ВЛИЯНИЕ ТАНИНОВ ГЕКСАГАЛЛОИЛ-ГЛЮКОЗЫ И ГЕПТАГАЛЛОИЛ-ГЛЮКОЗЫ НА АТФ-ЗАВИСИМЫЕ КАЛИЕВЫЕ КАНАЛЫ В УСЛОВИЯХ In vitro

АННОТАЦИЯ

Каналы митоK_ATФ были тщательно изучены в ходе исследований, проведенных на сердечной ткани. Многочисленные эксперименты доказали, что повышение активности митоК_АТФ-каналов предотвращает гипоксию и ишемические заболевания. Различные гипоксические состояния приводят к активации сигнальных систем в митохондриях. В результате гипоксия вызывает изменения в работе митохондрий, в том числе активацию митохондриальных калиевых каналов. В связи с этим изучение функции канала митоK_ATФ и сигнальных путей клетки, вызывающих открытие каналов митоK_ATФ, является актуальной задачей. Таким образом, в статье исследуется in vitro влияние танинов гексагаллоилглюкозы и гептагаллоилглюкозы, выделенных из листьев Pistacia vera L., на АТФ-зависимые калиевые каналы в митохондриях печени крыс. Исследования проводились в концентрациях 2,5-10 мкМ. Согласно полученным результатам, гексагаллоилглюкоза активировала прохождение ионов К⁺ на 82±3%, а гептагаллоилглюкоза на 98±0,7% по сравнению со случаем, когда канал митоK_ATФ был ингибирован 200 мкМ АТФ в инкубационной среде при низкой концентрации 10 мкМ. В результате было установлено, что танины проявляют защитные свойства.

ABSTRACT

MitoK_ATP channels have been thoroughly studied in the studies conducted on cardiac tissue. Numerous experiments have shown that increasing the activity of mitoK_ATP channels prevents hypoxia and ischemic diseases. Various hypoxic conditions lead to activation of signaling systems in mitochondria. As a result, hypoxia causes changes in mitochondrial function, including activation of mitochondrial potassium channels. In this regard, studying the function of the mitoK_ATP channel and the cell signaling pathways that cause the opening of mitoK_ATP channels is an urgent task. Thus, in the article, the effect of tannins hexagalloyl glucose and heptagalloylglucose isolated from Pistacia vera L. leaves on ATP-dependent potassium channels in rat liver mitochondria is investigated in vitro. The studies were carried out at concentrations of 2.5-10 μM. According to the obtained results, hexagalloyl glucose activated the passage of K⁺ ions by 82±3%, and heptagalloyl glucose by 98±0.7% compared to the case when the mitoK_ATP channel was inhibited by 200 μM ATP in the incubation medium at a low concentration of 10 μM. As a result, it was found that tannins exhibit protective properties.

Ключевые слова: Pistacia vera L., танин, гексагаллоил-глюкоза, гептагаллоил-глюкоза, митохондрии печени, митоК_АТФ.

Keywords: Pistacia vera L., tannin, hexagalloyl-glucose, heptagalloyl-glucose, liver mitochondria, mitoK_ATP.

