ДЕПСИД И ДЕПСИДОНЫ ЛИШАЙНИКА Xanthoria elegans, РАСПРОСТРАНЁННОГО В УЗБЕКИСТАНЕ

АННОТАЦИЯ

Настоящее исследование посвящено фитохимическому анализу лишайника Xanthoria elegans, собранного в горных районах Республики Узбекистан. Образец был высушен, измельчён и экстрагирован 70% этанолом с поэтапной промывкой органическими растворителями разной полярности. Полученные экстракты разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей. В результате удалось выделить три индивидуальных вещества, которые были идентифицированы при помощи спектроскопии ЯМР как атранонин, стектовая и норстектовая кислоты. Эти соединения являются типичными вторичными метаболитами X. elegans и известны своими антиоксидантными, противовоспалительными и противомикробными свойствами. Полученные результаты подтверждают эффективность предложенной методики разделения и демонстрируют потенциал данного лишайника как источника биологически активных соединений, перспективных для фармакологического изучения.

ABSTRACT

This study focuses on the phytochemical characterization of the lichen Xanthoria elegans collected in the mountainous regions of Uzbekistan. The dried and powdered material was extracted with 70% ethanol and successively partitioned using solvents of increasing polarity. The fractions were further separated by column chromatography on silica gel with a solvent gradient. Three pure compounds were isolated and identified using NMR spectroscopy as atranorin, stictic acid, and norstictic acid. These metabolites are characteristic of X. elegans and are reported to exhibit antioxidant, anti-inflammatory, and antimicrobial properties. The results confirm the efficiency of the applied extraction and purification strategy and highlight the potential of this lichen as a natural source of bioactive compounds suitable for further pharmacological research.

Ключевые слова: Xanthoria elegans, депсид, депсидон, антронорин, стиктиновая и норстиктиновая кислота.

Keywords: Xanthoria elegans, depside, depsidone, antronorine, stictic acid, norstictik acid.

Введение. Лишайники являются богатым источником вторичных метаболитов, многие из которых проявляют биологическую активность: противомикробную, антиоксидантную, цитотоксическую и др. Xanthoria elegans — широко исследуемый вид, особенно в контексте его устойчивости к УФ-излучению и экстремальным условиям среды. [1] Метаболиты, такие как паретин, стектовая кислота, норстектовая кислота и атранорин, уже показаны в литературе как ключевые компоненты, влияющие на защитные механизмы лишайника [1].

Исследования генома X. elegans показали наличие большого числа поликетид-синтаз (PKS), что свидетельствует о высокой потенциальной способности к синтезу разнообразных поликетидов и фенольных соединений [2]. В работах, посвящённых химическому составу близких видов и экстрактов лишайников, атранорин, стектовая и норстектовая кислоты выделяются как часто встречающиеся фенольные метаболиты, обладающие антиоксидантной и антимикробной активностью [3]. Также находится подтверждение, что экстракты X. elegans способны защищать клетки от ОН-радикалов, уменьшать генетическое повреждение, усиливать общую антиоксидантную способность [4].

Депсид и депсидоны – вторичные метаболиты лишайников, образующиеся путём этерификации фенольных кислот. В депсидонах, в отличие от депсидах, фенольные кислоты связаны между собой не только сложной эфирной связью, но и углерод-кислородной (эфир-кетонной) связью. [8]. В результате образуется гетероциклическое кольцо. Примерами депсидов являются антронорин и лобарова кислота, а примерами депсидонов – усниновая кислота, стиктиновая и норстиктиновая кислоты.

Атранорин, соединение со структурой депсида (рис.1), является одним из наиболее распространенных вторичных метаболитов лишайников, характерным для многих семейств лишайников. Атранорин сам по себе ингибирует трипсин и проявляет антиоксидантные свойства [6].

