ОЦЕНКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ, ХРОНИЧЕСКИ ЗАГРЯЗНЕННОЙ ПЕСТИЦИДАМИ ПОЧВ

АННОТАЦИЯ

В данной работе было изучено активность почвенных ферментов и численность некоторых групп микроорганизмов (бактерий, грибов, актиномицетов) до и после проведения микробной биоремидиации хронически загрязненной пестицидами почв. Выявлено, что до биоремедиации каталазная, пероксидазная, полифенолоксидазная и уреазная активность составляет 1,6 мл/О₂ г почвы·мин; 2,8 мг бензох. г почвы·30 мин; 2,6 мг бензох.г почвы·30 мин и 0,4 мг NH⁴⁺ г почвы·3 час, соответственно. В то же время эти показатели увеличиваются на 2,1; 1,4; 1,7 и 4 раза после проведения биоремедиационных процедур. Микробиологический анализ численности некоторых групп микроорганизмов до биоремедиации показал, что максимум КОЕ бактерий и актиномицетов составляет 15,2 × 104 КОЕ/г почвы и 6,3 × 104 КОЕ/г почвы. А после биоремедиации численность этих групп микроорганизмов увеличивается на порядок и составляет 17,6 × 105 КОЕ/г почвы и 8,4 × 105 КОЕ/г почвы.

ABSTRACT

In this work, the activity of soil enzymes and the number of some groups of microorganisms (bacteria, fungi, actinomycetes) before and after microbial bioremediation of soils chronically contaminated with pesticides were studied. It was revealed that before bioremediation, catalase, peroxidase, polyphenoloxidase and urease activities were 1.6 ml O² g soil min; 2.8 mg benzoquinone g soil 30 min; 2.6 mg benzoquinone g soil 30 min and 0.4 mg NH⁴⁺ g soil 3 h, respectively. At the same time, these indicators increased by 2.1; 1.4; 1.7 and 4 times after bioremediation procedures. Microbiological analysis of the number of some groups of microorganisms before bioremediation showed that the maximum CFU of bacteria and actinomycetes is 15.2 × 10⁴ CFU/g of soil and 6.3 × 10⁴ CFU/g of soil. And after bioremediation, the number of these groups of microorganisms increases by an order of magnitude and is 17.6 × 10⁵ CFU/g of soil and 8.4 × 10⁵ CFU/g of soil.

Ключевые слова: микроорганизмы, пестициды, биопрепараты, биоремедиация, ферменты, активность, каталаза, полифенолоксидаза, пероксидаза, инвертаза, уреаза.

Keywords: microorganisms, pesticides, biopreparations, bioremediation, enzymes, activity, catalase, polyphenoloxidase, peroxidase, invertase, urease.

Введение

Пестициды — это химические соединения, используемые для уничтожения вредителей; среди них гербициды — это соединения, особенно токсичные для сорняков, и это свойство используется для защиты урожая от нежелательных растений. Пестициды используются для защиты и максимизации урожайности и качества урожая. В начале 21 века мировое количество пестицидов, используемых в сельском хозяйстве, составляет 4,15 млн тонн, а норма внесения пестицидов - около 2,6 кг/га [12]. Азия является ведущим поставщиком пестицидов в мире, на ее долю приходится более пятидесяти процентов от общемирового объема. Среди стран Азии Китай был зарегистрирован как основной потребитель пестицидов с объемом 1,77 млн тонн.   Кроме того, Соединенные Штаты (0,40 млн тонн) и Бразилия (0,37 млн тонн) также вносят значительный вклад в мировой рынок пестицидов [12,19,21]]. Чрезмерное использование этих химикатов и их стойкость в окружающей среде породили серьезные проблемы, а именно загрязнение почвы, воды и, в меньшей степени, воздуха, что оказывает вредное воздействие на экосистему и пищевую цепочку [19,20]. Что касается загрязнения почвы, то остаточная концентрация пестицидов часто превышает пределы, разрешенные правилами. Следовательно, при использовании пестицидов часть из них остается в почве, и накопление влияет на живущие там микроорганизмы. Там, где это происходит, задача состоит в том, чтобы уменьшить количество этих химикатов и получить сельскохозяйственные почвы, пригодные для выращивания экологически чистых культур. Пестициды могут попадать в организм человека через кожу, рот, глаза и дыхательные пути [14]. Токсичность пестицидов зависит от электронных свойств и структуры молекулы, дозировки и времени воздействия [13].

