ВЛИЯНИЕ БИОСТИМУЛЯТОРА НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КАРТОФЕЛЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ In vitro

АННОТАЦИЯ

Технология получения безвирусного семенного картофеля требует постоянного усовершенствования, особенно на биотехнологических этапах — от in vitro культивирования до адаптации к почвенным условиям. Цель исследования — изучить влияние различных концентраций препарата ДАГ-1 на антиоксидантную систему картофеля сорта "Эволюшен" при размножении in vitro. Экспланты выращивали на среде MS с добавлением ДАГ-1 (10⁻⁵ – 10⁻⁸ М). Оценивалась активность пероксидазы, аскорбатпероксидазы, уровень перекиси водорода и малондиальдегида как маркеров окислительного стресса. Высокие концентрации ДАГ-1 снижали уровень H₂O₂ и малондиальдегида, демонстрируя антистрессовое действие. Пероксидаза играла ключевую роль в нейтрализации активных форм кислорода, тогда как аскорбатпероксидаза активизировалась при низких дозах ДАГ-1, обеспечивая дополнительную защиту. Таким образом, ДАГ-1 способствует активации защитных механизмов, снижает клеточные повреждения и стабилизирует клеточные структуры. Полученные данные позволяют рассматривать ДАГ-1 как перспективный биостимулятор для применения в in vitro культивировании и размножении картофеля.

ABSTRACT

The technology for producing virus-free seed potatoes requires constant improvement, particularly at the biotechnological stages — from in vitro cultivation to adaptation to soil conditions. The aim of the study is to investigate the effect of different concentrations of the biostimulant DAG-1 on the antioxidant system of the potato cultivar "Evolution" during in vitro propagation. Explants were cultivated on MS medium supplemented with DAG-1 (10⁻⁵ – 10⁻⁸ M). The activity of peroxidase and ascorbate peroxidase, as well as the levels of hydrogen peroxide and malondialdehyde, were assessed as markers of oxidative stress. High concentrations of DAG-1 reduced the levels of H₂O₂ and malondialdehyde, demonstrating its anti-stress effect. Peroxidase played a key role in neutralizing reactive oxygen species, while ascorbate peroxidase was activated at low doses of DAG-1, providing additional protection. Thus, DAG-1 contributes to the activation of defense mechanisms, reduces cellular damage, and stabilizes cellular structures. The obtained data suggest that DAG-1 is a promising biostimulant for use in in vitro cultivation and propagation of potatoes.

Ключевые слова: картофель, in vitro, микроклон, микроклубни, пероксидаза, перекись водорода, малоновый диальдегид.

Keywords: potato, in vitro, microclone, microtuber, peroxidase, hydrogen peroxide, malondialdehyde.

Введение

Клубни картофеля (Solanum tuberosum L.), используемые для посадки, могут содержать скрытые патогены, которые впоследствии снижают всхожесть, энергию растений, качество урожая и урожайность [1].

Технология производства безвирусного семенного картофеля требует постоянного совершенствования. На сегодняшний день актуальна разработка способов повышения эффективности всех биотехнологических процессов — от выращивания in vitro до адаптации растений к почве. При размножении in vitro генотипов картофеля применение препаратов нового поколения природного происхождения позволяет получить оригинальный семенной материал, устойчивый к биотическим и абиотическим стрессам. Эффективность действия этих природных биостимуляторов оценивается по физиологическим и биохимическим показателям, и они рекомендуются с учётом адаптивности каждого генотипа картофеля к различным стрессовым факторам.

Как известно, антиоксидантные ферменты играют важную роль в защите клеток растений, особенно в защите от окислительного стресса, возникающего в результате повышения уровня активных форм кислорода (АФК) и других свободных радикалов. Основные антиоксидантные ферменты, участвующие в защитных механизмах клеток, нейтрализуют вредные вещества и защищают клеточные структуры от повреждений. Целью исследования являлась оценка антиоксидантного статуса in vitro картофеля при различных концентрациях стимулятора в питательной среде.

