ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ ИММОБИЛИЗАЦИИ Bacillus subtilis НА АЛЮМИНИЕВОМ СПЛАВЕ

Данная работа выполнена в рамках фундаментального проекта FL-923051836 (Узбекистан) и Т23УЗБ-015 (Беларусь).

АННОТАЦИЯ

В данной работе изучены некоторые свойства иммобилизации Bacillus subtilis на алюминиевом сплаве с керамическим покрытием.  Выявлено, что клетки Bacillus subtilis наиболее стабильны к 0,9% раствору NaCl в течение 120 мин обработки. Показано, что общее число адсорбированных клеток Bacillus subtilis на алюминиевом сплаве с керамическим покрытием Amr6 составляет 164,1х10⁶ клеток при исходном количестве 300,0х10⁶/40 мл суспензии. При иммобилизации бактерий B. subtilis на твердые носители сорбенты сохраняется морфология бактериальных клеток и целостность поверхностных структур. При проведении исследований были подобраны оптимальные режимы сканирования образцов на СЭМ.

In this work, some properties of Bacillus subtilis immobilization on aluminum alloy with a ceramic coating were studied. It was revealed that Bacillus subtilis cells are most stable to 0.9% NaCl solution for 120 min of treatment. It was shown that the total number of adsorbed Bacillus subtilis cells on aluminum alloy with a ceramic coating Amr6 is 164.1x10⁶ cells with an initial amount of 300.0x10⁶/40 ml of suspension. When immobilizing B. subtilis bacteria on solid carriers’ sorbents, the morphology of bacterial cells and the integrity of surface structures are preserved. During the studies, optimal scanning modes of samples on SEM were selected.

Ключевые слова: иммобилизация, адсорбция, Bacillus subtilis, морфология, твердые сорбенты – носители, алюминиевые сплавы.

Keywords: immobilization, adsorption, Bacillus subtilis, morphology, solid sorbents - carriers, aluminum alloys.

Введение

Bacillus subtilis — это типовой вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus). Этот род имеет ряд важных особенностей, представляющих интерес для бактериологов. Во-первых, бактерии образуют эндоспоры, что делает их полезной моделью для исследования молекулярных деталей простой системы развития, а во-вторых, некоторые представители рода производят соединения (например, ферменты, антибиотики и токсины), представляющие экономический интерес для биотехнологической промышленности [2, 4, 8].

Одним из способов увеличения продуктивности непрерывных микробиологических процессов и получения высокой плотности клеточной культуры является использование иммобилизованных клеток. Иммобилизованные клетки сохраняют пролиферативную функцию как непосредственно после иммобилизации, так и после длительного использования в биотехнологических процессах. При этом кинетические характеристики роста (удельная скорость роста и время удвоения) иммобилизованных клеток существенно не отличаются от аналогичных характеристик свободных клеток [1]. На сегодняшний день было предложено несколько подходов к иммобилизации микроорганизмов, включая захват, внедрение, сшивание и ковалентное связывание [7]. Микробные клетки, иммобилизованные в носителе, значительно увеличивают концентрацию и чистоту микроорганизмов в реакторе, тем самым увеличивая нагрузку в 3–7 раз по сравнению с традиционным активированным илом и дополнительно улучшая эффективность удаления загрязняющих веществ [5,9]. Методы иммобилизации, такие как микроинкапсуляция, открыли новые возможности в биотехнологии, способствуя разработке искусственных органов, клеточной терапии и систем доставки лекарств. Исследователи обнаружили многообещающие результаты в различных приложениях посредством иммобилизации микроорганизмов. Этот подход повышает стабильность, возможность повторного использования и каталитическую эффективность, делая иммобилизацию ценной стратегией для биокатализа, биоремедиации и других биотехнологических процессов [6]. Также иммобилизация живой бактерии дает возможность проводить новые направления исследований, которые фокусируются на отдельной бактерии, а не на группе бактерий [3].

Целью данного исследования является исследование некоторых свойств иммобилизации Bacillus subtilis на алюминиевом сплаве с керамическим покрытием и подбор оптимальных режимов сканирования образцов на СЭМ (Сканирующий Электронный Микроскоп).

Материалы и методы

Микроорганизмы и условия культивирования

Культивирование бактерий Bacillus subtilis проводили на МПБ (Hi-Media) в конических колбах с общим объемом 500 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1:4 на инкубаторе-шейкере с интенсивностью качания 160 об/мин, при 37 ^оС. После, наблюдали за ростом бактерий, определяли подсчет клеток в течение 18 час культивирования с помощью камеры Горяева. Проводили подбор времени стабильности клеток бактерий для иммобилизации (30 минут).

Методы иммобилизации

Для иммобилизации бактерий отобраны сплавы алюминия с керамическим покрытием Amr6, D16 и ZnAl (рис.1, А, Б, В)

Сила тока 5,0 kV, WD-10,6 mm, Cтепень разрешение (PC) -40, увеличение 130 раза, единица измерения клетки 100 mM.