MITOK состоит из субъединиц MITOSUR, которая образует АТФ-зависимый калиевый канал (митоК_АТФ), расположенный во внутренней мембране митохондрий, которая связывает АТФ и контролирует поток K⁺ в митохондрии в зависимости от количества АТФ в митохондриальном матриксе. Транспорт K⁺ через калиевые каналы влияет на синтез митохондриальных активных форм кислорода (АФК) (биохимические функции), целостность внутренней митохондриальной мембраны, объем и форму кристаллов (биофизические свойства), метаболизм (гомеостаз Ca²⁺) и выработку энергии (АТФ). Соответственно, изменения в потоке ионов K⁺ через АТФ-управляемый K-канал приводят к потере цитопротекции [9; 14; 19; 23]. Этот канал был тщательно изучен, в первую очередь из-за его роли в защите от ишемически-реперфузионного повреждения [11; 20]. Диазоксид — активатор митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов, который предотвращает высвобождение цитохрома С из митохондрий, деполяризацию мембранного потенциала митохондрий, что вызывает апоптоз [6; 12]. Открытие канала митоК_АТФ важно для модуляции функции митохондрий в условиях гипоксии, поскольку исследователи полагают, что модуляция системы фосфорилирования митохондрий играет решающую роль в регуляции энергетического обмена в условиях острой гипоксии [7]. Причина в том, что во время ишемии сердца недостаток кислорода в клетках миокарда приводит к нарушению pH и ионов и гибели клеток из-за открытия митохондриальной поры проницаемости (mPTP). Предотвращая эти процессы, активация митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов оказывает ингибирующее действие на mPTP [21], которое может предотвратить развитие окислительного стресса [17]. Это свидетельствует о том, что канал митоК_АТФ важен не только для митохондрий, но и для физиологии клетки.

Целью исследования было изучение влияния гексагаллоил-глюкозных и гептагаллоил-глюкозных танинов, выделенных из листьев Pistacia vera L., на АТФ-зависимые калиевые каналы митохондрий печени крыс.

Материалы и методы исследования.  Из листьев Pistacia vera L. были выделены гексагаллоилглюкоза и гептагаллоилглюкоза, которые относятся к группе гидролизуемых танинов [13].  Чистота этих соединений составляет 86–90%, и их чистота была определена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Дубильные вещества были получены из Лаборатории белков и пептидов Института биоорганической химии Академии наук Республики Узбекистан. Все реагенты, использованные в экспериментах, были приобретены у Sigma Aldrich. Их химические структуры представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Химическая структура гексагаллоил-глюкоза (6-O-дигаллоил-1,2,3,4-тетра-O-галлоил-бета-D-глюкозы) (А) и гептагаллоил-глюкоза (3,6-O-дигаллоил-1,2,4-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы) (Б)

Исследование проводили на белых беспородных крыс массой 180-200 г. Все процедуры, проводимые с животными, соответствуют требованиям Декларации Совета Европейского Союза 86/609/ЕЕС и протокола по биоэтике Института биофизики и биохимии при НУУз с № BRC/IBB-N44/2024/75-1. Митохондрии были выделены методом дифференциального центрифугирования. Для центрифугирования использовалась центрифуга РС-6. После декапитации крысы вскрывали брюшную полость и удаляли печень. Изолированную печень немедленно взвешивали в среде изоляции, охлажденной до 0°С, смешивали с средой изоляции в соотношении 1:6 и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. На первом этапе центрифугировали при 1500 об/мин в течение 7-8 мин, а супернатант, содержащий митохондрии, собирали для центрифугирования на втором этапе. На втором этапе центрифугировали в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин. Центрифугирование проводили при температуре 0-2°С[22]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 10мМ трис-HCl, pH 7,4. Митохондрии суспендировали в среде выделения без ЭДТА в соотношении 10:1. Во время эксперимента суспензия митохондрий хранилась в ледяной бане. Белок определяли по методу биурета [25] с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Активность АТФ-зависимого К-канала (митоК_АТФ-канала) в митохондриях определяли по изменению кинетики митохондриального воротного механизма методом нм-спектрофотометрии при 540 нм[2]. В кювете содержание митохондриального белка составляло 0,3–0,4 мг/мл, а температура — 26°С. Состав инкубационной среды для определения активности митоК_АТФ-каналов: 125 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 5 мМ сукцинат, 1 мМ MgCl₂, 2,5 мМ K₂HPO₄, 2,5 мМ KH₂PO₄, 2 мкМ ротенон, pH 7,4. При статистическом анализе полученных результатов по активности МитоК_атф-канала показатели - АТФ и +АТФ сравнивались между собой, а результаты, полученные по влиянию танинов, сравнивались с показателем +АТФ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Origin 6.1 с вычислением средней арифметической величины (М), стандартной ошибки (m), и показателя достоверности (р) с использованием t-теста Стьюдента. Величину р<0,05 рассматривали как показатель достоверных различий.

