ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЕКТИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ Phlomoides canescens

АННОТАЦИЯ

Цель исследования состоит в выделении пектиновых веществ и изучении пребиотической активности из растения Phlomoides canescens, распространенного в Шохимардонском районе Ферганской области, и богaтого тaкими веществами кaк флаваноиды, витамины и подобными им. Разработаны методы выделения и очистки полисахаридов надземной части Phlomoides canescens. Определено качественное и количественное содержание пектинового вещества, с выходом ПВ – 8.8 г. Изучено содержание уронового ангидрида в пектиновых веществах, который определен фотоэлектроколориметрическим методом на основе цветной реакции с карбазолом. Количество уроновых кислот в ПВ высокое и составляет 60 %.

ABSTRACT

The purpose of the study is to isolate pectin substances and determine prebiotic activity from the Phlomoides canescens plant, widespread in the Shokhimardon region of the Fergana region, and rich in substances such as flavonoids, vitamins, etc. Methods have been developed for the isolation and purification of polysaccharides from the aerial part of Phlomoides canescens. The qualitative and quantitative content of pectin substance was determined, with a yield of PS – 8.8 g. The content of uronic anhydride in pectin substances was studied and determined by the photoelectrocolorimetric method based on a color reaction with carbazole. The amount of uronic acids in PS is high, it is 60 %.

Ключевые слова: Рhlomoides canescens, пектиновые вещества, моносахаридный состав, степень этерификация, ИК-спектроскопия, галактуронан, биологическая активность.

Keywords: Phlomoides canescens, pectin substances, monosaccharide composition, degree of esterification, IR spectroscopy, galacturonan, biological activity.

Введение

Нами ранее были исследованы углеводы, белки, витамины, эфирные масла из цветков, листьев и надземной части растения Phlomoides canescens. Были изучены и охарактеризованы водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлоза из надземной части P. canescens [4].

В листьях обнаружено эфирное масло (0,02 %), содержащее фитол, линалоол, эвгенол, кариофиллен оксид и другие, флавоноиды: апигенин, апигенин-7-О-глюкуронид, лютеолин, цинарозид, лютеолин-7-О-глюкуронид и другие [8; 12].

При изучении частей цветка и листа Phlomodes canescens было идентифицировано 29 соединений, на долю которых приходилось 97,81 % суммы компонентов эфирного масла. Основные компоненты в составе: транс-β-оксимен (3,04 %), 5 метилбензофуразан (5,74 %), транс-β-фарнезен (7,39 %), 6,10,14-триметил-пентадекан-2-он (4,68 %), метил 8,11,14-гептадекатриеноат (9,00 %) и тритетраконтан (4,29 %) [5].

В связи с этим мы продолжили изучение состава этого растения. Из надземной части Р. canescens выделены пектиновые вещества, дана их физико-химическая характеристика. По данным титрометрического анализа установлено, что пектиновые вещества Р. canescens являются низко этерифицированными биополимерами, которые способны проявлять пребиотическую активность.

Целью исследования является изучение пектиновых веществ из надземных органов растения Р. сanescens, произрастающего в Шохимардонском районе Ферганской области Узбекистана.

Материалы и методы. Из надземной части Р. canescens выделялись пектиновые вещества (ПВ). Для этого 100 г воздушно-сухого сырья экстрагировали по методике, описанной в работах [6; 11]. Выход ПВ из надземной части Р. canescens (ПВ) составляет 8.8 %.

ПВ представляют собой порошок белого цвета с кремоватым оттенком; растворяются в воде с образованием вязких растворов с относительной вязкостью 5.7. По данным вискозиметрии  молекулярная масса (Мм) ПВ составляет 250 кДа. Вязкость растворов ПВ измеряли на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0.73 мм при 22 ^оС, что приводится в таблице 1.

Таблица 1.

