of a Hemosorbent Derived from Bombyx mori Cocoon Fibroin //Russian Journal of Applied Chemistry. – 2022. – Т. 95. – №. 7. – С. 988-995.
7. Ярматов С.С., Сарымсаков А.А. Полифункциональный гемосорбент на основе фиброина шелка // Ташкентский Фармацевтический журнал. 2020. № 1. –С. 43-48.
8. Mondal M., Trivedy K., Nirmal K. S. The silk proteins, sericin and fibroin in silkworm, Bombyx mori Linn.,-a review. – 2007.
9. Ling S. et al. Polymorphic regenerated silk fibers assembled through bioinspired spinning //Nature communications. – 2017. – Т. 8. – №. 1. – С. 1387.
10. Торстен К., Рене Ш., Хелен В. // Косметическое средство. Патент RU 2463036. 2012.
11. Sarymsakov A. A., Yarmatov S. S., Yunusov K. E. Physicochemical, Sorption, and Morphological Characteristics of Bombyx Mori Silkworm Cocoon Fibroin and a Multifunctional Hemosorbent Obtained on Its Basis //Polymer Science, Series A. – 2023. – Т. 65. – №. 3. – С. 256-263.
12. Xu X. et al. Extracorporeal blood therapy in sepsis and acute respiratory distress syndrome: the" purifying dream" //Chinese Medical Journal. – 2014. – Т. 127. – №. 24. – С. 4263-4270.
13. Lopukhin Yu.M., Molodenkov M.N. Gemosorbtsiya [Hemosorption]. 2nd ed., rev. and exp. Moscow: Meditsina Publ., 1985. 287 p. (In Russian)
14. Азизова М. А. и др. Разработка технологии получения оригинального полифункционального гемосорбента на основе фиброина шелка //Universum: химия и биология. – 2025. – Т. 2. – №. 3 (129). – С. 19-25.