Результаты и их обсуждение. Добавление митохондрий в инкубационную среду приводило к их выраженному набуханию, что приводило к переходу канала митоК_АТФ в открытое состояние. Добавление 200 мкМ АТФ подавляет набухание митохондрий на 50–60%. Поэтому этот канал называется АТФ-зависимым К-каналом в митохондриях. [10]. Этот митоК_АТФ-канал активируется путем добавления его активаторов по сравнению с условиями, при которых АТФ ингибируется [1; 3; 4; 10]. Таким образом, добавление различных соединений в инкубационную среду в условиях ингибирования АТФ обеспечивает модуляцию митоК_АТФ-канала.

При отсутствии АТФ открытие митоК_АТФ-канала принималось равным 100%. В присутствии АТФ канал митоК_АТФ ингибировался примерно на 60±4% [10], и были проведены эксперименты по исследованию влияния гексагаллоилглюкозы и гептагаллоилглюкозы на активность канала митоК_АТФ в условиях ингибирования АТФ при концентрациях 2,5–10,0 мкМ (рис. 2).  Танины гексагаллоил-глюкозы и гептагаллоил-глюкозы оказали активирующее действие на митоК_АТФ-канал относительно состояния ингибирования АТФ. Согласно полученным результатам, гексагаллоил-глюкоза и гептагаллоил-глюкоза активировались на 22,6±2,9% и 12,5±2,7% при 2,5 мкМ, на 38,8±3,2% и 39,2±2,4% при 5 мкМ. При последующих концентрациях эти показатели снова возросли. Было обнаружено, что гексагаллоил-глюкоза и гептагаллоил-глюкоза активируют 71,4±2,3% и 62,3±3,2% при 7,5 мкМ, и 82±3% и 98±0,7% при 10 мкМ. Известно, что активация АТФ-зависимого К-канала (митоК_АТФ-канала) в митохондриях вызывает цитопротекцию в различных клетках [24].

Рисунок 2. Влияние гексагаллоил-глюкозных (A₁, A₂) и гептагаллоил-глюкозных (Б₁, Б₂) на активность митоК_АТФ-каналов в митохондриях печени крысы. Добавление АТФ в физиологической концентрации 200 мкМ в инкубационную среду вызывало ингибирование каналов и в этих условиях изучалось действие танинов. (** -P < 0,01, *** -P < 0,001; n = 6)

Ионы K⁺ являются наиболее распространенными катионами в цитозоле и хранятся в высоких концентрациях в митохондриальном матриксе через калиевые каналы. В результате выхода ионов K⁺ из внутренней митохондриальной мембраны во внешную мембрану pH в матриксе снижается и продукция АФК уменьшается. Это стимулирует синтез АТФ через F_oF₁-АТФазу[18].

Обычно открытие катехоламиновых каналов более выражено под влиянием диазоксида, а блокирующие свойства более выражены под влиянием глибенкламида [8]. В литературе показано, что некоторые соединения активируют митоК_АТФ-канал и проявляют активаторные свойства (диазоксид, никорандил и др.), в то время как некоторые соединения ингибируют активность канала и проявляют блокирующие свойства (5-гидроксидеканоат, MCC-134) [16]. Активирующее действие танинов на митоК_АТФ-канал печени крысы оказывает защитное (протекторное) действие против митохондриальных нарушений [15].

Заключение. Таким образом, исследуемые танины гексагаллоилглюкоза и гептагаллоилглюкоза активировали АТФ-зависимый К-канал митохондрий печени крыс на 82±3% и 98±0,7% соответственно в концентрации 10 мкМ по сравнению с состоянием, при котором АТФ ингибировался. Данный показатель рассчитывался путем принятия разницы между средой без АТФ и средой с добавлением 200 мкМ АТФ за 100%.

