К ВОПРОСУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА ЗАЯЦ ТОЛАЙ (Lepus tolai) НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ СОХРАНЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ РЕГИОНА ПРИАРАЛЬЯ

АННОТАЦИЯ

Целью настоящей работы является молекулярно-генетическая характеристика Lepus tolai (Pallas, 1778) видов, принадлежащих к роду Lepus распространенных в Каракалпакстане. Основой для проведения исследования служат специальные методы: хромотография, полимеразная цепная реакция (ПЦР),  электрофорез. Lepus tolai  является идеальным объектом для изучения наиболее актуальных вопросов механизмов выживаемости видов в антропогенно-нарушенных ландшафтах, и на мало изученных пустынных территориях.

ABSTRACT

The aim of this work is to perform molecular and genetic characterization of Lepus tolai (Pallas, 1778), a species belonging to the genus Lepus distributed in Karakalpakstan. The research is based on special methods: chromatography, polymerase chain reaction( PCR), electrophoresis. Lepus tolai is an ideal object for studying the most pressing issues of the mechanisms of survival of species in anthropogenic-disturbed landscapes, and in poorly studied desert territories.

Ключевые слова: Приаралье, молекулярно-генетический анализ, маркеры, полиморфизм ДНК, lepus tolai,сохранение биоразнообразия.

Keywords: the Aral Sea region, molecular genetic analysis, markers, DNA  polymorphism, lepus tolai,biodiversity conservation.

В настоящее время использование молекулярно-генетических маркеров в популяционной генетике является одним из наиболее действенных методов в изучении структуры популяций и взаимодействиях между ними. Исследования полиморфизма ДНК позволили прояснить генетическую изменчивость и структуру популяций многих видов млекопитающих [1; 4].

Современные молекулярные технологии, особенно геномика, уже играют важную роль в охране биоразнообразия.Методы анализа ДНК, аналитические методы и палеоклиматические исследования значительно расширяют наши знания о глобальном распределении генетического разнообразия и о том, как оно развивалось. Такие филогеографические исследования проводятся в арктических, умеренных и тропических регионах с целью поиска общих причинно-следственных связей в полученных генетических закономерностях. Генетическое разнообразие по-разному распределено внутри и между регионами и биотопами и связано с историей климатических изменений в этих регионах [1; 2]. Это имеет большое значение в области охране природы и сохранения биоразнообразия.

Выявление закономерностей распределения частот аллелей позволит получить ценную информацию о внутри- и межпопуляционных взаимодействиях такого широко распространенного вида как заяц. Помимо этого, накопление базы генетических данных зайца позволит решить такие практические задачи какопределение популяционной принадлежности особи с неизвестным происхождением. Это особенно важно для Приарльского региона, где виды, обитающие на территориях соседствуют с особо охраняемыми и заповедными, охотничья деятельность в пределах которых запрещена.

Методы получения информации о последовательности ДНК продолжают стремительно развиваться, и последовательности всего генома создаются для всё большего числа организмов. Это позволяет идентифицировать и разрабатывать последовательности и маркеры для многих видов исследований, и некоторые из них будут полезны для филогеографических исследований. В частности, очевидно, что для получения более полной и надёжной истории вида [12] требуются генеалогические данные из нескольких независимых ядерных локусов. Однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) также становятся доступными по всему геному, что позволяет получить исчерпывающие данные о генетическом разнообразии и построить более точные генеалогические древа [7].

Целью настоящей работы является молекулярно-генетическая характеристика Lepus tolai(Pallas, 1778) видов, принадлежащих к роду Lepusраспространенных в Каракалпакстане.

Материал и методы исследований.

Основой для проведения исследования служат молекулы ДНК, содержащиеся в биологических пробах, поэтому начальный этап анализа заключается в выделении ДНК из образцов, собранных в местах обитания ирбиса. Для этой цели применяются специальные наборы реагентов, позволяющие извлечь ДНК из клеток и очистить ее от побочных веществ, которые могут помешать проведению последующих этапов анализа. Полученный раствор ДНК используется для амплификации, то есть наращивания концентрации анализируемого фрагмента генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Благодаря развитию исследований повторяющихся последовательностей стало очевидно, что геном представляет собой сложную иерархию различных структурно-функциональных элементов. Полиморфизм отдельных таких элементов имеет отличные друг от друга механизмы и разные фенотипические и микроэволюционные последствия. То есть, анализ полиморфизма ДНК последовательностей к настоящему времени принципиально изменил положение в популяционной генетике и систематике животных.