Вязкость водных растворов ПВ выделенных из надземной части Р.canescens

В ИК спектрах ПВ присутствуют полосы поглощения, характерные для карбоксиполисахаридов [1; 2]. Обычно пектиновые вещества в природе находятся в этерифицированном виде, что проявляется присутствием полос поглощения в области 1325см^-1 (O-CH₃). Эти данные соотносятся с результатами титриметрического анализа [1], согласно которым определили содержание свободных (Кс) и этерифицированных (Кэ) карбоксильных групп и вытекающее из этого, степень этерификации (СЭ) 21.34 % для ПВ. Следовательно, ПВ Р. canescens относятся к низко этрифицированным пектинам (табл. 2).

Таблица 2.

Физико-химический показатель пектиновых веществ Р. canescens

Таблица 3.

Содержание и моносахаридный состав ПВ Р.canescens

Как видно из таблицы 3, моносахаридный состав выделенных полисахаридов определяли методом полного кислотного гидролиза с последующим анализом бумажной хроматографии (БХ) и газовой хроматографии (ГХ). Различия заключаются в их количественном содержании: доминирующими моносахаридами являются галактоза, арабиноза, глюкоза и ксилоза. Содержание уронового ангидрида в ПВ определяли фотоэлектроколориметрическим методом на основе цветной реакции с карбазолом [2]. Количество уроновых кислот в ПВ достаточно высокое, оно составляет 60 %, что является характерным для пектиновых веществ (табл. 3).

Пектиновые вещества анализировали методом ИК-спектроскопии. Отнесение наиболее характерных частот для ПВ сделано при сопоставлении с данными литературы [4]. ПВ являются карбоксиполисахаридами, что находит своё отражение в ИК-спектрах. В частности, это полосы поглощения в области 1748 см^-1 ПВ Р. canescens, которые соответствовали колебаниям С=O связей карбоксильной группы. Полосы поглощения в области 1237 см^-1 показывают колебания гидроксила карбоксильной группы. Обычно, пектиновые вещества в природе находятся в этерифицированном виде, что проявляется присутствием полос поглощения в области 1325 см^-1.

Эти данные соотносятся с результатами титрометрического анализа, согласно которым определили содержание свободных, этерифицированных карбоксильных групп и вытекающую из этого степень этерификации. Таким образом, Р. canescens являются – низко этерифицированными (табл. 2).

Кроме того, полосы поглощение 1421 см^-1 свидетельствуют о наличии ионизированного карбоксила, связанного с металлами. Полосы поглощения при 830 см^-1 характерны для ПВ, в которых остатки D-галактуроновой кислоты соединены α-гликозидными связями, а полосы поглощениям в области 890 и 889 см^-1 показывают 1–4 тип этих связей. 

Частичным кислотным гидролизом ПВ Р. canescens получили полисахариды, состоящие только из остатков D-галактуроновой кислоты, то есть галактуронаны с выходами 30 %, пиранозная форма которых подтверждается высокой устойчивостью к кислотному гидролизу. В ИК-спектрах галактуронанов присутствуют полосы поглощения, показывающие наличие карбоксильных групп (1732 см^-1) и α-1–4 гликозидных связей (834, 890 см^-1). При частичном гидролизе ПВ происходит отщепление как моносахаридов, так и метоксильных групп. Поэтому в ИК-спектрах галактуронанов отсутствуют полосы поглощение в области 1374 см^-1.

Моносахаридный состав ПВ установили методом полного кислотного гидролиза (2 н H₂SO₄, 100 °С, 18 ч.). Обработку гидролизатов проводили как описано [4]. Идентификация моносахаридов достигалась с помощью бумажной хроматографии (БХ) (бумага FiltrakFN 18, система бутанол-1-пиридин-вода 6:4:3, проявитель кислый фталат анилина) и газовой хроматографии – (ГХ).

ГХ анализ гидролизатов проводили на хроматографе GC 2010 в виде ацетатов альдононитрилов в следующих условиях: температура инжектора 250^оС, общий поток 60 мл/мин, поток через колонку 0,89 мл/мин, газ-носитель–азот, колонка – Rxi-624SIMS, длина колонки 3 м, внутренний диаметр ID 0.25 мм, температура колонки 230 ^оС, температура детектора 250 ^оС.