Материалы и методы

В ходе работ исследовали активность ферментов пероксидазы (ПО), аскорбатпероксидазы (АПО), а также содержание перекиси водорода (H₂O₂) и малондиальдегида (МДА) in vitro картофеля сорта "Эволюшен" из уникального объекта "Биотехнологической коллекции картофеля" Института биоорганической химии имени академика О.С. Садыкова АН РУз. В качестве стимулятора в питательной среде применялись различные концентрации препарата ДАГ-1 (супрамолекулярный комплекс глицирризиновой и салициловой кислот) (разработка Института биоорганической химии им. акад. О.С. Садыкова АН РУз) — 10⁻⁵, 10⁻⁶, 10⁻⁷ и 10⁻⁸ М. В состав среды MS были добавлены отдельно концентрации стимулятора ДАГ-1 — 10⁻⁵, 10⁻⁶, 10⁻⁷ и 10⁻⁸ М. В качестве эксплантов использовались междоузлия микроклонов картофеля, которые выращивали на среде Мурасиге-Скуга при условиях освещённости 1500–2000 люкс, температуре 20–22 °C и фотопериоде 16/8 (день/ночь). Для каждого варианта использовали по 40 эксплантов в трёхкратной повторности. Результаты анализировали с помощью программы “Origin 8”.

Микрорастения гомогенизировали в присутствии жидкого азота. Сумму белков экстрагировали 0.1 М фосфатным буфером, рН 6.6, содержащий 0.5 М NaCl (1:3), в течение 1 часа при 4⁰С. Центрифугировали 20 минут при 5000 об/мин. Активность ПО определяли по методу Бояркина [2]. Активность АПО определяли по методу Nakano [3]. Содержание белка определяли по методу Lowry [4]. Содержание МДА оценивали по методу В.В. Рогожина [5]. Определение содержания Н₂О₂ проводили методом Alexieva [6]. Данные были подвергнуты дисперсионному анализу (ANOVA) по программе OriginPro 7.0.

Результаты и обсуждение

Полученные результаты показали, что различные концентрации ДАГ-1, за исключением концентрации 10⁻⁸ М, незначительно индуцировали активность ПО, но при этом активность была выше уровня контроля. ПО показала стабильную активность на средних уровнях концентрации ДАГ-1, что может указывать на достаточную антиоксидантную активность. Снижение активности при 10⁻⁸ М может свидетельствовать о недостаточной активации при низкой концентрации стимулятора. На ряду с ПО одним из основных ферментов антиоксидантной системы растения является АПО [7]. Изучение активности АПО в концентрациях до 10⁻⁷ М оказалась низкой, но резко возрастает при 10⁻⁸ М. АПО может активироваться в ответ на более низкий уровень ДАГ-1 (10⁻⁸ М), что отражает компенсаторный механизм для усиления антиоксидантной защиты (рис.1). Предполагается, что этот скачок активности может быть связан с окислительным стрессом при низкой стимуляции. Подобные феномены ранее были описаны в ряде работ. В частности, показано, что ПО и АПО проявляют различную чувствительность к уровням H₂O₂ и выполняют комплементарные функции в зависимости от характера и силы стресса [8]. В условиях умеренного стресса активируется, преимущественно, ПО, в то время как при более выраженном перекисном окислении, сопровождающемся накоплением H₂O₂ и МДА, активируется АПО как более чувствительный и специализированный фермент.

Рисунок 1. Изменения активности ПО, АПО и содержания МДА, Н₂О₂ в зависимости от концентрации стимулятора ДАГ-1

Уровень Н₂О₂ постепенно повышался с уменьшением концентрации от контрольной группы до 10⁻⁶ М, а затем снижался при 10⁻⁸ М. Результаты анализа показывают, что Н₂О₂, как маркер окислительного стресса, проявляет зависимость от концентрации ДАГ-1. Умеренные концентрации могут поддерживать высокий уровень перекиси, тогда как на самых низких концентрациях происходит его снижение, вероятно, за счет активации других антиоксидантных систем (например, АПО). Согласно стандартному анализу предельных значений, результаты показали значительные изменения при 10⁻⁵, 10⁻⁶ М и 10⁻⁸ М. МДА, как маркер перекисного окисления липидов, снижался на умеренных уровнях стимуляции ДАГ-1, что может указывать на защитный эффект. При этом в 10⁻⁵ - 10⁻⁷ М его количество снижалось, затем незначительно возрастало при 10⁻⁸ М. Легкий рост при 10⁻⁸ М может говорить о повышенном окислительном стрессе при низкой стимуляции, что требует дополнительных механизмов защиты. Из этого следует, что стабильная активность ПО и количество МДА при 10⁻⁵ - 10⁻⁷ М указывает на заметный эффект ДАГ-1 при этих уровнях. Скачок активности АПО при действии 10⁻⁸ М предполагает активный компенсаторный механизм при минимальной стимуляции. Концентрации 10⁻⁵ - 10⁻⁷ М могут быть оптимальны для поддержания баланса между антиоксидантной активностью и окислительным стрессом. Корреляционный анализ выявил зависимость между концентрациями стимулятора и показателями активности ферментов, уровнями МДА и Н₂О₂. (рис. 2).

