ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ РАСТОРОПШИ ПЯТНИСТОЙ (Silybum marianum (L.) Gaertn)

АННОТАЦИЯ

Целью исследования являлась оценка антимикробной активности белковых фракций, выделенных из семян Silybum marianum (L.) Gaertn. Белки экстрагировали, очищали с использованием ионообменной хроматографии (DEAE-целлюлоза, CM-TSK 650 M), и разделяли на восемь фракций. Обессоливание проводили на сефадексе G-10. Фракции были охарактеризованы методом хромато-масс-спектрометрии, по результатам которого установлено наличие низкомолекулярных соединений (2500–6000 Да). Антимикробную активность оценивали в отношении ряда патогенных штаммов. Наиболее активные фракции ингибировали рост Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и других микроорганизмов, превышая эффективность грамицидина. Полученные данные демонстрируют потенциал белковых компонентов расторопши как перспективного источника новых антимикробных средств.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of protein fractions isolated from Silybum marianum (L.) Gaertn seeds. Proteins were extracted and purified using ion-exchange chromatography (DEAE-cellulose, CM-TSK 650 M) and separated into eight fractions. Desalting was performed on Sephadex G-10. The fractions were characterized by chromatographic mass spectrometry, which revealed the presence of low-molecular-weight compounds (2500–6000 Da). Antimicrobial activity was assessed against a range of pathogenic strains. The most active fractions inhibited the growth of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and other microorganisms, surpassing the efficacy of gramicidin. The results demonstrate the potential of milk thistle protein components as promising sources of new antimicrobial agents.

Ключевые слова: Silybum marianum L. Gaertn., белковые фракции, антимикробная активность, ионообменная хроматография, хромато-масс-спектрометрия.

Keywords: Silybum marianum L. Gaertn, protein fractions, antimicrobial activity, ion-exchange chromatography, chromatographic mass spectrometry.

Введение

В последние годы особый интерес представляют лекарственные препараты растительного происхождения, обладающие широким спектром фармакологической активности.  Огромный профилактический и лечебный потенциал заложен в растительных препаратах, на основе расторопши пятнистой – Silybum marianum (L.) Gaertn. семейства Астровых (Asteraceae).  На основе трех веществ – силибина, силидианина и силикристина, флавоноидов, выделенных из расторопши пятнистой, созданы такие гепатопротекторные препараты как «Силимарин», «Легалон», «Карсил», «Силимар» [3, с.65; 4, с.218; 2, с.37].

Эти препараты обладают антиоксидантными, противовоспалительными, антифибротическими, противоопухолевыми, антитоксическими свойствами, а также ускоряют регенерацию клеток печени путем повышения синтеза белка в поврежденной печеночной ткани, что говорит о гепатопротекторных свойствах [1, с.37]. У ряда представителей семейства Астровых уже были выделены и охарактеризованы белково-пептидные фракции, обладающие антимикробной активностью [7, с.257], однако расторопша пятнистая в этом аспекте мало изучена. 

Целью данной работы стало выделение и исследование белковых фракций, выделенных из семян расторопши пятнистой – Silybum marianum (L.) Gaertn, определение их антимикробной активности против ряда патогенов человека.

Белково-пептидные фракции способны образовывать в липосомах ион-проницаемые поры, различающиеся по размерам и продолжительности существования. После проникновения через внешнюю мембрану, они связываются с отрицательно заряженной поверхностью цитоплазматической мембраны, далее они либо формируют мицеллоподобный комплекс, проходящий через мембрану, либо проскакивают через мембрану под действием трансмембранного электрического потенциала.

Материалы и методы

В исследованиях был использован измельченный обезжиренный шрот расторопши пятнистой Silybum marianum (L.) Gaertn. Выделение белков осуществлялось методом кислотной экстракции с использованием 10%-ной уксусной кислоты. Для осаждения белков применяли холодный ацетон, после чего образовавшийся осадок подвергался центрифугированию 3000 оборотов в течении 10 мин и высушиванию лиофильным способом.

Полученную сумму белков растворяли в 0,05 М ацетатном буфере pH 9,0 и подвергали ионообменной хроматографии на колонке с Servacel DEAE (2,5 × 15 см), уравновешенной тем же буфером. Фракции, не адсорбировавшиеся на сорбенте, рассматривались как основные белки. Для их дальнейшей очистки элюат доводили до pH 6 с помощью 0,1 М HCl и загружали на колонку с СМ-TSK 650 M (2,5 × 18 см), предварительно уравновешенную 0,05 М ацетатом аммония pH 6,0. Связанные с сорбентом белки элюировали градиентом NaCl от 0 до 1М в 0,05 М ацетате аммония pH 6,0 при скорости потока 0,5 мл/мин.