Молекулярно-генетические исследования собраны  из рода  Lepus  относиться  к семейству  Lepus tolai  Pallas, 1778  и Oryctolagus  Lilljeborg, 1873 относиться к семейству, Oryctolagus cuniculus (Linnaeus, 1758)   для извлечения общей ДНК из тканей  видов (DNeasy Blood and Tissue Kits for DNA Isolation) был использован набор реагентов  (Qiagen Inc., November 2023).У L.tolai и O.cuniculus митохондриальная ДНК (мтДНК) 16S rRNAпредставлена фрагментами 16S рРНК, нуклеотиды которых определены молекулярной таксономией 16 SA (5′‐CGCCTGTTTATCAAAAACAT‐3′), 16SB (5′‐CCCGTCTGAACTCAGATCACG‐3′),  разделены с помощью своих праймеров [11].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)проводилось по следующей схеме: 1-этап- денатурация ДНК в условиях 95°C в течение 15 минут,  2-этап - денатурация ДНК в условиях 94°C в течение 30 секунд, 3-этап-  смягчение  праймеров в ДНК в течение 45 секунд при температуре 53°C, 4-этап- удлинение при температуре 72°C в течение 1 минуты 40 секунд, 5-этап- у длинение цепи в течение 5 минут при температуре 72°C.  Со второго по четвертый этап процесс повторяется до 35 раз в виде цикла.

Из ПЦР продуктов в ДНК  содержащих 1,0% гелия агарозы определяется методом электрофореза с напряжением 120 V.При амплификации ДНК и выделении ДНК из геля использовали набор реагентов производства "Силекс М" (Москва, Россия) в соответствии с инструкциями производителя.

Секвенирование  ДНК с использованием ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 проводили с использованием набора реагентов, продукты реакции регистрировали на автоматическом секвенторе  ABI PRISM 3100-Avant (Москва, Россия).Анализ полученной нуклеотидной последовательности проводили с использованием специальной компьютерной программы  Bioedit, Clustal W ва DNAstar^TM, PAUP4.

Результаты и их обсуждение.

В настоящее время полиморфные последовательности ДНК применяют для маркирования генов и отдельных участков хромосом. Также отдельный интерес представляет исследование генетического разнообразия и структуры одного из самых распорстраненных видов в Приральском регионе - популяции зайца-толая,поскольку дает возможностьанализировать популяционно-генетические практически «в режиме реального времени» (рис.1). 

Виды, относящиеся к роду Lepusраспространены по всему миру, причем виды этого рода приспособлены к различным средам обитания  [6]. Они являются неотъемлемой частью биологической пищевой цепи.

Рисунок 1. Территория распространения популяции зайца толай (Lepus tolai), https/en.wikipedia.org/wiki/List_of_leporids

На территории Приаралья, заяц-толай (Lepus tolai) в отличие от многих других видов диких животных не только существует в условиях усиливающейся хозяйственной деятельности, но и увеличивает свою численность.  В связи с этим, он является идеальным объектом для изучения наиболее актуальных вопросов механизмов выживаемости видов в антропогенно-нарушенных ландшафтах, и на мало изученных пустынных территориях.

Отсутствие специальных исследований половой и возрастной структуры популяций зайца-толай (Lepus tolai), его биоэкологических особенностей в различных местообитаниях, выживаемости в условиях интенсивного воздействия антропогенных факторов, а так же влияния промысла на динамику численности, не позволяет разработать стратегию охраны и использования вида [10].

В условиях повсеместного усиления антропогенного воздействия на животный мир, сокращения численности зайца-толай (Lepus tolai) и возрастания его значения как объекта спортивной охоты, исследования экологии вида, разработка мер его охраны, воспроизводства и рационального использования приобретают особую актуальность заяц-толай (Lepus Tolai) - один из значимых видов животных пустынных, полупустынных биогеоценозов Центральной Азии и в частности Южного Приаралья.  Поэтому изучение его экологических особенностей представляет, как практический, так и теоретический интерес. Между тем экологические особенности популяции заяца-толая на территории региона Южного Приаралья исследованы еще недостаточно.