Для изучения строения главной углеводной цепи ПВ провели частичный кислотный гидролиз. Для этого пектиновые вещества (ПВ) (1 г) частично гидролизовали 100 мл 2 н H₂SO₄ в течение 2 часов при 100 ^оС. При гидролизе ПВ выпадал осадок. Осадок, отделяли центрифугированием (5000 об/мин, 10 минут), промывали спиртом, высушивали и получили кислотонерастворимые фракции с выходами 45 % соответственно. Для установления моносахаридного состава кислото-нерастворимую фракцию подвергали полному кислотному гидролизу 2 н H₂SO₄ в течение 48 ч при 100^оС, и по данным БХ идентифицировали только галактуроновую кислоту. Следовательно, кислото-нерастворимые – (КНРПВ) фракции являются галакгуронанами и высокая устойчивость к кислотному гидролизу подтверждает пиранозную форму галактуроновой кислоты. Установлено, что частичный кислотный гидролиз ПВ приводит к образованию соответствующих галактуронанов с содержанием галактуроновой кислоты 80 % соответственно, как основным компонентом главной углеводной цепи макромолекулы.

Галактуронаны - белые аморфные порошки растворяются в слабо щелочной среде.

В ИК-спектрах галактуронанов присутствуют полосы поглощения, показывающие наличие карбоксильных групп (1730см^-1) и α-1,4 гликозидных связей. (834, 890 см^-1). Полосы поглощения (1368см^-1), показывающие наличие О-СН₃-групп отсутствовали, так как при гидролизе происходит их полное отщепление.

Надосадочный раствор (кислоторастворимая фракция – КРПВ) нейтрализовали ВаСО₃, деионизировали катионитом КУ-2 (Н+), упаривали и осаждали спиртом, выпавшие осадки отделяли как обычно, получили деполимеризованные кислоторастворимая пектиновые вещества – ДКРПВ (табл. 4).

ДКРПВ представляют собой аморфные порошки белого цвета и в ИК-спектрах были обнаружены полосы поглощения характерные для пектиновых веществ. При изучении растворимости было обнаружено, что КНРПВ в отличие от ДКРПВ полностью растворяется в воде и их моносахаридный состав представлен в таблице 4. Содержание уроновых кислот в КНРПВ и ДКРПВ, определяли карбазольным методом, оно составляло 80 и 55 % соответственно.

Таблица 4.

Выход и моносахаридный состав КНРПВ и ДКРПВ -2

Примечание: КНРПВ-кислотонерастворимый пектиновые вещества

ДКРПВ – деполимеризованая кислота, растворяющая пектиновые вещества.

Следует отметить, что Мм -кислотонерастворимых пектиновых веществ намного выше, чем Мм деполимеризованых кислото-растворимых пектиновых веществ (табл. 2). Вероятно, это связано с разветвленностью боковой цепи [11]. Доминирующими моносахаридами ДКРПВ являются арабиноза и галактоза.

Полученные результаты показывает, что макромолекулы пектиновых веществ состоят из линейных α-1,4 связанных метилэтерифицированных остатков галактопиранозилуронанов.

Известно, что пектиновые вещества обладают широким спектром биологической активности: антиатеросклеротической, гипохолестерине-мической, противовоспалительной и т. д. [7; 9; 10]. Установлено, что применение пектинов уменьшает гнойно-воспалительный процесс, способствует нормализации микробного состава, уменьшает интоксикацию [3].

Определение пребиотической активности полисахаридов. В ходе исследования авторами определена пребиотическая активность пектиновых веществ ПВ. В качестве пробиотиков использовали штаммы бактерий Bifidobacterium bifidum, Lacticaseibacillus rhamnosus, Streptococcus salivarius и Lactiplantibacillus plantarum. Исследование пребиотических свойств биологически активных веществ проводили путем оценки их влияния на динамику роста и размножения пробиотических штаммов при культивировании в МРС-среде (Hi-Media, Индия) in vitro.

При проведении экспериментов создали углеводную основу питательной среды для культивирования бифидобактерий, в которой глюкоза составляет 20 г/л среды. В среду дополнительно внесли вышеперечисленные полисахариды в количестве 0,5 % от ее объема. Контролем служила среда с глюкозой в качестве источника углеводов. Все среды стерилизовали и параллельно засеивали культурой пробиотиков в количестве 1 % от общего объема среды. После инкубации в течении 48 часов при 37^оС в аэробных условиях определяли титр живых клеток штамма пробиотика методом серийных разведений в МРС и бифидо-среде (содержащей 1 % агара).