Для удаления низкомолекулярных примесей и обессоливания каждая из полученных фракций подвергалась гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-10, уравновешенной 0,05 М фосфатным буфером pH 7,4. Выделенные соединения лиофилизировали, измеряли массу сухого остатка. Концентрация белка в образцах оценивалась методом Бредфорда с использованием стандартного калибровочного графика для бычьего сывороточного альбумина (BSA).

Выделенные фракции были охарактеризованы с помощью хромато-масс-спектрометрического анализа на приборе CHIP-Q-TOF LC-MS Agilent Technologies серии 6520В [5, с.5]. Источник ионизации: ESI+, поток осушающего газа: 4 л/мин, температура осушающего газа: 350°C, напряжение на конус скиммера: 65V, на фрагменторе 175V, диапазон масс: в режиме MS 300–3000 m/z. Способ ионизации: положительный.

Образцы наносили на колонку при помощи автосэмплера Agilent Technologies серии 1200 в объёме 2 мкл. Ввод осуществлялся через Zorbax SB C18, 5 µm, 75мкм x 43 мм.

Мобильная фаза состояла из:

фаза A - 0,1% раствор муравьиной кислоты;

фаза B - ацетонитрил с добавлением 0,1% муравьиной кислоты.

Нанесение осуществляли на приборе Agilent Technologies серии 1260 Cap Pump при скорости потока 4 мкл/мин. Элюцию осуществляли на приборе Agilent Technologies серии 1260 Nano Pump при скорости потока 0.6 мкл/мин. Градиент концентрации раствора В – минутах: 20% - 3 мин, 80% - 30 мин 20% - 35 мин. Все растворы предварительно дегазировали на приборе Agilent Technologies 1260 µ-degasser.

Определение антимикробной активности

Для изучения антимикробной активности белковых фракций, полученных из семян Silybum marianum (L.) Gaertn., образцы лиофилизировали, измеряли массу сухого остатка и растворяли в стерильной дистиллированной воде до необходимой концентрации. Тестирование проводили методом радиальной диффузии в агаризованной среде LB, модифицированным для микробиологических исследований [9].

В качестве тест-объектов использовали культуры грамположительных Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Actinomyces spp., и грамотрицательных микроорганизмов: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa. Суточные культуры выращивали в жидкой среде LB, после чего равномерно наносили на поверхность LB-агара в чашках Петри. В агаре формировали лунки диаметром 6 мм, в которые вносили по 50 мкл растворов исследуемых образцов в различных концентрациях.

Чашки инкубировали при температуре (25±1) °C в течение 48 часов. Антимикробную активность оценивали по диаметру зон подавления роста микроорганизмов вокруг лунок. В качестве отрицательного контроля использовали стерильную воду, в качестве положительного — антибиотик грамицидин в концентрации 50 мкг/мл. Все тесты проводили в трёх независимых повторах. Результаты выражали в миллиметрах с указанием стандартной ошибки среднего значения.

Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК)

Дополнительно для количественной оценки антимикробной активности определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) исследуемых белковых фракций и грамицидина в отношении вышеуказанных штаммов микроорганизмов. Методика основывалась на серийных двукратных разведениях в жидкой среде в 96-луночных планшетах согласно рекомендациям, CLSI [8]. Бактериальные суспензии стандартизировали до плотности 0,5 по шкале МакФарланда и доводили до конечной концентрации 1–2 × 10⁵ КОЕ/мл в лунке. Препараты разводили в питательной среде (бульон Мюллера–Хинтона или его модификации) до концентраций от 0,125 до 64 мкг/мл.

Планшеты инкубировали при 35 ± 1 °C в течение 18–20 часов в атмосфере с 5% CO₂. По завершении инкубации рост микроорганизмов оценивали по оптической плотности при 600 нм с использованием планшетного анализатора EnSpire 2300 Multimode Plate Reader (PerkinElmer, США). МПК определяли, как наименьшую концентрацию вещества, при которой не наблюдалось увеличения оптической плотности по сравнению с отрицательным контролем (среда без бактериального роста). При необходимости количественной оценки степени подавления роста рассчитывали процент ингибирования по формуле:

Где,

 Oп об — оптическая плотность в лунке с тестируемым образцом,

Oп к — среда с микроорганизмами без добавления исследуемого образца,

Oп ин — стерильная среда без инокуляции.