Следует отметить, что активность почвенных ферментов является хорошим показателем качества почвы, скорость метаболизма почвы может использоваться для демонстрации эффективности восстановительных процессов, принятых для обработки почв, загрязненных пестицидами [16,17 22]. Следовательно, для оценки воздействия пестицидов на почвенную среду часто рекомендуются изучение активности почвенных ферментов.

В некоторых районах, вблизи бывших аэродромов и складов “Уз Сельхозхимии” до настоящего времени наблюдаются загрязнения почв пестицидами, превышающие в несколько раз предельно допустимые концентрации. Построенные более 30 лет назад, сейчас эти хранилище представляют реальную угрозу для окружающей среды и населения.

Целью данной работы является оценка ферментативной активности, хронически загрязненной пестицидами почв Сырдарьинской области до и после проведенной биоремедиации.

Материалы и методы исследования

Образцы почвы. Для отбора проб почвы были выбраны сельскохозяйственные поля, расположенной вблизи бывшей хранилище пестицидов в Сырдарьинской области (40°23'53.9"N 68°31'34.1"E). Образцы почвы собирали с поверхностного слоя почвы до глубины 20 см и пропускали через сито с размером ячеек 2 мм для удаления крупных остатков. Образцы почв были отобраны из трех точек исследуемого объекта. Концентрацию водородных ионов (рН почвы) определяли на рН-метре ОР-211/1 (Венгрия).

Культивирование микроорганизмов. Бактерии выращивали на питательном агаре (ПА) (Hi-Media), грибы на среде Чапека-Докса (Hi-Media), а актиномицеты на среде Гаузе, г/л:вода водопроводная – 1,0; крахмал растворимый – 20,0; нитрат калия (KNO₃) – 1,0; гидроортофосфат калия (K₂HPO₄) – 0,5; магний сернокислый (MgSO₄ ×7H₂O) – 0,5; хлорид натрия (NaCl) – 0,5; гептагидрат сульфата железа (II) (FeSO₄ × 7H₂O) – следы; рН 7,0-7,5; стерилизация при 0,5 атм., (121 ºС) – 15-20 мин. Виды микроорганизмов определяли по Берджи [6].

Биоремедиация почв

Ремедиацию почв производили с использованием биопрепарата на основе отобранных эффективных местных штаммов микроорганизмов Bacillus sp. 01, Bacillus cereus 1, Arthrobacter russias, Streptomyces sp. и Streptomyces sp.2, изолированных из природных сред хронически загрязненных поллютантами. Биоремедиационные процедуры проводились 2 раза в течение  года. То есть биопрепарат использовали весной и осенью 2023 года, а ферментативную и микробиологическую активность почв изучали весной 2024 года.

ВЭЖХ-анализ, хронически загрязненной пестицидами почв

Почвенные экстракты анализировали на хроматографе с детектором электронного захвата Agilent Technologies 6890N. Условия хроматографии: капиллярная колонка HP5 длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная жидкая фаза - 5% фенилметилсиликон. Давление в колонке 12,21 psi. Газ-носитель – азот. Детектор – μECD, температура детектора 300⁰С. Определение остаточных количеств пестицидов проводили по калибровочной кривой в программном обеспечении Agilent ChemStation хроматографа Agilent Technologies 6890N по методу внешнего стандарта (ESTD) и пересчитывали полученное количество на 1 г почвы.

Активность почвенных ферментов

В почвенных образцах определяли: каталазную активность газометрическим методом по Галстяну [1], инвертазная, полифенолоксидазная, пероксидазная, уреазная – колориметрическим методом [2-5].

