ИЗУЧЕНИЕ МИКРОБИОМА ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

АННОТАЦИЯ

Изучен микробиом пищеварительной системы крупного рогатого скота. Определены морфологические характеристики бактериальных изолятов, выделенных из рубца, слюны и сычуга. Из пищеварительной системы крупного рогатого скота было выделено 16 бактериальных изолятов, и на основании их морфологических характеристик были идентифицированы кокки и палочковидные бактериальные изоляты. Выделенные палочковидные бактериальные изоляты были спорообразующими аэробными или факультативно анаэробными, грамположительными, производили только одну спору на клетку и были устойчивы к различным внешним воздействиям. Толщина палочек варьировалась от 0,3 до 10 (мкм), а длина -от 2 до 8 (мкм) и были идентифицированы Bacillus sp.

ABSTRACT

The microbiome of the digestive system of cattle was studied. The morphological characteristics of bacterial isolates obtained from the rumen, saliva, and abomasum were determined. A total of 16 bacterial isolates were isolated from the digestive system of cattle and, based on their morphological characteristics, cocci and rod-shaped bacterial isolates were identified. The isolated rod-shaped bacterial isolates were spore-forming, aerobic or facultatively anaerobic, Gram-positive, produced only one spore per cell, and were resistant to various external influences. The thickness of the rods varied from 0.3 to 10 (μm), and the length from 2 to 8 (μm) and were identified as Bacillus sp.

Ключевые слова: Микробиом, крупный рогатый скот, бактерии, морфология, идентификация, кокк, палочковидные бактерии, Bacillus sp.

Keywords: Microbiome, cattle, bacteria, morphology, identification, coccus, rod-shaped bacteria, Bacillus sp.

Введение

Микробиом - это сообщество микроорганизмов, обитающих в определенной среде [1, 5]. Все экосистемы имеют свое собственное сообщество микробов (микробиом), от тканей и органов отдельных организмов [3, 11] до всей среды обитания [4, 17]. Микробиом участвует в важных экосистемных процессах и вносит вклад в метаболизм хозяина в локальном масштабе [5, 4] и в биогеохимическое преобразование питательных веществ в глобальном масштабе [6, 10]. У жвачных животных микробы обитают на коже, в ротовой полости, в пищеварительной системе и в других местах. Эти микробы необходимы для физиологии животных и их здорового развития [7, 9]. Микробиота пищеварительной системы играет решающую роль в питании животного, синтезируя ферменты, расщепляющие целлюлозу. Полезная микробиота может обеспечить 70% суточной потребности животного в энергии за счет синтеза незаменимых аминокислот и витаминов [8, 11]. Основными факторами, влияющими на изменения микробиоты жвачных животных, могут быть окружающая среда, включая методы кормления и содержания, а также возраст и генетика [9,3]. Микробиота рубца, как динамическая экосистема, изучена наиболее полно. Его микробы взаимодействуют друг с другом во время деградации сложных углеводов в клеточной стенке растений, которые мало используются человеком [10,2]. Симбиотические пищеварительные микробы (рубец и кишечник) играют важную роль во взаимодействии животного и хозяина с окружающей средой, обеспечивая питательными веществами и стимулируя иммунную систему. В этом обзоре мы сосредоточимся на пищеварительных и связанных с выменем микробах, в первую очередь у крупного рогатого скота, наиболее изученного вида жвачных животных. Бактерии являются важным источником целлюлозы для использования в различных отраслях промышленности и биотехнологии [11,5]. Авторы выделили Bacillus sp. из рубца крупного рогатого скота с высоким целлюлозолитическим индексом (7,89). Был выделен штамм SV1. При этом определялась активность эндоглюканазы и β-глюкозидазы -целлюлолитических ферментов, синтезируемых вне клетки. Установлено, что при добавлении КМЦ синтез целлюлазы увеличился в 2,9 раза, а фермента эндоглюканазы – в 2,1 раза [12,10]. В ходе исследований из окружающей среды было выделено 214 штаммов бактерий. Было обнаружено, что они производят целлюлазу методом диффузии [13,6]. Наибольшая целлюлолитическая активность наблюдалась у изолятов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis при температуре 32 ⁰С. Для обоих штаммов были подобраны оптимальные условия для увеличения синтеза целлюлаз [14, 3;15, 4]. Наиболее распространенным соединением углерода в природе является целлюлоза. Неспособность животных и растений расщеплять целлюлозу в целом определяет глобальную роль микроорганизмов в этом процессе. Биомасса, образующаяся в природе в результате фотосинтеза в количестве около 1,5 × 1012 тонн в год, является наиболее распространенным органическим полимером и представляет собой практически неисчерпаемый источник сырья для различных продуктов [16, 7]. Кроме того, гемицеллюлозы, гетерогенная группа полисахаридов, включающая ксиланы, β-глюканы и маннаны, также являются важными компонентами стенок растительных клеток [17, 4]. Богатство и разнообразие микробных популяций в дистальной части пищеварительного тракта ниже по сравнению с таковыми в рубце, при этом наибольшее разнообразие кишечных бактерий наблюдается в толстой кишке [18, 5].