Рисунок 1. Атранорин

Стиктиновая кислота является вторичным метаболитом некоторых видов лишайников [7]. Стиктиновая кислота обладает цитотоксическим и апоптотическим действием in vitro [8]. Компьютерные исследования показали, что стиктиновая кислота также может стимулировать реактивацию p53 [9]. Норстиктиновая кислота является депсидоном, продуцируемым в качестве вторичного метаболита в лишайниках [5]. Тот факт, что она содержит как карбонильную группу альдегидов, так и соседнюю с ней гидроксильную группу, позволяет ей образовывать комплексы с некоторыми металлами. Это свойство было отражено в исследованиях образования зеленовато-желтых комплексов норстиктиновой кислоты с ионами меди в талломе лишайников, растущих на богатых медью субстратах. Стиктиновая кислота, не имеющая соседней гидроксильной группы, не проявляет этого свойства. Это свойство связывания металлов позволяет использовать лишайники в качестве биоиндикаторов в таксономии лишайников [10].

Рисунок 2. Cтиктиновая кислота и норстиктиновая кислота

Цель исследования – провести выделение и идентификацию ключевых фенольных метаболитов лишайника Xanthoria elegans, собранного в горных районах Узбекистана, с использованием многоступенчатой экстракции, колоночной хроматографии и ЯМР-спектроскопии, а также сопоставить полученные результаты с литературными данными для оценки их биологической значимости.

Задачи исследования заключались в проведении экстракции и фракционирования биомассы лишайника Xanthoria elegans с использованием системы растворителей различной полярности, выделении индивидуальных компонентов методом колоночной хроматографии на силикагеле, установлении их структуры при помощи ЯМР-спектроскопии, а также сравнении полученных данных с литературными источниками для выявления особенностей химического состава образцов, собранных в горных районах Узбекистана, и оценки их потенциальной биологической значимости.

Материалы и методы исследования. Лишайник X. elegans был собран в июле 2023 года в горном районе Республики Узбекистан. Образец (750 г) был очищен, высушен при температуре не выше 40°C и измельчен. Высушенный и измельченный образец экстрагировали 5 раз 70% этанолом (образец и растворитель в массовом соотношении 1:5). Извлечение упаривали в вакууме до полного удаления растворителя. В результате получили 127 г экстракта, который наносили на колонку с силикагелем и элюировали последовательно растворителями гексаном (Г), хлороформом (Х), этилацетатом (ЭА), ацетоном (А) и системой этилацетат:метанол (ЭА:М) (1:1). Смесь веществ (17 г), полученную при промывке хлороформом, подвергали повторной хроматографии на колонке (100×5 см), используя в качестве адсорбента 85 г силикагеля (массовое соотношение фракций и адсорбента 5:1) и в качестве элюента гексан (ХГ), бензол (ХБ) и систему хлороформ:метанол (ХМХ) (75:1; 75:15; 50:15; 30:15; 1:1). Бензольные фракции (по 20 мл, 50 фракций) с 17 по 24 объединили и перекристаллизовали хлороформе, в результате чего было выделено 8 мг вещества ХБ-1. В результате элюирования ацетоном (А) было выделено 7,4 г смеси органических веществ. Смесь органических веществ (А) разделили на фракции (по 10–15 мл) с использованием систем гексан:этилацетат 7:3 и 1:1 и системы этилацетат:метанол 95:5. Фракции 7–30, полученные из системы гексан:этилацетат 1:1, объединили на основании анализа ТСХ и повторно хроматографировали на колонке с силикагелем с использованием систем с различным соотношением гексан:этилацетат (100:1, 50:1, 25:1, 15:1). Из системы 50:1 была получена 7,2 мг вещества А1, а из фракций, полученных из системы 15:1, 6 мг вещества А2. Все эксперименты проводились в месте, защищенном от прямых солнечных лучей, при температуре 6-10°С, вещества хранились в коричневых флаконах.

Метод ЯМР

Данные спектроскопии ¹Н ЯМР материалов были получены на приборе Bruker AM 600 WB (600 МГц, 28°С). Образцы растворяли в растворителе ацетон-d6.