Результаты и их обсуждение

В почве ферменты вносят вклад в общую биологическую активность почвенно-растительной среды в различных состояниях. Их каталитическая эффективность может сильно зависеть от состава среды, в которой они действуют как катализаторы. Использование пестицидов и последующее накопление остатков в почве стало всемирной проблемой. Хлорорганические пестициды широко распространились в окружающей среде и стали причиной загрязнения в результате прошлой сельскохозяйственной деятельности. В проведенных исследованиях изучали активности ферментов каталазы, пероксидазы (ПО), полифенолоксидазы (ПФО), инвертазы и уреазы в хронически загрязненных пестицидами почв Сырдарьинской области до и после проведения ремедиации с помощью биопрепарата на основе местных штаммов микроорганизмов: Bacillus sp. 01, Bacillus cereus 1, Arthrobacter russias, Streptomyces sp. и Streptomyces sp.2. На первом этапе исследований методом высокоэффективной газожидкостной хроматографии была изучена остаточные количества пестицидов у почвенных образцов исследуемого объекта (рис.1.). Данным методом было выявлено около 100 органических соединений, среди которых в наиболее большей концентрации встречаются  такие как Бензол,1,3-бис (1,1-диметилэтил) - 5,28%; 1-Этил-2,2,6-триметилциклогексан - 2,60%; Гексадекан 2,6,11,15-тетраметил - 1,15%; 2,4-ди-трет-бутилфенол - 2,95%; Гексадекановая кислота, метиловый эфир - 3,86 %; цис-7,8-эпокси-2-метилоктадекан - 0,50%; 6-октадеценовая кислота - 3,77%; Пентафторпропионовая кислота, тридецил сложный эфир - 3,5%, Циклогексен, 3-(1,5-диметил-4-гексенил)-6-метилен – 1,41%; 2-Хлорпропионовая кислота, пентадециловый эфир – 1,22%; Метилстеарат - 2,49%; 2-пентен, 3-метил – 2%; Угольная кислота – 3%; Угольная кислота, бут-3-ин-1-илдодециловый эфир – 0,66%; 4-Хлор-3-н-гексилтетрагидропиран – 1,105%; Гептакос-1-ен – 1,78%; n- гексадекановая кислота – 6,61% (рис.1). Другие соединения считаются характерными для данной почвенной структуры. Многие из перечисленных соединений (производные пестицидов, метаболиты деструкции, низкомолекулярные ароматические и фенольные вещества) пагубно влияют на сельскохозяйственные культуры, а также на микрофлору почвы. При высоких темпах деградации хозяйственно ценных земель и земель экологического фонда особое значение имеет разработка подходов, направленных на возвращение нарушенных геосистем в режим естественного функционирования.  В мировой практике рекультивации особый акцент ставится на использование регенерационных возможностей самих природных экосистем, здесь главную роль играют такие биотические факторы почвообразовательного процесса, как формирование растительного покрова и сопряженного с ним почвенного микробиома. Микроорганизмы способны утилизировать широкий спектр химических соединений, тем самым участвуя в биоремедиации нарушенных территорий [10,15]. Кроме того, микробное сообщество является одним из наиболее чувствительных экологических индикаторов, маркирующих различные стадии почв восстановления, поскольку способно в короткие сроки адаптироваться к любым изменениям среды, максимально осваивая все доступные экологические ниши в экосистеме.

Рисунок 1. Результаты ВЭЖХ анализа, хронически загрязненной пестицидами почв

Далее, до и после проведения биоремедиационных процедур была изучена ферментативная активность и количественный состав некоторых групп микроорганизмов (бактерий, грибов и актиномицетов) отобранных исследуемых почв (рис.2, рис.3).  Как видно из рисунка 2, до биоремедиации каталазная, ПО, ПФО и уреазная активность составляет 1,6 мл/О₂ г почвы/мин; 2,8 мг бензох.г почвы/30 мин; 2,6 мг бензох.г почвы/30 мин и 0,4 мг NH⁴⁺ г почвы/3 час, соответственно. В то же время эти показатели увеличиваются на 2,1; 1,4; 1,7 и 4 раза после проведения биоремедиационных процедур (рис.2).