Рисунок 1. Микроструктура поверхности композиционных покрытий AMr6 (А); AlZn(O,Si) (Б); D16 (В) на сканирующем электронном микроскопе (JSM-IT210)

Результаты и их обсуждение

На первом этапе исследований изучали стабильность клеток (через 24 часа роста) к 0,9% раствору NaCl. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что бактерии достаточно стабильны к физиологическому раствору. После фильтрации через мембранный фильтр количество клеток бактерий уменьшается от 1,2х10⁶ кл/мл до 6,8х10⁵ кл/мл. Далее проводили подсчет клеток в течение 180 мин культивирования, при этом было обнаружено, что количество клеток резко уменьшается к 150 мин. Следует отметить, что к 180 минут обработки Bacillus subtilis физиологическим раствором количество клеток составляет 1,0х10⁴ кл/мл. Таким образом, выявлено, что клетки Bacillus subtilis наиболее стабильны к 0,9% раствору NaCl в течение 120 мин. Далее, производили адсорбцию клеток бактерий B. subtilis на твердые сорбенты - носители: Amr 6, D16 и Zn Al. Общее число адсорбированных и неадсорбированных клеток B. subtilis на носителях-сорбентах приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, общее число адсорбированных клеток Bacillus subtilis на сорбенте Amr 6 составляет 164,1х10⁶ клеток при исходном количестве 300,0х10⁶/40 мл суспензии.

Таблица 1.

Общее число адсорбированных и неадсорбированных клеток B. subtilis на носителях-сорбентах

На рисунке 2, 3 и 4 показано, что при иммобилизации бактерий B. subtilis на твердые носители-сорбенты сохраняется морфология бактериальных клеток и целостность поверхностных структур. При проведении исследований были подобраны оптимальные режимы сканирования образцов. Следует отметить, что программное обеспечение сканирующего электронного микроскопа (JSM-IT210) позволяет проводить морфометрический анализ адсорбированных клеток микроорганизмов и определять такие параметры, как длина, ширина и периметр клетки. Следовательно, как видно из рисунка 2, 3 и 4, длина клеток составляет 4,0 мкм, ширина 0,3 мкм. Известно, что адсорбционный метод иммобилизации биообъектов - метод иммобилизации, при которой клетки прикрепляются к любой поверхности / твердому носителю.

Сила тока 3,0 kV, WD-10,9 mm, степень разрешение (PC) -30, увеличение 2.000 раз, единица измерения клетки 10 mM.

Сила тока 3,0 kV и 4,0 kV, WD-10,7 mm и WD-10,8 mm, степень разрешение (PC) -10, увеличение 4.000 и 5 000 раз, единица измерения клетки 5 mM.

Рисунок 2. СЭМ-изображение адгезированных клеток Bacillus subtilus на носителе AMr6

Сила тока 3,0 kV и 4,0 kV, WD-10,7 mm и WD-10,8 mm, степень разрешение (PC) -10, увеличение 500 и 3 500 раз, единица измерения клетки 5 mM.

Рисунок 3. СЭМ-изображение адгезированных клеток Bacillus subtilus на носителе ZnAl

Сила тока 3,0 kV и 4,0 kV, WD-10,7 mm и WD-10,8 mm, степень разрешение (PC) -10, увеличение 2.500 и 4 000 раз, единица измерения клетки 5 mM.

Рисунок 4. СЭМ-изображение адгезированных клеток Bacillus subtilus на носителе D16

Таким образом, адсорбционная иммобилизация биообъектов является наиболее приближенным к естественным процессам прикрепления клеток в природе и, поэтому является простейшим и широко распространенным способом получения иммобилизованных микробных клеток промышленного значения. Адсорбция микроорганизмов, в частности бактерий Bacillus subtilus, на поверхности твердого тела зависит от состояния культуры, фазы ее развития и функционального состояния.

Список литературы:

1. Ефременко Е.Н. Автореф. дисс. докт. биол. наук, Инст. биохим. физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, 2009. 53 с.
2. Cash Phillip Characterisation of bacterial proteomes by two-dimensional electrophoresis, Analytica Chimica Acta, Volume 372, Issues 1–2, 1998, Pages 121-145.
3. Deliorman M., Wolfenden M.L., Suo Z., Beech I.B., Yang X., Avci R. Immobilization and trapping of living bacteria and applications in corrosion studies, Editor(s): T. Liengen, D. Féron, R. Basséguy, I.B. Beech, Understanding Biocorrosion,Woodhead Publishing, 2014, Pages 145-165. https://doi.org/10.1533/9781782421252.1.145.
4. Earl AM, Losick R, Kolter R. Ecology and genomics of Bacillus subtilis. Trends Microbiol. 2008; 16:269–75.
5. Esawy M., Nasser A.E. Heavy metal immobilization in contaminated soils using phosphogysun and rice straw compost Land Degrad. Dev., 26 (2015), pp. 819-824. 10.1002/ldr.2288
6. Najim A. Aya, Radeef Y. Ahmed, al-Doori Ibrahim, Jabbar H. Zaid Immobilization: the promising technique to protect and increase the efficiency of microorganisms to remove contaminants. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 08 March 2024. https://doi.org/10.1002/jctb.7638
7. Paolo Z., Enrico S. Inorganic materials as supports for covalent enzyme immobilization: methods and mechanisms Molecules, 19 (2014), pp. 14139-14194. 10.3390/molecules190914139
8. Westers L, Westers H, Quax WJ. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim Biophys Acta. 2004; 1694:299–310.
9. Wu P.H., Kok K.N., Hong P.K., Yang P.Y., Lin C.F. Treatment of low-strength wastewater at mesophilic and psychrophilic conditions using immobilized anaerobic biomass Chem. Eng. J., 27 (2016), pp. 2341-2353. 10.1016/j.cej.2016.11.077