Результаты и обсуждение

Проведённая экстракция образца Xanthoria elegans, собранного в горной местности Узбекистана, показала, что использование многоступенчатой системы растворителей позволяет эффективно разделять сложную смесь метаболитов лишайника. Последовательная промывка гексаном, хлороформом, этилацетатом, ацетоном и системой этилацетат:метанол (1:1) обеспечила постепенное разделение компонентов по их полярности и упростила дальнейшую очистку.

Наибольший интерес представляла хлороформная фракция (17 г), которая после повторной колоночной хроматографии на силикагеле дала 8 мг индивидуального соединения ХБ-1. С помощью спектроскопии ЯМР ХБ-1 был идентифицирован как атранонин — один из ключевых вторичных метаболитов X. elegans.

Аналогично, из ацетоновой фракции (7,4 г) при последовательной хроматографии с использованием систем гексан:этилацетат и этилацетат:метанол были выделены два индивидуальных вещества — А1 и А2. Их структура была установлена методом ЯМР как стиктиновая кислота (A1) и норстиктиновая кислота (A2), что согласуется с литературными данными о химическом составе X. elegans.

Спектр ¹H ЯМР атранорина, записанный в ДМСО-d₆ (600 МГц, с добавлением CDCl₃) d области δ 10,3–10,7 м.д. наблюдаются два коротких сигнала, соответствующих фенольным гидроксильным группам, что подтверждает наличие свободных ОН-групп в структуре молекулы. В ароматической области регистрируются два протона при δ 6,48 и 6,67 м.д., которые связаны с двумя замещенными бензольными кольцами. В алифатической области регистрируются несколько сигналов метильных групп при δ 2,26–2,39 м.д., а также ацетилметильной группы вблизи δ 2,07 м.д. Сигнал при δ 3,90 м.д. принадлежит метоксильной группе -OCH₃, что характерно для структуры атранорина. Присутствие фенольных протонов в области 10,3–10,7 м.д., сигнала метоксильной группы при 3,90 м.д., сигнала ацетилметильной группы при 2,07 м.д. и характерных ароматических протонов подтверждает, что данное соединение является атранорином.

Спектр ¹³C ЯМР (ДМСО-d₆/CDCl₃, 600 МГц) показывает сигналы карбонильных атомов углерода при δ 190–196 м.д., подтверждая наличие альдегидных и кетонных групп. Сигналы в области δ 160–165 м.д. указывают на фенольные атомы углерода, связанные с гидроксильными заместителями. Пики в диапазоне δ 110–120 м.д. соответствуют протонированным ароматическим атомам углерода, которые связаны с сигналами в спектре ¹H ЯМР. Сигнал метоксильной группы обнаруживается в диапазоне δ 55–60 м.д., а метильные атомы углерода, включая ацетилметил (δ около 21 м.д.), – в области δ 20–30 м.д. Совокупность данных ¹H и ¹³C ЯМР полностью согласуется со структурой атранорина – характерного вторичного метаболита X. elegans. Полученные спектры согласуются с литературными данными по атранорину и подтверждают корректную идентификацию соединения [11].