Рисунок 2. Корреляционная связь между концентрациями ДАГ-1, активностью ПО, АПО и содержанием МДА, Н₂О₂ (цветовая гамма и числовые значения по корреляционному коэффициенту Пирсона представляют силу и направление взаимосвязей)

Проведенный корреляционный анализ указывает, что высокие концентрации ДАГ-1 в среде культивирования картофеля оказывает защитное действие, снижая уровень окислительного стресса (снижение Н₂О₂ и МДА). ПО играет ключевую роль в этом процессе, так как её высокая активность связана с уменьшением повреждений липидов и снижением уровня Н₂О₂. Наблюдаемая отрицательная корреляция между этими показателями может указывать на прямое участие ПО в утилизации перекиси водорода, что согласуется с исследованиями Hasanuzzaman и другие [9]. АПО и ПО функционируют как основные антиоксидантные ферменты, но в зависимости от условий они «работают» по-разному. ПО наиболее активна при высоких концентрациях ДАГ-1, тогда как АПО активна, когда концентрация ДАГ-1 низкая и требуется больше защиты от АФК. Между активностью АПО и содержанием МДА выявлена положительная корреляция. При низкой концентрации ДАГ-1 уровень МДА возрастает, активность АПО тоже повышается. Это может быть ответом клетки на окислительное повреждение — АПО активируется, чтобы нейтрализовать свободные радикалы и предотвращает дальнейшее повреждение. Такой синергизм между МДА и АПО отражает динамику ответа на окислительный стресс.

Результаты показали, что наибольшая корреляция наблюдается между концентрацией 10^-7 М и уровнем Н₂О₂, при этом корреляция отрицательная, что говорит о снижении уровня Н₂О₂ при уменьшении концентрации стимулятора. Также слабая положительная корреляция наблюдалась с уровнем МДА.

Таким образом, результаты демонстрируют, что разные антиоксидантные ферменты активируются в зависимости от степени и природы окислительного стресса, создавая сбалансированную защитную систему. Это подтверждает целесообразность применения средних концентраций ДАГ-1 для индукции оптимального уровня антиоксидантной активности и повышения стрессоустойчивости растений картофеля.

Вывод. Анализ влияния различных концентраций ДАГ-1 в среде культивирования на антиоксидантные и окислительные показатели картофеля сорта «Эволюшен» выявил, что ключевым фактором является уровень пероксида водорода, который демонстрирует положительную корреляцию с концентрацией ДАГ-1. Таким образом, исследование демонстрирует, что ДАГ-1 в концентрации 10⁻⁷ М можно считать оптимальным, так как на этом уровне достигается баланс: уровень пероксида водорода снижается, а активность антиоксидантных ферментов остаётся стабильной.

Список литературы:

1. Thomas-Sharma, S., Abdurahman, A., Ali, S., Andrade-Piedra, J.L., Bao, S., Charkowski, A.O., Crook, D., Kadian, M., Kromann, P., Struik, P.C, Torrance, L., Garrett, K.A., Forbes, G.A. Seed degeneration in potato: The need for an integrated seed health strategy to mitigate the problem in developing countries //Plant Pathology. 2016. - 65 (1), Р. 3-16. https://doi.org/10.1111/ppa.12439
2. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидаз. // Биохимия. - 1951. - Т.16. - № 6. – С.352-355.
3. Nakano Y, Asada K. Hydrogen Peroxide is Scavenged by Ascorbate-specific Peroxidase in Spinach Chloroplasts // Plant and Cell Physiology. 1981. 22:867-880.
4. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J.Biol. Chem. 1951. V.193 - №2. – P. 265.
5. Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Влияние ультрафиолетового облучения семян на процессы перекисного окисления липидов в проростках пшеницы // Биохимия. — 1996. — Т. 61. — № 8. — C. 1432-1439.
6. Alexieva V., Sergiev I., Mapelli S. Karanov E. The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat // Plant, Cell and Environment, .2001. 24 (12). Р-1337-1344.
7. Прадедова Е.В., Нимаева О.Д., Саляев Р.К.// Физиология растений. 2017. Т.64, № 6. С. 433-445. DOI: 10.7868/S0015330317050104
8. Khan M. I. R., Reddy P., Gupta R. (ed.). Advancements in developing abiotic stress-resilient plants: Basic mechanisms to trait improvements. – CRC Press, 2022.
9. Hasanuzzaman M, Fujita M. Plant Responses and Tolerance to Salt Stress: Physiological and Molecular Interventions 2.0. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(21):15740. https://doi.org/10.3390/ijms242115740