МПК определяли, как наименьшую концентрацию вещества, при которой не наблюдалось увеличения оптической плотности по сравнению с отрицательным контролем, что соответствовало 100% ингибированию роста.

Результаты и обсуждение

В результате проведенной ионообменной хроматографии было получено 8 фракций. Все выделенные фракции подвергли дополнительной очистке с использованием гель-фильтрации на сефадексе G-10, что позволило удалить соли и низкомолекулярные примеси. Анализ концентрации белков показал, что максимальное содержание белка отмечено в 3-й и 5-й фракциях.

Определение молекулярной массы белков, содержащихся в этих фракциях, проводили на приборе Agilent 1200 с нано проточной LC системой, соединенной с масс-спектрометром CHIP-Q-TOF Agilent Technologies серии 6520В (рис.1).

Рисунок 1. Элюционная диаграмма разделения фракции 3 в режиме MS

По результатам масс-спектрометрического анализа установлено, что активные фракции содержат преимущественно низкомолекулярные белки с молекулярной массой в диапазоне 2500–6000 Да. Хроматографические профили демонстрируют наличие множества пиков, соответствующих одно заряженным компонентам белковой матрицы, что свидетельствует об эффективности предварительного фракционного разделения.

Элюированные фракции анализировали методом хромато-масс-спектрометрии в следующих условиях: источник ионизации — ESI+; поток осушающего газа — 4 л/мин; температура — 350 °C; напряжение на конусе-скиммере — 65 V, на фрагменторе — 175 V; диапазон масс в режиме MS — 300–3000 m/z, в режиме MS/MS — 50–2500 m/z; напряжение на капилляре — 1800–2500 V; способ ионизации — положительный [6, с.3].

В ходе анализа белковых фракций выявлено значительное количество одно заряженных компонентов, входящих в состав низкомолекулярной белковой матрицы (рис.2).

Рисунок 2. Хромато-масс-спектрометрический профиль белковой фракции 3

Для более точного определения состава и структуры активных белков был проведен хромато-масс-спектрометрический анализ. Результаты анализа показали наличие низкомолекулярных белков с молекулярной массой от 2500 до 6000 Да (Таблица 1).

Таблица 1.

Молекулярные массы низкомолекулярных белков, выделенных из фракций

Проведённая оценка антимикробной активности белковых фракций, выделенных из семян Silybum marianum расторопши пятнистой, выявила наличие ингибирующего действия в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Согласно данным таблицы 2-3, исходный экстракт обладал слабовыраженной активностью, зоны подавления 5-10 мм, МПК 250 мкг/мл и служил отправной точкой для сравнения активности отдельных фракций.

Таблица 2.

 Антимикробная активность белковых фракций Silybum marianum в отношении грамположительных бактерий (зоны ингибирования роста, мм; МПК, мкг/мл)

Таблица 3.

Антимикробная активность белковых фракций Silybum marianum в отношении грамотрицательных бактерий (зоны ингибирования роста, мм; МПК, мкг/мл)

Наибольшую чувствительность отмечена к фракциям расторопши пятнистой 1, 2, 3 и 6, при этом их зоны подавления роста превышали 15 мм. Фракции проявили активность по отношению грамположительным бактериям Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus и Streptococcus pyogenes. Так, фракции 1, 3 и 6 продемонстрировали зоны ингибирования роста до 17 мм в отношении S. aureus, а фракция 2 оказалась наиболее эффективной против Staphylococcus saprophyticus 25 мм. Actinomyces также оказался чувствителен к ряду фракций, до 15 мм для фракции 8.

Наиболее выраженное антимикробное действие продемонстрировали фракции 2, 3, 5 и 6. В частности, фракция 2 обладала высокой активностью против Staphylococcus saprophyticus имея зону подавления 25 мм и МПК 15,6 мкг/мл, что превышало эффективность контрольного антибиотика грамицидина по отношению к данному штамму. Аналогично, фракции  3 и 5 проявили активность против Pseudomonas aeruginosa, продемонстрировав зоны ингибирования 17 и 15 мм при МПК 31,2 мкг/мл, соответственно.
Фракция  6 показала широкий спектр действия, эффективно подавляя рост S. aureus, S. saprophyticus, S. pyogenes, E. coli и Actinomyces spp., при этом значения МПК варьировали от 31,2 до 125 мкг/мл. Эти данные свидетельствуют о наличии в составе данной фракции комплексов белков, обладающих способностью подавлять наиболее адаптированные к внешним воздействиям микроорганизмы или их видоизмененные формы.

