ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА В УФ ОБЛУЧЕННЫХ ЭРИТРОЦИТАХ

АННОТАЦИЯ

Цель статьи заключается в рассмотрении вопросов фотоокисления гемоглобина в составе эритроцитов под воздействием УФ-излучения. Обсуждаются основные механизмы фотоокисления гембелка, а также влияние УФ-света на структуру и функцию данного биополимера. Показано, что УФ-облучение эритроцитов вызывает накопление в них метгемоглобина, приводит к гемолизу с выходом гембелка в раствор, где его оксигенированная форма также подвергается последующему фотоокислению. Полученные результаты могут быть полезны для дальнейшего изучения влияния УФ-излучения на структурно-функциональные свойства производных гемоглобина в составе эритроцитарной клетки.

ABSTRACT

The purpose of the article is to consider the issues of photooxidation of hemoglobin in erythrocytes under the influence of ultraviolet radiation. The main mechanisms of photooxidation of hembelk, as well as the effect of ultraviolet radiation on the structure and functions of this biopolymer, are discussed. It has been shown that ultraviolet irradiation of erythrocytes causes the accumulation of methemoglobin in them, leads to hemolysis with the release of hemoglobin into a solution, where its oxygen-saturated form also undergoes subsequent photooxidation. The results obtained may be useful for further study of the effect of ultraviolet radiation on the structural and functional properties of hemoglobin derivatives in the erythrocyte cell.

Ключевые слова: гемоглобин, эритроциты, спектр поглощения, УФ-облучение, оксигемоглобин, метгемоглобин.

Keywords: hemoglobin, erythrocytes, absorption spectrum, UV radiation, oxyhemoglobin, methemoglobin.

Введение

Гемоглобин является ключевым белком в эритроцитах и отвечает в организме за доставку кислорода от легких к тканям. Его способность связываться с этим газом определяет функциональную роль данного гемопротеида в дыхательной системе.

Гемоглобин представляет собой сложный глобулярный белок, состоящий из четырех полипептидных цепей – двух α- и двух β-цепей, каждая из которых содержит гем [3; 5]. Молекулярная масса гемоглобина человека оставляет приблизительно 66.8 кДа [2; 4]. Гем, способный к связыванию лигандов, занимает около 4 %, на белковую часть – глобин приходится 96 % [4; 6].

В организме существуют различные лигандные формы этого белка. Дезокси- и оксигемоглобин важнейшие из них. Эти формы гемоглобина обладают различными оптическими и химическими свойствами, что играет важную роль в их реакции на воздействие УФ-излучения.

Под воздействием различных факторов окружающей среды, таких как ультрафиолетовый свет, гемоглобин может подвергаться различным изменениям. Одним из таких процессов является его фотоокисление, которое влияет на структурно-функциональное состояние данного белка и может приводить к нарушениям функционирования эритроцита и кислородтранспортной системы крови в целом [1].

Фотоокисление гемоглобина происходит при взаимодействии молекул гемоглобина с УФ-излучением, что приводит к возбуждению электронов в молекуле белка. Это может вызывать образование свободных радикалов и активных форм кислорода, которые, в свою очередь, могут повреждать структуру этой макромолекулы [7]. В случае оксигемоглобина фотоокисление приводит к накоплению метгемоглобина и также может приводить к разрушению хромофоров, окислению боковых цепей аминокислот, в том числе, может вызывать разрыв пептидных связей и денатурацию белка. Под воздействием УФ-света также могут происходить и менее значительные изменения, в частности, в конформации гемоглобина, что влияет на его функциональные характеристики, такие как связывание и высвобождение кислорода.

Однако несмотря на большой накопленный объем знаний в этой области исследований, тем не менее, остаются вопросы в области понимания взаимосвязи фотоокисления оксигемоглобина и, в частности, пероксидного окисления липидов при нарушении структурной целостности эритроцитарной мембраны и эритроцита в целом.

