РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛЕНДИФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ В РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ «МЕДРОНИК, 99MТС»

АННОТАЦИЯ

Важнейшими показателями качества любого радиофармацевтического препарата (РФП) являются содержание действующих веществ, значения которых нормированы. Целью данного исследования являлась разработка и валидация методики количественного определения метилендифосфоновой кислоты в препарате «Медроник,^99mТс», методом спектрофотометрии. Валидацию разработанной методики проводили по следующим критериям: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (сходимость и внутрилабораторная прецизионность). Объектом исследования методики был выбран препарат «Медроник,^99mТс», разработанный в ГП «Радиопрепарат» ИЯФ АН РУз. Относительная ошибка среднего результата при выполнении тестов «cходимость, внутрилабораторная прецизионность и правильность» не превышала 1,47; 0,63 и 1,1%, соответственно при относительной погрешности не более 2%. Продемонстрирована линейность сигнала модельных растворов со следующими концентрациями 0,583 мг/мл (70%), 0,666 мг/мл (80%), 0,749 мг/мл (90%), 0,833 мг/мл (100%), 0,916 мг/мл (110%), 0,999 мг/мл (120%), 1,08 мг/мл (130%) препарата «Медроник,^99mТс».

ABSTRACT

The most important quality indicators of any radiopharmaceutical drug (RPD) are its content of active substance, the values of which are standardized. The purpose of this study was to develop and validate a technique for the quantitative determination of methylene diphosphonic acid in the preparation “Medronic,^99mTc” by spectrophotometric method. The validation of the developed methodology was carried out according to the following criteria: specificity, linearity, correctness, precision (convergence and intra-laboratory precision). The drug “Medronic,^99mTc”, produced by the State Enterprise "Radiopreparat" of the Institute of Nuclear Physics of the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan, was chosen as the object of research of the methodology. The relative error of the average result when performing the "Convergence, intra-laboratory precision and correctness" tests did not exceed 1,47; 0,63 and 1,1%,, respectively, with a relative error of no more than 2%. The linearity of the signal of model solutions with the following concentrations was demonstrated: 0.583 mg/ml (70%), 0.666 mg/ml (80%), 0.749 mg/ml (90%), 0.833 mg/ml (100%), 0.916 mg/ml (110%), 0.999 mg/ml (120%), 1.08 mg/ml (130%) of the drug “Medronic,^99mTc”.

Ключевые слова: радиофармацевтический препарат, радионуклид, технеций-99m, валидация.

Keywords: radiopharmaceutical, radionuclide, technetium-99m, validation.

ВВЕДЕНИЕ

Бифосфонатные соединения, меченые радионуклидом ^99mTc, в костной ткани связываются с кристаллами гидроксиапатита и незрелым коллагеном (остеоидом) [1]. Бифосфонаты давно известны как вещества, способные связываться с малорастворимыми солями кальция. Структурное сходство бифосфонатов с минералом кости — гидроксиапатитом, составляющим почти 2/3 общего веса кости в сочетании с органической матрицей связи P-C-P, делает их устойчивыми к химическому и ферментативному гидролизу [2]. Кроме того, их аффинность к гидроксиапатиту, определяющая способность бифосфонатов накапливаться в местах образования костной мозоли, имеет фундаментальное значение. Бифосфонаты сохраняются в местах костеобразования до тех пор, пока не произойдет замена старой кости на новую [3]. Благодаря этим свойствам комплексы бифосфонатов с технецием-99м могут быть использованы в качестве радиофармацевтических средств для диагностики патологических состояний костной ткани, сопровождающихся остеобластическими процессами [4]. Это свойство бифосфонатных комплексов стало определяющим при создании лекарственной формы отечественного остеотропного РФП «Медроник, ^99mТс» с радионуклидом ^99mTc на основе метилендифосфоновой кислоты  в препарате (MDP), которое было осуществлено в Государственном предприятии «Радиопрепарат» ИЯФ АН РУз в 2020 году.

Один из этапов исследований по созданию лекарственного средства является разработка методик количественного определения содержания действующего вещества в готовом лекарственном препарате. При этом большое значение имеют методы анализа, позволяющие быстро и надежно выявить отклонения в качестве и свойствах препарата на самых ранних стадиях исследования. Простым и надежным методом контроля качества лекарственных средств признана спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой (УФ) областях спектра [5-10]. Применение этого метода отличается высокой достоверностью, воспроизводимостью и точностью и позволяет значительно упрощать методики количественного анализа.

Целью данного исследования являлась разработка и валидация методики количественного определения метилендифосфоновой кислоты (MDP) в радиофармацевтическом препарате «Медроник,^99мТс», методом спектрофотометрии. Валидацию разработанной методики проводили по следующим критериям: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (сходимость и внутрилабораторная прецизионность).

Материалы и методы

 Приборы и аппаратура

Спектрофотометр Geneses 10sUV-Vis; Весы VWRLA214i; пипетки-дозаторы с регулируемом объемом Accumax 100-1000 мкл; пипетки-дозаторы с регулируемом объемом Accumax 500-5000 мкл.