Следует подчеркнуть, что фракции 3 и 4 не продемонстрировали антимикробной активности в отношении штаммов S. saprophyticus, P. vulgaris, Klebsiella spp. что, может быть связано с низкой их концентрацией. Напротив, грамицидин, несмотря на известную эффективность в отношении грамположительных бактерий, оказался неактивен против нескольких тест-штаммов, в частности E. coli, P. vulgaris, S. pyogenes и Actinomyces spp.
Таким образом, полученные результаты демонстрируют потенциал белковых фракций расторопши как источника биологически активных веществ с избирательной антимикробной активностью, в том числе в отношении микроорганизмов, устойчивых к традиционным антибиотикам. Эти данные обосновывают необходимость дальнейшей биохимической характеристики активных компонентов и изучения механизмов их действия.

Заключение

В ходе проведенного исследования были выделены и изучены белки Silybum marianum L. Gaertn. Данные исследования показали, что белковые фракции расторопши пятнистой обладают антимикробной активностью, выраженность которой варьирует в зависимости от штамма микроорганизма и состава фракции. Наиболее активные фракции 2, 3, 5, 6 продемонстрировали зоны ингибирования 15–25 мм и МПК в диапазоне 15,6–125 мкг/мл, что сопоставимо или превосходит активность грамицидина по ряду показателей.

Установлено наличие действия в отношении как грамположительных (Staphylococcus spp., Streptococcus pyogenes, Actinomyces spp.), так и грамотрицательных микроорганизмов (E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp.), что свидетельствует о широком спектре антимикробной активности некоторых фракций. Полученные данные подтверждают перспективность использования белков расторопши пятнистой в качестве основы для разработки новых антимикробных средств природного происхождения.

Хромато-масс-спектрометрический анализ показал, что активные фракции содержат низкомолекулярные соединения с массой от 2500 до 6000 Да, что способствует их проникновению через клеточные мембраны бактерий и нарушению их жизнедеятельности.

Таким образом, данное исследование подтверждает, что белки из расторопши пятнистой могут стать основой для разработки новых антимикробных препаратов. Дальнейшие исследования должны быть направлены на детальное изучение механизмов их действия, оценку токсичности и разработку методов массового производства для фармацевтического использования.

Список литературы:

1. Брель Ю. И., Лызиков А. Н., Питкевич Э. С. Препараты расторопши: механизмы действия и применение при заболеваниях печени // Проблемы здоровья и экологии. — 2009. — № 4 (22). — С. 36–42.
2. Матвеев А. В., Коняева Е. И., Курченко В. П., Щекатихина А. С. Гепатопротективные свойства силимарина // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2011. — № 2. — С. 130–137.
3. Сарибаева Д. А., Холдарова Г. А. Исследование процессов получения функциональных напитков на основе экстракта расторопши (Silybum marianum L.) // Universum: технические науки. — 2022. — № 11 (104). — DOI: 10.32743/UniTech.2022.104.11.14641.
4. Щекатихина А. С., Власова Т. М., Курченко В. П. Получение биологически активных веществ из семян расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.)) // Труды БГУ. — 2008. — № 1. — С. 218–228.
5. Gros Q., Wolniaczyk M., Duval J. et al. Facilitated on-line supercritical fluid extraction – supercritical fluid chromatography for nonpolar and polar compounds from milk thistle seeds // J. Chromatogr. — 2023. — Vol. 1705. — Article 464168. — DOI: 10.1016/j.chroma.2023.464168.
6. El-Banna A. A., Ibrahim R. S. Metabolic profiling of milk thistle different organs using UPLC-TQD-MS/MS coupled to multivariate analysis in relation to their selective antiviral potential // BMC Complement. Med. Ther. — 2024. — Vol. 24, No. 1. — P. 115. — DOI: 10.1186/s12906-024-04411-7.
7. Osborn R. W., De Samblanx G. W., Thevissen K. et al. Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae // FEBS Lett. — 1995. — Vol. 368, No. 2. — P. 257–262. — DOI: 10.1016/0014-5793(95)00666-w.
8. Franklin R. C., Matthew A. W., Jeff A. et al. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard. 9th ed. — Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2012. — Vol. 32, No. 2.
9. Wayne P. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 9th informational supplement. — Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), 2009. — Vol. 29, No. 3.