В данной работе изучается влияние УФ-излучения на гемоглобин в составе эритроцитов и анализируется роль оксигемоглобина в нарушении целостности эритроцитарной мембраны, приводящей к гемолизу клетки.

Материалы и методы

Объектом исследования выступали эритроцитарные клетки в изотоническом растворе NaCl, инкубированные в естественной атмосфере (содержание кислорода 21 %); гемоглобин человека, выделенный из нативных и УФ-облученных эритроцитов, а также из супернатанта лизированных клеток после воздействия УФ-излучения.

Электронные спектры поглощения регистрировали, используя UV/VIS спектрофотометр Shimadzu UV–2550PC (Shimadzu, Япония) со спектральным диапазоном 350–650 нм.

Суспензию эритроцитов облучали лампой VL-4.C (Vilber Lourmat, Франция) мощностью 4 Вт, являющейся источником квазимонохроматического света с длиной волны 254 нм. Интенсивность излучения на 15 см от кюветы с образцом составляла 340 мкВт/см². Перемешивание взвеси клеток осуществлялось с помощью магнитной мешалки с электронным управлением BIG SQUID (IKA, Германия).

Обработку данных проводили с использованием программного обеспечения UVProbe (Shimadzu, Япония) и Microsoft 365 Copilot (Microsoft, США).

Результаты и обсуждение

Как следует из представленных данных (рисунок 1, поз. 1), спектры поглощения суспензии эритроцитов характеризуются полосами светопоглощения с максимумами, характерными для оксигемоглобина: α-, β- и γ-полоса (или полоса Соре). Однако рассеивание света и «эффект сита» эритроцитарными клетками снижают выраженность этих экстремумов. Эффект «сита» сглаживает пики, а рассеяние света создает кажущееся поглощение образцом. И, хотя эти факторы усложняют анализ, собственно, спектров поглощения белков, и гемоглобина, в частности, тем не менее они могут быть использованы при оценке изменений положения максимумов поглощения в спектрах светопоглощения гемоглобина в составе эритроцитов.

В результате центрифугирования суспензии эритроцитов нами был получен супернатант, спектр которого представлен на рисунке 1 (контроль 2, поз. 2). Данный спектр соответствует поглощению оксигемоглобина. Этим результатом продемонстрирован незначительный лизис эритроцитарных клеток, что использовано нами в качестве контроля условного «нулевого» гемолиза для последующих экспериментов. Проводя гемолиз клеток дистиллированной водой в объеме удаленного супернатанта, мы также получили после осаждения эритроцитарной стромы раствор оксигемоглобина, который стал контролем условного 100 % гемолиза (контроль 1, поз. 3). Это позволило нам оценивать степень лизиса эритроцитарных клеток в ходе эксперимента.

На рисунке 2 (левая панель) показаны спектры поглощения суспензии УФ-облученных эритроцитов со временем экспозиции 0 (контроль), 10, 20 и 40 минут. Показано, что УФ-облучение клеток приводит к накоплению в них метгемоглобина, что может быть оценено по характерному смещению полосы Соре в сторону меньших значений длин волн от 417.4 нм (контроль, преимущественно оксигемоглобин) до 408.8 нм (облучение 40 мин), а также уменьшению амплитуды пиков α- и β-полос. Смещение спектров друг относительно друга по оси ординат указывает главным образом на варьирование количества клеток в объеме кюветы и не мешает оценке положения пиков полос поглощения.

Рисунок 1. Спектры поглощения суспензии эритроцитов – 1; гемоглобина, контроль 1 (супернатант лизированных дистиллированной водой эритроцитов) – 2; гемоглобина, контроль 2 (супернатант нелизированных нативных эритроцитов) – 3

Регистрация спектров поглощения супернатанта УФ-облученных эритроцитов продемонстрировала их гемолиз (рисунок 2, правая панель). Однако степень гемолиза эритроцитов при облучении в течение 10 и 20 минут была сопоставима с контрольным измерением. Напротив, увеличение времени экспозиции до 40 минут показала выраженный лизис эритроцитарных клеток. Кроме этого, наблюдается зависимость степени накопления метгемоглобина от времени облучения эритроцитарных клеток. Смещение полосы Соре для супернатанта более выражено (рисунок 2, правая панель) до 406.2 нм (облучение 40 минут), чем для суспензии клеток – 408.8 нм (рисунок 2, левая панель).