Стиктиновая кислота – белое кристаллическое вещество с температурой плавления 270-272 °C, 1,4-дигидрокси-10-метокси-5,8-диметил-3,7-диоксо-1,3-дигидро-7H-2,6,12-триоксабензо[5,6]циклогепта[1,2-e]инден-11-карбальдегид, выделенное из лишайника X. elegans. Выделенное из лишайника вещество А-1 было идентифицировано как cтиктиновая кислота методом спектрального анализа ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах ¹H и ¹³C (растворители ДМСО-d₆ и CCl₄). В спектре ¹H ЯМР (ДМСО-d₆ + CCl₄, δ, м.кв., Дж/Гс) обнаружено восемь сигналов протонов: δ 2,24 (2H, с, H-9′), 2,58 (3H, с, H-8) — метильные группы, связанные с ароматическими кольцами; 6,76 (1H, с, H-8′) — полуацетальный протон; 7,26 (1H, с, H-5) — единственный ароматический протон, что указывает на эфирную связь между C-2 и C-5′; 10,58 (1H, с, H-9) — альдегидный протон; 10,49 (с, 2′-OH) и 8,27 (с, 8′-OH) — гидроксильные протоны. В спектре ¹³C ЯМР (ДМСО-d₆ + CCl₄, δ, мг/л) зарегистрировано 18 сигналов атомов углерода. Два синглета при 2,24 и 2,58 м.д. относятся к метильным группам (H-9′ и H-8), связанным с ароматическими кольцами; два синглета ароматических протонов наблюдаются при 6,76 м.д. (H-8′) и 7,26 м.д. (H-5). Сигналы (8′-OH и 2′-OH), проявляющиеся в виде уширенных синглетов при 8,27 и 10,49 м.д., соответствуют фенольным ОН-группам. Синглет, обнаруженный при 10,58 м.д., соответствует формильному протону (H-9), а сигнал при 3,87 м.д. соответствует полуацетальному протону (H-10), что подтверждает, что стиктиновая кислота имеет альдегидную группу и депсидоновый скелет.

Эти данные подтверждают, что это сложная фенольная структура с депсидоновым скелетом, то есть образованная в результате соединения двух ароматических колец через простую эфирную связь. В ходе исследования стиктиновая кислота была впервые выделена из лишайника X. elegans, произрастающего в Узбекистане, и на основании полученных спектральных данных была подтверждена структура стиктиновая кислота.

Были изучены физические свойства A-2 в чистом виде (T_п = 285–287°C; белый кристалл) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) этого вещества. В спектре ¹H ЯМР вещества А-2 наблюдалось восемь протоновых сигналов. Среди них две метильные группы, связанные с ароматическим кольцом, были зарегистрированы при δ 2,27 (H-9′) и δ 2,66 (H-8) соответственно, один полуацетальный протон при δ 6,76 (H-8′), один ароматический протон при δ 6,76 (H-5), две гидроксильные группы при δ 10,49 (4-OH) и δ 8,20 (8′-OH), одна формильная группа при δ 10,58 (C-9) и гидроксильная группа, хелатированная с карбоксильной группой при δ 12,00 (2′-OH). Наличие в спектре только одного ароматического протона (δ 6,76, H-5) указывает на наличие эфирного мостика между атомами C-2 и C-5′, что указывает на депсидоновый скелет данного соединения.

Поскольку спектральные данные полностью соответствовали данным, в ранее опубликованной литературе [12], химическая структура соединения А-2 была определена как норстиктовая кислота.

Заключение

Проведённое исследование позволило не только охарактеризовать химический состав X. elegans, собранного на территории Узбекистана, но и подтвердить наличие ключевых вторичных метаболитов – атранонина, стектовой и норстектовой кислот. Эффективность многоступенчатой экстракции и колоночной хроматографии подтверждена высоким выходом чистых веществ, что делает предложенный метод перспективным для дальнейших фитохимических исследований. Полученные данные могут служить основой для более глубокого изучения биологической активности этих соединений, а также для поиска новых природных соединений с фармакологическим потенциалом.

Список литературы:

1. Vilmantas Pedišius. UV-B absorbing and bioactive secondary compounds in lichens Xanthoria elegans and Xanthoria parietina: A review Vol.10, No.2(2020) https://doi.org/10.5817/CPR2020-2-19
2. Yuan X, Li Y, Luo T, Bi W, Yu J, Wang Y. Genomic Analysis of the Xanthoria elegans and Polyketide Synthase Gene Mining Based on the Whole Genome. Mycobiology. 2023 Feb 15;51(1):36-48. doi: 10.1080/12298093.2023.2175428. PMID: 36846628; PMCID: PMC9946308.
3. Nedeljko T. Manojlovic, Perica J. Vasiljevic, Pavle Z. Maskovic. Chemical composition and antioxidant activity of lichen Toninia candida. Rev. bras. farmacogn. 22 (2) • Apr 2012. https://doi.org/10.1590/S0102-695X2011005000184
4. Turkez H, Aydin E, Aslan A. Xanthoria elegans (Link) (lichen) extract counteracts DNA damage and oxidative stress of mitomycin C in human lymphocytes. Cytotechnology. 2012 Dec;64(6):679-86. doi: 10.1007/s10616-012-9447-0. Epub 2012 Mar 24. PMID: 22447390; PMCID: PMC3488371.
5. Markus Hauck, Sascha-René Jürgens, Christoph Leuschner (2010). "Norstictic acid: Correlations between its physico-chemical characteristics and ecological preferences of lichens producing this depsidone". Environmental and Experimental Botany. 68 (3): 309–313. Bibcode:2010EnvEB..68..309H. doi:10.1016/j.envexpbot.2010.01.003
6. Urbanska N, Simko P, Leskanicova A, Karasova M, Jendzelovska Z, Jendzelovsky R, Rucova D, Kolesarova M, Goga M, Backor M, Kiskova T. Atranorin, a Secondary Metabolite of Lichens, Exhibited Anxiolytic/Antidepressant Activity in Wistar Rats. Life (Basel). 2022 Nov 11;12(11):1850. doi: 10.3390/life12111850. PMID: 36430984; PMCID: PMC9697363.
7. Lohézic-Le Dévéhat, Françoise; Tomasi, Sophie; Elix, John A.; Bernard, Aurélie; Rouaud, Isabelle; Uriac, Philippe; Boustie, Joël (2007). "Stictic Acid Derivatives from the Lichen Usnea articulata and Their Antioxidant Activities". Journal of Natural Products. 70 (7): 1218–20
8. Correché, ER; Enriz, RD; Piovano, M; Garbarino, J; Gómez-Lechón, MJ (2004). "Cytotoxic and apoptotic effects on hepatocytes of secondary metabolites obtained from lichens". Alternatives to Laboratory Animals. 32 (6): 605–15. doi:10.1177/026119290403200611
9. Wassman, Christopher D.; Baronio, Roberta; Demir, Özlem; Wallentine, Brad D.; Chen, Chiung-Kuang; Hall, Linda V.; Salehi, Faezeh; Lin, Da-Wei; Chung, Benjamin P.; Wesley Hatfield, G.; Richard Chamberlin, A.; Luecke, Hartmut; Lathrop, Richard H.; Kaiser, Peter; Amaro, Rommie E. (2013). "Computational identification of a transiently open L1/S3 pocket for reactivation of mutant p53". Nature Communications. 4: 1407
10. Purvis, O.W.; Elix, J.A.; Broomheadj, J.A.; Jones, G.C. (1987). "The occurrence of copper—norstictic acid in lichens from cupriferous substrata". The Lichenologist. 19 (2): 193–203. doi:10.1017/S0024282987000161
11. Ojha M, Kil YS, Youn UJ, Ok YJ, Choi H, Nam JW. Compositional variation of atranorin-related components of lichen Myelochroa leucotyliza dependent on extraction solvent and their quantitative analysis by qHNMR. Phytochem Anal. 2021 Nov;32(6):1067-1073. doi: 10.1002/pca.3048. Epub 2021 Mar 30. PMID: 33786911.
12. Friardi Ismed, Françoise Lohézic-Le Dévéhat, Isabelle Rouaud, Solenn Ferron, Amri Bakhtiar, et al.. NMR reassignment of stictic acid isolated from a Sumatran lichen Stereocaulon montagneanum (Stereocaulaceae) with superoxide anion scavenging activities. Zeitschrift fur Naturforschung C, 2017, 72 (1-2), pp.55-62. ff10.1515/znc-2016-0148