В регионе Южного Приаралья заяц -толай распространен повсеместно.  По данным исследователей наиболее характерными местами обитания являются тамарисковые и чингиловые заросли в низовьях дельты Амударьи, песчаные бугры, заросшие кустарником, и полукустарники вблизи водоемов, солончаки, залежи, причинковые  полосы, саксаульники [5].

Lepus tolai Pallas, 1778 виды зайцев, имеет желто-коричневую, сероватую текстуру[8]. Этот вид приспособлен к жизни в пустынях, степях, скалистых, лесных и горных массивах, а окраска его тела адаптируется к среде обитания. Однако виды, принадлежащие к роду Lepus, скрещевается между собой, что затрудняет их морфологическую классификацию [8].

Молекулярная филогения и систематика в последние годы претерпевает новый этап развития и становится все более активно развивающейся областью современной биологии. Это определяется разработкой новых разнообразных методов анализа молекулярных маркеров ДНК, что позволяет оценивать генетическое родство таксонов на более высоком уровне, а также получать новую информацию об их филогенезе и биоразнообразии [2; 3]. Очевидно, что применение молекулярных маркеров к все более широкому кругу видов и других таксонов, ранее не изученных, свидетельствует об актуальности и важности подобных исследований.

Тем не менее, приходится констатировать, что к настоящему времени из сотен тысяч таксонов мира растений ДНК исследованиями затронуты порядка тысяч [1, 4], а из десятков тысяч таксонов животных всего лишь около сотен. При этом только половина работ по молекулярным маркерам животных посвящена изучению двух-трех десятков наиболее доступных видов, остальные лишь эпизодически исследуемы [6; 11].

Наряду с этим, набор методов молекулярно-биологического изучения разнообразия и филогении не так обширен, как хотелось бы. Некоторые из ранее предложенных подходов подвергаются в настоящее время критике и не могут рассматриваться как всеобъемлющие. Стало очевидно, что использование молекулярных технологий в этой области общей биологии должно сопровождаться сопоставлением результатов, полученных с помощью разных маркеров, в том числе имеющих разные диапазоны применения [3].

Для Lepus tolai, обитающего на территории охотугодий Приаралья характерна широкая эвритопностъ и смена стаций в зависимости от сезонных изменений их кормовых и защитных свойств.Состояние популяции заяц-толай (Lepus tolai)  в Южном Приаралье, как и в других частях его ареала, находится под заметным влиянием антропогенного фактора. Его действие неоднозначно и главным образом, опосредовано через изменение среды обитания животных и имеет тенденцию к усилению.

В целях более эффективного управления ресурсами зайца-толай (Lepus tolai) можно предложить следующие мероприятия. В связи с резким увеличением следовой активности животных во время весеннего гона следует проводить ежегодные зимние маршрутные учеты равномерно в течение всего периода учетов. Это исключит ошибки в определении характера изменений численности вида. Для прогнозирования осенней численности популяции необходимо учитывать погодные условия весенне-летний период и проводить в конце сентября пробные отстрелы зайцев для выяснения возрастной структуры популяции.

По результатам проведенных молекулярно-генетических исследований выделены виды L. tolai, относящиеся к роду Lepus, а для сравнительного изучения – к роду Oryctolagus, была выделена последовательность из 725 пар нуклеотидов, принадлежащих 16S rRNAмитохондриальной ДНК (мтДНК) видаO. cuniculus.

Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программного обеспечения для биоинформатики и сравнивали  с видами из Национальной базы данных биоинформатики (NCBI)(L. tolaiNC 025748)  (рис.2).

Рисунок  2.  L. tolai, принадлежащая  к роду Lepus, O. Cuniculus, принадлежащая к роду Oryctolagus,  виды  представляет собой последовательность нуклеотидов, принадлежащих к  мтДНК 16S rRNA

 L.tolai, принадлежащая  к роду Lepus, O. cuniculusпринадлежащая к роду Oryctolagus, виды  представляет собой последовательность нуклеотидов, принадлежащих к мтДНК 16S rRNA.