Результаты. В результате исследования авторами установлено проявление активности в отношении тест-микроорганизмов в образцах тестируемого вещества.

Анализ пребиотической активности пектиновых веществ ПВ в экспериментах in vitro показал, что при внесении всех веществ достоверно увеличивается титр живых клеток штамма Bifidobacterium bifidum 1. ПВ способствуют значительному росту конечного выхода биомассы бифидобактерий. Через 24 часа культивирования на среде, обогащенной пектиновыми веществами ПС, содержание бифидобактерий при внесении в объеме 0,5 % составляло 4×10⁷ КОЕ/г, что на 6 порядков выше, чем в контрольной группе (таблица 5). Пектиновые вещества оказывали стимулирующее действие на рост пробиотических бактерий по сравнению с контролем.

Таблица 5.

Влияние полисахаридов на динамику роста и размножения пробиотических штаммов

Заключение. Таким образом, из надземной части Р. canescens выделены и охарактеризованы пектиновые вещества. Установлен их моносахаридный состав. Выделенные пектиновые вещества анализировали методам ИК-спектроскопии и определили их степень этерификации.

Исследованные ПВ обладают высокой пребиотической активностью и открывают перспективы для их включения в состав продуктов функционального питания, биологически активных добавок к пище и синбиотиков (препаратов, полученных в результате рациональной комбинации про- и пребиотиков) для коррекции нарушений микробиоценоза у человека.

Список литературы:

1. Аймухамедова Г.Б., Алиева З., Шелухина Н.Д.  Свойства и применение пектиновых сорбентов. – Фрунзе: Илим, 1984. –  C. 61–63.
2. Арасимович В.В. Биохимические методы анализа плодов. – Кишинев, Штиинца, 1984. –  C. 12–14.
3. Ермолов А.С., Лазарева Е.Б. Эпидемиология и инфекционные болезни. –2006. – № 3. – С. 47.
4. Рахимова Х.Р. Комплекс углеводов (Phlomoides canescens) распространен в Ферганской долине // Азиатский журнал многомерных исследований. – 2021. – Vol. 10. – С. 1154–1159.
5. Рахимова Х.Р., Ибрагимов А.А. Исследование летучих веществ растения (Phlomoides sanescens) // ФарДУ. Научный вестник. – Vol. 3. – 2022. – C. 289–293.
6. Сиддикова А.А., Кодиралиева Ф.А., Жанибеков А.А., Полисахариды растения (Astragalus harpilobus) // Евразийский журнал медицинских и естественных наук. – (Special Issue). – 2024. – Vol. 4. – Number 2. – Pp. 308–309. https://doi.org/10.5281/zenodo.10683344
7. Шахматов Е.Г., Михайлова Е.А., Макарова Е.Н. Химия растительного сырья.  – 2015. – № 4. – С. 15–19.
8. Glyzin V.I., Peshkova V.A., Khokhrina T.A. Luteolin 7-β-D-glucosiduronic acid from Phlomis tu-berosa (англ.) // Chemistry of Natural Compounds. – 1972. –11. – Vol. 8. – Iss. 6. – P.785–785.
9. Malikova M.Kh.,  Akhmedova Kh.Kh., Rakhmanberdyeva R.K., Zhauynbaeva K.S., Chem. Nat. Compd.,2018. 54, 10. doi 10.1007/s10600-018-2247-9
10. Rakhmanberdyeva R.K., Filippov M.P. Chemistry of Natural Compounds. – 2011. – Vol. 47. – P. 179. doi.org/10.1007/s10600-011-9875-7
11. Siddikova  A.A., Malikova M.Kh., Rakhmanberdyevа R.K. Uzbek Biological Journal. – 2017. – № 4. – С. 78.
12. Vavilova N.K., Gella É.V. Flavonoids from (Phlomistuberosa) // Chemistry of Natural Compounds. – 1973. – Vol. 9. – Iss.2. – P.147–149.