Цель исследований является выделение и изучение морфологических свойств микроорганизмов из пищеварительной системы (рубец, сычуг и слюны) крупного рогатого скота.

Материалы и методы

Образцы были взяты из ротовой полости крупного рогатого скота, из Самаркандской, Джизакской, Навоийской и Андижанской областях. Образцы помещали в предварительно приготовленные в лаборатории жидкие питательные среды и 0,9% солевые растворы и высевали на стерильно приготовленные питательные среды с агаром MRS. Выделение чистых культур аэробных бактерий делится на несколько этапов. На первом этапе из ротовой полости крупного рогатого скота брали мазки и высевали их на заранее приготовленные агаризованные и жидкие питательные среды. Чистые изоляты были выделены общепринятым в микробиологии методом пересева. Окрашено по Грамму и проанализировано под микроскопом. Его помещают в стерильный 0,9% физиологический раствор в пробирках. Отбирают 0,01 мл приготовленной разведенной суспензии, наливают ее в кольцо на поверхность агаризованной среды в чашке Петри и осторожно инокулируют шпателем. Посевной материал должен быть равномерно распределен по всей поверхности среды. После инокуляции чашку Петри переворачивали, маркировали и инкубировали в термостате при температуре 37⁰С в течение 18–24 часов. Микроскопическую структуру выделенных бактериальных изолятов изучали с помощью световых микроскопов XSP-136 B и OLYMPUS BX41 (увеличение в 400 раз). Образцы помещали в заранее приготовленные жидкие питательные среды и 0,9% физрастворы в лабораторных условиях. Их высевали на стерильно приготовленную питательную среду МПБ-агар с интервалом в 5 часов. Для изучения микробиома были взяты образцы из рубца, толстого кишечника и ротовой полости (слюны) у 10 голов крупного рогатого скота из каждого региона. Были выделены 6 бактериальных изолята из рубца и 10 из ротовой полости крупного рогатого скота. Для выделения чистых изолятов микроорганизмов использовали общепринятый в микробиологии метод пересева.

Результаты и их обсуждение

Морфологическая характеристика бактериальных изолятов, выделенных из рубца и ротовой полости крупного рогатого скота. В качестве посевного материала использовали суспензию бактериальных изолятов в концентрации 10⁸ спор/мл, инкубировали при температуре 35-37 ⁰С (in vitro) на питательных средах МПБ и МПА (мясо-пептонный агар) (Hi Media, Индия), в течение 3 суток. Изолят K 1,2x6, выделенный из рубца, морфологически относится к группе палочковидных бактерий. Бесцветная, гладкая на вид грамположительная, имеющая форму палочки толщиной 0,4 (мкм) и длиной от 0,3 до 0,5 (мкм). Его можно классифицировать как аэробные или факультативно анаэробные бактерии. Изолят Q 3.3x3, выявил морфологические особенности, характерные для дрожжей.

Рисунок 1. Бактериальные изоляты из пищеварительной системы крупного рогатого скота

Длина клеток изолята дрожжей составила 1-10 (мкм) и 2-4 (мкм) в длину. От палочковидных бактерий их отличала яйцевидная форма. Изолят Q 3,2x4, грамположительный, относящийся к группе палочковидных бактерий с очень маленькими палочками, с бесцветными и плоскими колониями со палочками толщиной 0,15 (мкм) и длиной от 0,1 до 0,2 (мкм). Изолят S 3,1x6, выделенный из ротовой полости (слюны) КРС, морфологически был охарактеризован как кокки. Кокки-грамположительные, неспорообразующие, неподвижные, сферические бактерии размером от 0,2–0,4 до 4,0–4,5 (мкм). Было обнаружено, что изолят 3.1X6 представляет собой сферический монокок Изолят S 3,2x3 также были обнаружены признаки, характерные для кокков. Следующий изолят S 3,3x6, выделенный из ротовой полости (слюны) КРС, морфологически имел палочковидную форму, имел овальную форму и был очень маленького размера, составлял 0,4 (мкм) в длину и 0,1 (мкм) в ширину. Изолят S 3,5x6 палочковидный, бесцветная, гладкая грамположительная бактерия с палочковидной формы, толщиной 0,3 (мкм) и длиной от 1,5 до 2,0 (мкм). Его можно классифицировать как аэробные или факультативно анаэробные бактерии. Изолят S 4,1X5 грамположительный, принадлежащий к группе палочковидных бактерий, с маленькими палочками толщиной 0,2 (мкм) и длиной 0,5 (мкм), гладкими на вид колониями кремового цвета. Изолят S 3,4x4 морфологически был охарактеризован как кокки. Кокки-грамположительные, не спорообразующие, неподвижные бактерии размером от 0,2–0,4 до 4,0–4,3 (мкм). Изолят бактерии S 3,4x4 оказался шаровидным кокком. При морфологическом исследовании изолята S 7,3x5 также были выявлены признаки, характерные для кокков. Изолят S 5,2x4 был морфологически идентифицирован как палочковидный грамположительный бактериальный изолят. Было обнаружено, что изолят представляет собой бесцветную, плоскую на вид бактериальную палочку очень маленького размера, толщиной 0,25 (мкм) и длиной от 0,3 до 0,5 (мкм) (рисунок 1).