Приготовление растворов

Приготовление рабочего раствора метилендифосфоновой кислоты:

Cубстанцию MDP-Sn(II) в виде лиофилизата в соответствующей массе MDP 10,0 мг растворили в 12,0 мл 0,9% раствором натрия хлорида (NaCl), далее в калиброванную пробирку вместимостью 10 мл поместили по 0,2 мл раствора препарата, прибавляя по 2,0 мл ацетатного буферного раствора рН-4,0±0,1; 1,6 мл раствора кислоты сульфосалициловой; 0,4 мл 0,005 М раствора квасцов железоаммонийных; довели объем до метки с водой для инъекций и перемешали. Через 5 мин. измерили оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре.

Приготовление раствора плацебо: Для приготовления раствора плацебо: в мерную колбу вместимостью 10 мл поместили следующие реактивы: 2 мл ацетатный буферный раствор с рН 4,0±0,1; 1,6 мл сульфосалициловой кислоты; 0,4 мл 0,005 М раствора железоаммонийных квасцов. После растворения навески измерили рН раствора. рН раствора должен находиться в диапазоне 3,9-4,1 (доводят рН до нужного значения добавлением 1М HCl или 1М NaOH). Затем довели объем раствора водой до метки. Далее, к 1,0 мл полученного раствора добавили 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Анализ приготовленных растворов проводили по методике количественного определения метилендифосфоновой кислоты в субстанции MDP-Sn(II).

Приготовление модельных рабочих растворов: готовили семь модельных растворов согласно диапазону применения методики [5] в концентрациях: 70,00%, 80,00%, 90,00%, 100,00%, 110,00%, 120,00%, 130,00% от номинальной. Номинальный раствор  приготовили растворением лиофилизата субстанции MDP-Sn(II)  соответствующей массы MDP 10,0 мг  в 12 мл раствора пертехнетата натрия (Na^99mTcO₄).

Результаты и обсуждение

Валидацию разработанной методики количественного определения содержания MDP в препарате «Медроник,^99mТс», проводили в соответствии с установленными требованиями на образцах препарата и модельных смесях, полученных в лабораторных условиях. Исследовали следующие валидационные характеристики: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (сходимость и внутрилабораторная прецизионность). Главное условие специфичности методики – способность безусловно определять анализируемое вещество при наличии других компонентов, которые могут присутствовать в образце, например, вспомогательных веществ. Для количественного определения содержания действующего вещества в препарате Медроник,^99mТс был применен метод спектрофотометрии. В UV-Vis спектре поглощения раствор препарата «Медроник,^99mТс» в области длины волны от 450 до 510 нм. Сравнительные результаты приведены на рисунке1.

Рисунок 1. UV-Vis спектре поглощения MDP в растворе препарата «Медроник, 99mТс» (выделен красным цветом), раствора плацебо (выделен синим цветом)

По результатам измерений оптической плотности раствора препарата «Медроник,^99mТс» и раствора плацебо на рисунке 1, можно увидеть, что спектр раствора, приготовленного для количественного определения метилендифосфоновой кислоты, имеет максимум поглощения при длине волны 490 нм (в области от 450 до 510 нм), а раствор плацебо в этом диапазоне длин волны не имеет максимумов. Таким образом, результаты доказывают, что разработанная методика является специфичной для количественного определения MDP.

Валидационный параметр «линейность» проверяли экспериментально измерением аналитического сигнала (ОП) для проб с различным содержанием MDP в пределах аналитической области методики – от 70 до 130 % номинального содержания MDP в растворе препарата «Медроник,^99mТс». Регрессионный анализ полученных данных проводили методом наименьших квадратов с использованием линейной модели y = bx + a (где х – количество определяемого вещества, у – величина отклика, b – угловой коэффициент, а – свободный член) и рассчитывали коэффициент корреляции r² по экспериментально измеренным значениям переменной у для заданных значений аргументах. Полученные данные, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты оценки параметров линейной зависимости при количественном определении содержания MDP в модельных смесях

Результаты оценки параметров линейной зависимости при количественном определении содержания MDP в модельных смесях показывают, что коэффициент корреляции r², равный 0,9999, отвечает необходимому условию |r| ≥ 0,99, а результаты количественного определения содержания MDP по разработанной методике в растворе препарата «Медроник,^99mТс» могут быть описаны уравнением линейной зависимости y = 0,2966х – 0,0024. Подтверждением данной линейной зависимости исследуемых величин служит также графическое изображение регрессионной прямой (рисунке 2).

Рисунок 2. Регрессионная прямая для количественного определения содержания MDP в растворе препарата «Медроник,^99mТс» методом спектрофотометрии

Правильность методики подтвердили анализом серии модельных смесей, с 70, 80, 90, 100, 110, 120 и 130 % от номинального содержания MDP в растворе препарата «Медроник,^99mТс». На каждом уровне провели 3 определения. Как известно, приемлемыми критериями правильности спектрофотометрической методики являются величина относительной ошибки среднего результата, не превышающая 2,0 %, и отсутствие значимой систематической ошибки. Результаты анализа оценивали, сравнивая полученные результаты с ожидаемым значением величины (содержанием MDP в модельной смеси, мг/мл). Полученные данные приведены в таблице. 2.