Рисунок 2. Ферментативная активность хронически загрязненных пестицидами почв

Ферменты являются наиболее эффективными инструментами биоремедиации и способствуют всем химическим изменениям загрязняющих веществ. Ремедиация стойких органических загрязнителей с использованием микробных ферментов считается экологически чистой и экономически эффективной. Например, каталаза [EC 1.11.1.6] является важным клеточным антиоксидантным  ферментом, который защищает от окислительного стресса и катализирует разложение перекиси водорода на воду и кислород. Фермент широко распространен в природе, что объясняет его разнообразную активность в почве [8]. Роль ферментов для почвенной экосистемы становится все более важной и определяется отношениями между почвенными ферментами и факторами окружающей среды (как природными, так и антропогенными), которые влияют на их активность. Тесты ферментативной активности почвы являются потенциальными индикаторами качества экосистем [9,11].

Как известно количественный состав микроорганизмов отражает интенсивность, дозу и характер химического загрязнения. Микробиологический анализ численности некоторых групп микроорганизмов до биоремедиации показал, что максимум КОЕ бактерий и актиномицетов составляет 15,2 × 10⁴ КОЕ/г почвы и 6,3 × 10⁴ КОЕ/г почвы. А после биоремедиации численность этих групп микроорганизмов увеличивается на один порядок и составляет 17,6 × 10⁵ КОЕ/г почвы и 8,4 × 10⁵ КОЕ/г почвы (рис.3). Следовательно, изучение интродукции в хронически загрязненную пестицидами почву биопрепарата на основе эффективных местных штаммов микроорганизмов Bacillus sp. 01, Bacillus cereus 1, Arthrobacter russias, Streptomyces sp. и Streptomyces sp.2. выявило эффективность данного приема ремедиации. Согласно данным микробиологического анализа в исследуемой почве доминировали бактерии рода Bacillus и актиномицеты рода Streptomyces. Сообщество микроскопических грибов в почве было представлено в основном Aspergillus и Mucor.

Рисунок 3. Количественный состав микроорганизмов хронически загрязненных пестицидами почв

В работе Xie et al., (2020) были изучены изменения в микробных популяциях, активности ферментов и структуре бактериального сообщества в загрязненных почвах во время биоремедиации с использованием штамма Stenotrophomonas sp. DXZ9 и райграса [23]. Результаты показали, что микробная активность была значительно улучшена, и количество бактерий резко возросло с 7,32 × 10⁶ до 2,56 × 10⁸ клеток/г за 10 дней из-за успешной колонизации штаммов ризосферы райграса.

Таким образом, биоремедиационные технологии очистки и восстановления почв основаны на усилении естественных процессов самоочистки и самовосстановления окружающей среды [7]. Поскольку увеличение количества загрязненных участков представляет собой серьезную проблему для окружающей среды и здоровья человека, представляется обязательным проводить дезактивацию окружающей среды и внедрять эффективные стратегии дезактивации. Полученные результаты исследований вносят вклад в разработку теоретических и практических основ рекультивации хронически загрязненных почв различными поллютантами территорий.

Список литературы:

1. Галстян А.Ш. Итоги изучения биологической активности почв // Итоги научно-исслед. работ по генезису, биохимии, мелиорации, агрохимии и эрозии почв. –Ереван, 1983. – С.41–59.
2. Звягинцев Д.Г. Биологическая активность почв и шкалы для оценки некоторых ее показателей // Почвоведение. – 1978. – №6. – С. 63–66.
3. Карагiна ЛА, Мiхайлоyская НА. Вызначэнне актыyнасцi полiфенолаксiдазы i пераксiдазы у глебе. Весці Акадэміі навук БССР. Серыя сельскагаспадарчых навук. 1986; 2:40–41.
4. Хазиев Ф.Х., Агафарова Я.М., Гулько А.Е. Ускоренный колориметрический метод определения инвертазной активности почв // Почвоведение. – 1988. – № 11.– С.119–12
5. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. – М.:Наука, 1990. –186 с.
6. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж., Уильямс С. Определитель бактерий Берджи. -М.: Мир. -1997. -Т.1. -431 с.
7. Янкевич М.И., Хадеева В.В., Мурыгин В.П. БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВ: ВЧЕРА, СЕГОДНЯ, ЗАВТРА //Междисциплинарный научный и прикладной журнал «Биосфера», 2015, т.7,№2. С.199-208.
8. Achuba FI, Peretiemo-Clarke BO. Effect of spent engine oil on soil catalase and dehydrogenase activities. Int Agrophys. 2008; 22:1–4.
9. Acosta-Martinez V, Cano A, Jahnson J. Simultaneous determination of multiple soil enzyme activities for soil health-biogeochemical indices. Appl Soil Ecol. 2018; 126:121–128. doi: 10.1016/j.apsoil.2017.11.024.
10. Bala S, Garg D, Thirumalesh BV, Sharma M, Sridhar K, Inbaraj BS, Tripathi M. Recent Strategies for Bioremediation of Emerging Pollutants: A Review for a Green and Sustainable Environment. Toxics. 2022 Aug 19;10(8):484. doi: 10.3390/toxics10080484.
11. Bayarmaa J, Purev D. Role of enzymes in soil. Mongolian J Agric Sci. 2017;22(03):96–102. doi: 10.5564/mjas.v22i03.950.
12. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) (2021) Pesticides use. Global, regional and country trends, 1990–2018. FAOSTAT Analytical Brief Series No. 16. Rome. https://www.fao.org/3/cb3411en/cb3411en.pdf
13. Hamadache M., Benkortbi O., Hanini S., Amrane A., Khaouane L., Si Moussa C. A Quantitative Structure Activity Relationship for acute oral toxicity of pesticides on rats: Validation, domain of application and prediction. J. Hazard. Mater. 2016; 303:28–40. doi: 10.1016/j.jhazmat.2015.09.021.
14. Kim K.H., Kabir E., Jahan S.A. Exposure to pesticides and the associated human health effects. Sci. Total Environ. 2017; 575:525–535. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.09.009
15. Kour D., Kaur T., Devi R., Yadav A., Singh M., Joshi D. Beneficial microbiomes for bioremediation of diverse contaminated environments for environmental sustainability: Present status and future challenges. Environ. Sci. Pollut. Res. 2021; 28:24917–24939. doi:10.1007/s11356-021-13252-7.
16. Luo, F.Z.; Xiang, L.; Li, H. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on growth and Cd accumulation of upland rice and soil enzyme activities in cadmium contaminated soil. J. Agro-Environ. Sci. 2015, 34, 1090–1095.
17. Pose-Juan, E., Igual, J. M., Sánchez-Martín, M. J. & Rodríguez-Cruz, M. S. Influence of herbicide Triasulfuron on soil microbial community in an unamended soil and a soil amended with organic residues. Frontiers in Microbiology 8, e378 (2017).
18. Sharma A, Kumar V, Shahzad B, Tanveer M, Sidhu GPS, Handa N, Kohli SK, Yadav P, Bali AS, Parihar RD, Dar OI, Singh K, Jasrotia S, Bakshi P, Ramakrishnan M, Kumar S, Bhardwaj R, Thukral AK (2019) Worldwide pesticide usage and its impacts on ecosystem. SN Appl Sci 1:1446. https://doi.org/10.1007/s42452-019-1485-1
19. Silva, V.; Mol, H.G.; Zomer, P.; Tienstra, M.; Ritsema, C.J.; Geissen, V. Pesticide residues in European agricultural A hidden reality unfolded. Sci. Total Environ. 2019, 653, 1532–1545.
20. Wang, X.; Wang, G.; Guo, T.; Xing, Y.; Mo, F.; Wang, H.; Fan, J.; Zhang, F. Effects of plastic mulch and nitrogen fertilizer on the soil microbial community, enzymatic activity and yield performance in a dryland maize cropping system. Eur. J. Soil Sci. 2021, 72, 400–412.
21. Wijerathna-Yapa A, Pathirana R (2022) Sustainable agro-food systems for addressing climate change and food security. Agriculture 12(10):1554. https://doi.org/10.3390/agriculture12101554
22. Wu, H.; Lai, C.; Zeng, G.; Liang, J.; Chen, J.; Xu, J.; Lu, L. The interactions of composting and biochar and their implications for soil amendment and pollution remediation: A review. Crit. Rev. Biotechnol. 2017, 754–764.
23. Xie, H.; Liu, R.; Xu, Y.; Liu, X.; Sun, F.; Ma, Y.; Wang, Y. Effect of In Situ Bioremediation of Soil Contaminated with DDT and DDE by Stenotrophomonas sp. Strain DXZ9 and Ryegrass on Soil Microorganism. Microbiol. Res. 2022, 13, 64-86.