Список литературы:

1. Абдулхақова Г.В., Комилов Э.Ж., Асраров М.И., Эргашев Н.А., Махмудов Р.Р. Нонагаллоил глюкоза ва декагаллоил глюкоза гидролизланувчи танинларининг жигар митохондрияларидаги ATFga боғлиқ K+ каналга таъсири // Infeksiya, immunitet va farmakologiya. – 2024. – № 5. – B. 9-14.
2. Вадзюк О.Б., Костерин С.А. Индуцированное диазоксидом набухание митохондрий миометрия крыс как свидетельство активации АТФ-чувствительного К+-канала // Укр. бiохiм. журн. –2008. – T. 80. – № 5. – С. 45-51.
3. Комилов Э.Ж., Эргашев Н.А., Абдуллаева Г.Т., Гайибов У.Г., Асраров М.И., Комилов Б.Ж. Лютеолин ва пуликарин флавоноидларининг митохондрия АТФ га боғлиқ калий каналига таъсири // ЎзМУ хабарлари. – 2018. – №3/1. – С. 125-128.
4. Миронова Г.Д., Белослудцева Н.В., Гриценко Е.Н., Белослудцев К.Н., Германова Э.Л., Лукьянова Л.Д., Шигаева М.И. Влияние некоторых флавоноидсодержаших препаратов растительного происхождения на активность митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2008. – Т. 146. – № 8. – С. 195-199.
5. Муратова Д.Х., Эргашев Н.А., Асраров М.И., Усманов П.Б., Султанходжаев М.Н. Активирование 1-О-бензоилнапеллином АТФ-зависимого калиевого канала митохондрий // Докл. АН РУз. – 2011. – № 3. – С. 69-72.
6. Akao M., Ohler A., O‘Rourke B., Marbán E. Mitochondrial ATP-sensitive potassium channels inhibit apoptosis induced by oxidative stress in cardiac cells // Circ Res. 2001 Jun 22;88(12):1267-75. doi: 10.1161/hh1201.092094.
7. Akopova O., Nosar V., Gavenauskas B., Bratus L., Kolchinskaya L., Mankovska I., Sagach V. The effect of atp-dependent potassium uptake on mitochondrial functions under acute hypoxia // J Bioenerg Biomembr. –2016. – Vol. 48. –P. 67–75 DOI 10.1007/s10863-015-9642-8
8. Evinova A., Baranovicova E., Hajduchova D., Dibdiakova K., Baranova I., Racay P., Strnadel J., Pecova R., Halasova E., Pokusa M. The impact of ATP-sensitive potassium channel modulation on mitochondria in a Parkinson’s disease model using Sh-SY5Y cells depends on their differentiation state // Journal of Bioenergetics and Biomembranes. – 2024. – Vol. 56. – P. 347–360.
9. Garlid K. D, Paucek P. Mitochondrial potassium transport: The K+ cycle // Biochimica et Biophysica Acta – 2003. – Vol. 1606(1-3). – P. 23-41 DOI:10.1016/S0005-2728(03)00108-7
10. Inouye I., Nagase H., Kishi K., Higuti T. ATP-sensitive K+ channel in the mitochondrial inner membrane // Nature. – 1991. – V. 352. – P. 244-247.
11. Kravenska Ye., Checchetto V., Szabo I. Routes for Potassium Ions across Mitochondrial Membranes: A Biophysical Point of Viyew with Special Focus on the ATP-Sensitive K+ Channel // Biomolecules. 2021. 11(8). № 1172. doi: 10.3390/biom11081172
12. Liu D., Lu Ch., Wan R., Auyeung W.W., Mattson M.P. Activation of mitochondrial ATP-dependent potassium channels protects neurons against ischemia-induced death by a mechanism involving suppression of Bax translocation and cytochrome c release // J Cereb Blood Flow Metab. –2002. – Vol. 22(4). – R. 431-43. doi: 10.1097/00004647-200204000-00007.