Таблица 2.

Результаты оценки правильности методики количественного спектрофотометрического определения содержания MDP в растворе препарата «Медроник, ^99мТс»

Как видно из данных, приведенных в табл. 2, относительная ошибка среднего результата ε = 1,1 % не превышает 2,0 %; результаты находятся в диапазоне доверительного интервала среднего результата анализа (± Δx), который составил 0,8323 ± 0,01, и приближаются к истинному значению. Численное значение коэффициента нормированных отклонений t (коэффициента Стьюдента), рассчитанное по результатам анализа, составило 0,0454. Табличное значение коэффициента Стьюдента при 95 % доверительной вероятности и степени свободы f = 20 равно 2,086, т. е. t_выч < t_табл. (95 %, 20). Все эти данные позволяют считать, что результаты, полученные описанным методом, являются правильными и не отягощены систематической ошибкой.

Прецизионность как и сходимость, и внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность исследовали на однородных образцах. Сходимость методики оценивали по результатам анализов пробы. Анализ проводил один и тот же исследователь в одинаковых условиях с использованием одного и того же спектрофотометра, в течение короткого промежутка времени. Для 3 серий, отличающихся сроком выпуска, выполнено по 10 параллельных определений и проведена статистическая обработка полученных результатов. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Результаты определения сходимости аналитической методики количественного спектро-фотометрического определения содержания MDP в растворе препарата «Медроник, ^99мТс»

Результаты определения сходимости показали, что относительная ошибка среднего результата составила 1,47 %. Доверительный интервал среднего результата анализа (± Δx) составил 0,8337 ± 0,012 мг/мл при Р=0,95. Численное значение коэффициента Стьюдента t(p, f), рассчитанное по результатам анализа 3 выборок, составило 0,097. Табличное значение коэффициента Стьюдента при 95 % доверительной вероятности и степени свободы f = 9 равно 2,2622, т. е. t_выч< t_таб. (95 %, 9). Результаты, полученные данным методом, являются сходимыми и с незначительной систематической ошибкой.

При исследовании внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности анализы проводили 2 сотрудника в разные дни. Результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4.

 Результаты исследования промежуточной прецизионности методики количественного спектрофотометрического определения содержания MDP в препарате «Медроник,^99mТс»

При сравнении результатов, полученных двумя аналитиками, видно, что различия между средними значениями результатов  первого и второго сотрудников незначительны. Относительная ошибка среднего результата для  двух исследователей составила 0,63 %, а доверительный интервал среднего результата анализа (± Δx), мг составил 0,8330±0,0052 мг соответственно.  Численное значение коэффициента Стьюдента t(p, f), рассчитаное по результатам анализов, проведенных двумя аналитиками, составил 0,084 соответственно. Табличное значение коэффициента Стьюдента при 95 % доверительной вероятности и степени свободы f = 9 равно 2,2622, т. е. t_выч< t_таб. (95 %, 9). Следовательно, методика анализа является воспроизводимой.

Заключение

По результатам эксперимента установлено, что разработанная методика валидиции по определению количественного содержания основного действующего вещества в радиофармацевтическом препарате «Медроник,^99мТс» спектрофотомерическим методом является специфичной, в отношении MDP и обеспечена приемлемой правильностью, сходимостью, прецизионностью и линейностью, как при нормальных рабочих концентрациях, так и в экстремальных точках диапазона концентраций.

Список литературы:

1. І. Fogelman. Skeletal uptake of diphosphonate: а review. // Eur.J.Nucl.Med., 1980, N5, pp. 473-476.
2. Littlefield J.L., Rudd Th.G. Tc-99m hydroxymethylene diphosphonate and Tc-99m methylene diphosphonate: biologic and clinical comparison: concise communication// Ј. Nucl. Med. — 1983. - Vol. 24. - Р. 463-466.
3. Spencer R.P., Weiner R., Hosain F. Bone imaging radiopharmaceuticals. // Nuclear Medicine, edited by Henkin R. et all, Vol. II, Mosby-Year Book, 1996, pp. 1125-1140.
4. Subramanian G., McAfee J.G., Blair R.J., Kallfelz F.A., Thomas F.D. Technecium- 99m- methylene diphosphonate- а superior agent for skeletal imaging: comparisom with other technecium complexes.// Ј. Nuc1. Med. — 1975. - Vol. 16. - Р. 744-755.
5. ГОСТ Р 52249-2004. Правила производства и контроля лекарственных средств.
6. МУ 64-04-001-2002. Производство лекарственных средств. Валидация. Основные положения.
7. ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений.
8. Пригодность аналитических методов для конкретного применения. Руководство для лабораторий по валидации методов и смежным вопросам. Б. Магнуссон, У. Эрнемарк. Киев 2016. Второе издание ООО «Юрка Любченко»
9. ОФС.1.1.0012.15. Валидация аналитических методик.
10. Рекомендации по межгосударственной стандартизации РМГ 61— 2010.