Проводя сопоставление со спектром поглощения контрольной суспензии супернатанта эритроцитов (рисунок 1, поз. 2), следует отметить, что УФ-излучение, как полагают авторы данной статьи, в первую очередь приводит к накоплению метгемоглобина в суспензии эритроцитов с их последующим лизисом. По всей видимости поглощение оксигемоглобином УФ-квантов света вызывает возбуждение π-электронов системы гема с последующим отрывом молекулы кислорода от атома железа, окислению последнего и образованию супероксидного анион-радикала. Так как супероксид анион-радикал может спонтанно и быстро дисмутировать в пероксид водорода и синглетный кислород [7], то дальнейшим объектом его атаки могут выступать различные компоненты клетки, включая мембрану за счет образующихся активных форм кислорода. Это в свою очередь может запускать пероксидное окисление липидов, вызывая дальнейшее повреждение мембраны и клетки в целом. В конечном итоге, накапливаемые повреждения и дезорганизация метаболизма эритроцитов может приводить к их последующему гемолизу.

Рисунок 2. Слева: спектры поглощения суспензии УФ-облученных эритроцитов; справа: спектры поглощения супернатанта суспензии УФ-облученных эритроцитов; время экспозиции представлено в мин: 0 (контроль) – 1, 10 – 2, 20 – 3 и 40 – 4

Заключение и выводы

В данной работе было проведено исследование спектров поглощения окси- и метгемоглобина в суспензии УФ-облученных эритроцитарных клеток. В ходе настоящих исследований показано, что воздействие УФ-излучения на суспензию эритроцитарных клеток, прежде всего, зависит от наличия кислорода связанного с гемовым железом белка. УФ-облучение суспензии эритроцитарных клеток, содержащих оксигемоглобин, вероятно, вызывает, в первую очередь, его окисление до метгемоглобина без сколько-нибудь значимого лизиса эритроцитарных клеток. Отрыв в оксигемоглобине электрона железа лигандированным кислородом превращает последний в супероксидный анион-радикал, который опосредованно вызывает структурную дезорганизацию эритроците и сбои в метаболизме. Это приводит к лизису клетки и выходу его содержимого в раствор, где также происходит дальнейшее окисление оксигемоглобина в этом растворе.

Таким образом, исследование спектров поглощения некоторых производных гемоглобина в суспензии УФ-облученных эритроцитарных клеток является актуальной и важной задачей в биомедицинской науке. Полученные результаты могут быть использованы для более глубокого понимания механизмов, связанных с изменением свойств гемоглобина под воздействием УФ-излучения, и для разработки новых методов диагностики и лечения заболеваний, связанных со свойствами гемоглобина. Это открывает новые перспективы для дальнейших исследований в этой области.

Список литературы:

1. Артюхов В.Г. Анализ физико-химических и функциональных свойств гембелков, УФ-облученных в присутствии серотонина // Успехи физиологических наук. – 1994. – Т. 25. –  № 1. – С.43–44.
2. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. – М.: Высшая школа, 1989. – 190 с.
3. Иржак Л. И. Гемоглобины и их свойства. – М.: Наука, 1983. – 150 с.
4. Коржуев П. А. Гемоглобин. Сравнительная физиология и биохимия. – М.: Наука, 1964. – 287 с.
5. Ленинджер А.Л. Основы биохимии. – М.: Мир, 1985. – Т.1. – 365 с.
6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В.  Биохимия человека. – Т. 1. – М.: Мир, 1993. – 384 с.
7. Ткачук В.А., Тюрин-Кузьмин П.А., Белоусов В.В., Воротников А.В.  Пероксид водорода как новый вторичный посредник // Биологические мембраны. – 2012. – Т. 29. – № 1-2. – С. 21–37.