Заключение

Таким образом, для изучения микробиома пищеварительной системы крупного рогатого скота, были выделены и определены 16 бактериальных изолятов из рубца, слюны и сычуга. Определены морфологические характеристики всех выделенных бактериальных изолятов. Исследования показали микробиологическое разнообразие выделенных бактерий как в виде кокков, так и палочковидных бактерий, которые представляют огромный интерес для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований.

Список литературы:

1. Alipour M.J., Jalanka J., Pessa-Morikawa T., Kokkonen T., Satokari R., Hynönen U., Livanainen A., Niku M. The composition of the perinatal intestinal microbiota in cattle // Sci. Rep., -2008.-№ 8, 10437.
2. Auffret M.D., Stewart R., Dewhurst R.J., Duthie C.A., Rooke J.A., Wallace R.J., Freeman T.C., Snelling T.J., Watson M., Roeh R. Genetic capacities and potential mechanisms within the rumen microbiome explaining differences in beef cattle feed efficiency //Front. Microbiol. -2017. -№ 8, -р. 2642.
3. Agnieszka Wita, Wojciech białas, Radosław Wilk, Katarzyna Szychowska and Katarzyna Czaczyk The Influence of Temperature and Nitrogen Source on Cellulolytic Potential of Microbiota Isolated from Natural Environment J Microbiol. -2  019. -№.68 (1). –P. 105–114.
4. Alicia Froidurot and Véronique Julliand. Cellulolytic bacteria in the large intestine of mammals Journal List Gut Microbes. -2022. -№.14 (1).
5. Bergman E.N., Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species // Physiol. Rev. -1990. -№ 70, - р. 567-590.
6. Dirk Gevers, Rob Knight, Joseph F. Petrosino, Katherine Huang, Amy L. McGuire. The Human Microbiome Project: A Community Resource for the Healthy Human Microbiome // PLoS Biology. -2012. -Т. –Р. 8.
7. Ishaq S.L., Alzahal O., Walker N., McBride B., An investigation into rumen fungal and protozoal diversity in three rumen fractions, during high-fiber or grain-induced sub-acute ruminal acidosis conditions, with or without active dry еast supplementation // Front. Microbiol, -2017. -№ 8, -Р. 1943.
8. Mohamad Syazwan Ngalimat, Radin Shafierul Radin Yahaya, Mohamad Malik Al-adil Baharudin, Syafiqah Mohd. Yaminudin Murni Karim, Siti Aqlima Ahmad and Suriana Sabri 1 A Review on the Biotechnological Applications of the Operational Group Bacillus amyloliquefaciens. Microorganisms. 2021. -№. 9 (3), -Р. 614.
9. Curtis T. P., Sloan W. T., Scannell J. W. Estimating prokaryotic diversity and its limits // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2002. -Vol. 99. -P. 10494-10499.
10. Costello E. K., Stagaman K., Dethlefsen L. B., Bohannan J. M., Relman D. A. The Application of Ecological Theory toward an Understanding of the Human Microbiome // Science. -2012. Т. 336., - Р. 1255–1262.
11. Carbonero F., Oakley B.B., Purdy K.J., Metabolic flexibility as a major predictor of spatial distribution in microbial communities // PLoS One, -2014. -№.9, e85105.
12. Sean M Gibbons, Jack A Gilbert. Microbial diversity -exploration of natural ecosystems and microbiomes //Current Opinion in Genetics & Development.-2015-12. -Т.35. -Р. 66-72.
13. Sukumaran R. K., R. R. Singhania, A. Pandey. Microbial cellulases -Production, applications and challenges // J Sci Ind Res.- 2005. - № 64. Р.-832-844.
14. Falkowski P. G., Fenchel T., Delong E. F. The Microbial Engines That Drive Earth's Biogeochemical Cycles // Science. -2008. -Т. 320, -С. 1034–1039.
15. Xavier Raynaud, Naoise Nunan. Spatial Ecology of Bacteria at the Microscale in Soil // PLoS ONE / Francesco Pappalardo. -2014. -Vol. 9. -P. 87217.
16. Honan M.C., Greenwood S.L., Characterization of variations within the rumen metaproteome of Holstein dairy cattle relative to morning feed offering //Sci. Rep., -2020.-№.10. -Р. 3179.
17. Chen H. Sequencing of a 1,3-1,4-β-Dglucanase (lichenase) from the anaerobic fungus Orpinomyces strain PC-2: Properties of the enzyme expressed in Escherichia coli and evidence that the gene has a bacterial origin / // J Bacteriol. -1997. -№ 179. -Р. 6028-6034.
18. Шмидт К. Н., Худайгулов Г.Г. Выделение новых штаммов-деструкторов целлюлозы, их роль в снижении антропогенной нагрузки на экосистему // Bulletin of the South Ural State University.Ser. Food and Biotechnology. - 2016, -V. № 4, pp. 54–63.