13. Makhmudov R.R., Suleymanova G.G., Alimkhodzhayeva N.T., Dadakhodzhayeva M.R. (2023) Isolation of tannins Pistacia vera. 2023. Sciyence and innovation international sciyentific journal. Volume 2;| ISSN: 2181-3337 | scientists.uz
14. Marco G. Di, Gherardi G., De Mario A., Piazza I., Baraldo M., Mattarei A., Blaauw B., Rizzuto R., De Stefani D., Mammucari C. The mitochondrial ATP-dependent potassium channel (mitoKATP) controls skeletal muscle structure and function // Cell Death & Disease. – 2024. – Vol. 15. – №: 58
15. Matin Md.A. A reviyew study on the pharmacological effects and mechanism of action of tannins // European Journal Pharmaceutical and Medical Research. – 2021. – Vol. 8(8). –P. 05-10
16. Mironova GD, Kachaeva EV, Kopylov AT. Mitochondrial ATP-dependent potassium channel. I. The structure of the channel, the mechanisms of its functioning and regulation // Vestn Ross Akad Med Nauk. 2007:(2):34-43. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17396561/.
17. Mosentsov A. A., Rozova E. V., Belosludseva N. V., Mankovskaya I. N., Putiy Yu. V., Karaban I. N., Mikheyeva I. B., Mironova G. D. Does the Operation of Mitochondrial ATP-Dependent Potassium Channels Affect the Structural Component of Mitochondrial and Endothelial Dysfunctions in Experimental Parkinsonism? // Biophysics and biochemistry. –2021. –Vol. 170. – P. 431–435.
18. Naima J., Ohta Yo. Potassium Ions Decrease Mitochondrial Matrix pH: Implications for ATP Production and Reactive Oxygen Speciyes Generation // Int. J. Mol. Sci. – 2024. – Vol. 25(2), – № 1233; https://doi.org/10.3390/ijms25021233
19. Paggio A., Checchetto V., Campo A., Menabo‘ R., Di Marco G., Di Lisa F., Szabo I., Rizzuto R., De Stefani D. Identification of an ATP-sensitive potassium channel in mitochondria // Nature. – 2019. – Vol. 21;572(7771). – P. 609–613. doi: 10.1038/s41586-019-1498-3;
20. Pereira O., A. Kowaltowski J. Mitochondrial K+ Transport: Modulation and Functional Consequyences // Molecules. 2021. 26(10). № 2935. doi: 10.3390/molecules26102935
21. Rameshrad M., Omidkhoda S.F., Razavi B.M., Hosseinzadeh H. Evaluating the possible role of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels in the cardioprotective effects of morin in the isolated rat heart // Life Sciyences. –2021. –Vol. 264. – №118659
22. Schneider W.C., Hogeboom G.H. Cytochemical studiyes of mammalian tissuyes: the isolation of cell components by differential centrifugation // Cancer. Res. – 1951. – V. 11. – № 1. – P. 1–22.
23. Szewczyk A., Bednarczyk P., Kulawiak B., Żochowska M., Kalenik B., Lewandowska J., Pytlak K., Gałecka Sh., Wrzosek A., Koprowski P. Mitochondrial potassium channels: New propertiyes and functions // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics – 2025. – Vol. 1866, Issuye 2, № 149546.
24. Toczyłowska-Mamińska R, Olszewska A, Laskowski M, Bednarczyk P, Skowronek K, Szewczyk A. Potassium channel in the mitochondria of human keratinocytes // J Invest Dermatol. 2014 Mar;134(3):764-772. doi: 10.1038/jid.2013.422.
25. Watters C. A one-step biuret assay for protein in the presence of detergent Anal Biochem. – 1978. – Vol. 88. – № 2. – P. 695-698. DOI: 10.1016/0003-2697(78)90475-x