Биоинформатический анализ не выявил нуклеотидных различий между видами L. tolaiиз рода Lepusи экземпляром из базы данных NCBI(L. tolai NC 025748). Между нуклеотидами L.Tolai, принадлежащим к родуLepusи видами O. cuniculus, принадлежащими к роду Oryctolagus, обнаружены различия, по  55 нуклеотидам, причем обнаружено  7,6%  от общего количества нуклеотидных различий (рис. 3).

Рисунок 3. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате молекулярно-генетических исследований

Нуклеотидные последовательности, полученные в результате молекулярно-генетических исследований, были депонированы в Национальной базе данных биоинформатики (NCBI) и получены инвентарные номера. (L. tolai -PV162742,O. cuniculus - PV162744).

Lepus tolai Pallas, 1778, относящийся к роду Lepus, распространенному в Каракалпакстане, несмотря на различия в окраске тела и других морфологических аспектах,  с молекулярно-генетической точки зрения доказано, что этот вид является  Lepus tolai.

Таким образом, широкое распространение ДНК-маркеры получили также в области молекулярно-генетического картирования геномов различных животных, оценки уровня генетического полиморфизма, при генотипировании особей, линий, популяций, видов. Использование ДНК-технологий во многом позволило преодолеть недостатки метода белковых маркеров в решении ряда таксономических вопросов. Прежде всего, это связано с тем, что ДНК-маркеры не подвержены эндогенному влиянию и могут быть идентифицированы на любой стадии развития живого организма.

Список литературы:

1. Банникова A.A. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитающих // Общая биология. – 2004. –  Т. 65. –  №4. –  С. 278-305.
2. Багиров В.А., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М., Лесин С.А., Воеводин В.А., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Калашников В.В., Солошенко В.А. Сохранение и рациональное использование генофонда животных // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2009. – № 2. – С. 37–40.
3. Гречко В.В., Рябинин Д.М., Федорова Л.В., Федоров А.Н., Даревский И.С., Рысков А.П. Метод таксонопринта ДНК в изучении ящериц сем. Lacertidae // Мол. биол. – 1993. – Т. 27. – С. 1404–1414.
4. Потапов С.Г. Диагностические возможности молекулярно-генетических маркеров в систематике млекопитающих : дисс. … канд. биол. наук. – 1998. –Москва. – 450 с.
5. Реймов Р. Мелкие млекопитающие Южного Приаралья. – Ташкент: ФАН. – 1985. – 95 с. 
6. Ben Slimen H., Awadi A., Tolesa Z. G., Knauer F., Alves P. C., Makni M. Positive selection on the mitochondrial ATP synthase 6 and the NADH dehydrogenase 2 genes across 22 hare species (genus Lepus) // J. Zool. Syst. Evol. Res. – 2018. – Vol. 56. – Pp. 428–443.
7. Brumfield R.T., Beerli P., Nickerson D.A., Edwards S.V. The utility of single nucleotide polymorphisms in inferences of population history // Trends in Ecology and Evolution. – 2003. – Vol. 18. – Pp. 249–256. 10.1016/S0169-5347(03)00018-1.
8. Liu J., Khan W., Yu L., Rober, W. M., Mahmut H., Zhang Y. Genetic consequences of postglacial colonization by the endemic Yarkand hare (Lepus yarkandensis) of the arid Tarim Basin. Chin. Sci. Bull. – 2011. – Vol. 56. – Pp.1370–1382.
9. Smith A.T., Johnston C.H., Alves P.C., Hacklander K. Lagomorphs: Pikas, rabbits, and hares of the world. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 2018.
10. Treml F. Prevalence of Leptospirosis Antibodies in the European Hare (Lepus Europaeus Pall.) in the District of Breclav // Acta Veterinaria Brunensis. – 2003. –  Vol. 72. – Pp. 377–381.
11. Vences M, de Pous P, Nicolas V, Diaz-Rodriguez J, Donaire D, Hugemann Kl. New insights on phylogeography and distribution of painted frogs (Discoglossus) in northern Africa and the Iberian Peninsula // Amphib-Reptilia. – 2014. – Vol. 35. – Pp. 305–320.
12. Zhang D-X, Hewitt GM: Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations:practice, problems and prospects // Molecular Ecology. – 2003. – Vol. 12. – Pp.  563–584. 10.1046/j.1365-294X.2003.01773.x.