РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ГАЗО-ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АЦЕТАЗОЛАМИДА

АННОТАЦИЯ

Ацетазоламид относится к диуретикам ингибиторов карбоангидразы и применяется для лечения сердечной и сердечно-легочной патологии, эпилепсии, ликвородинамических расстройств, а также глаукомы, хронической внутричерепной гипертензии. Зафиксированы случаи отравления этим препаратом. Разработана методика анализа ацетазоламида методом газо-хромато-масс-спектрометрии. Подобраны оптимальные условия хроматографирования и получены данные по дериватографии ацетазоламида. На основании термической характеристики и данных масс-спектрометрии разработана предположительная схема распада ацетазоламида.

ABSTRACT

Acetazolamide belongs to the carbonic anhydrase inhibitor diuretics and is used to treat cardiac and cardiopulmonary pathologies, epilepsy, liquorodynamic disorders, as well as glaucoma, chronic intracranial hypertension. There have been documented cases of poisoning with this drug. A method for analyzing acetazolamide using gas chromatography-mass spectrometry has been developed. Optimal chromatography conditions were selected and data on derivatography of acetazolamide were obtained. Based on thermal characteristics and mass spectrometry data, a hypothetical decomposition scheme of acetazolamide has been developed.

Ключевые слова: газо-хромато-масс-спектрометрия, дериватография, ацетазоламид, метилирование.

Keywords: gas chromatography-mass spectrometry, derivatography, acetazolamide, methylation.

Диуретический препарат ацетазоламид является ингибитором карбоангидразы. Среди показаний к применению основными заболеваниями являются сердечно-сосудистые заболевания, глаукома, внутричерепная гипертензия, эпилепсия и др. Влияние ацетазоламида на другие системы организма проявляется в результате его способности блокировать карбоангидразу, так, препарат резко усиливает выделение ионов калия и бикарбоната, что ведет к ацидозу. Из-за широкого использования диуретиков среди населения, в частности ацетазоламида в терапии различных заболеваний ежегодно увеличивается количество случаев самолечения, и соответственно, отравления лекарственными препаратами этой группы [6, c. 40-47; 8, c. 25-27]. В связи с этим химико-токсикологическое изучение и разработка экспресс анализа ацетазоламида является актуальной задачей.

Целью настоящего исследования является разработка методики определения ацетазоламида методами газо-хромато-масс-спектрометрии и дериватографии, подобрать оптимальные условия хроматографирования, а также выявить термические характеристики препарата для определения его в биологических жидкостях.

Методы. Большинство диуретических лекарственных веществ, в том числе ацетазоламид, имеют в молекуле несколько полярных групп, что ведет к разложению препарата и тем самым являются термически нестабильными. Для переведения их в летучее состояние и достижения термической стабильности ацетазоламид необходимо предварительно перевести в метильное производное по карбоксильной группе (или по аминогруппе).

Для газо-жидкостного хроматографического анализа ацетазоламида предварительно проводили дериватизацию (метилирование). Для этого использовали следующую методику: 0,01 г ацетазоламида растворяли в 1000 мкл безводного ацетонитрила. К раствору добавляли 100 мг калия карбоната и 100 мкл йодистого метила. Склянку плотно закрывали и нагревали при 60⁰С в течение 1 часа. Затем из жидкости верхний слой сливали и полученный раствор использовали непосредственно для хроматографии [1, c.27-29; 5, c.12-18; 3, c.36–49].

Газо-жидкостная хроматография в комбинации масс-спектрофотометрией один из наиболее эффективных методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах. Для исследования ацетазоламида методом ГХ-МС использовали хромато-масс-спектрометр фирмы Agilent Technologies, модели 6890N/5973N (США). Хроматографируемая колонка (HP-5MS) длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве подвижной фазы - газа-носителя использовали гелий, со скоростью расхода - 1,2 мл/мин. При хроматографировании температуры инжектора и интерфейса поддерживались при 280ºС, а температура колонки программировалась: от 90ºС (1мин) до 310ºС (5 мин) со скоростью 35ºС/мин. Количество вводимого образца составил 1 мкл и осуществляли ввод в режиме без деления потока газа-носителя. Для масс-спектрометра был выбран режим сканирования спектров электронного удара при 70 эВ в диапазоне от 31 до 550 дальтон. Напряжение электронного умножителя устанавливали по результатам автоматической настройки прибора. Для этого использовали программу AUTOTUNE из стандартного пакета математического обеспечения фирмы-производителя.

Кроме этого, была предоставлена фирмой-производителем, масс-спектры библиотек WILEY7N, NIST05 и PMW-TOX3, которые использовали для сравнения полученных масс-спектров по стандартной методике. Идентификацию веществ проводили сравнением времени хроматографического удерживания пиков исследуемого вещества и времени удерживания вещества сравнения, а также при совпадении масс-спектров указанных хроматографических пиков с библиотечными с вероятностью более 90%.

Рисунок 1. Хроматограмма метилпроизводного ацетазоламида и его масс- спектр

Подготовка проб. Приготовление стандартных растворов ацетазоламида: для этого готовили стандартные растворы препарата (1 мг/мл) в этаноле. Из этих растворов с помощью разведения были приготовлены рабочие стандартные растворы в воде. Водные растворы содержали ацетазоламид в количестве 0,1 мг/мл; 0,01 мг/мл; 0,001 мг/мл.

Для экстракции ацетазоламида из мочи использовали кислотные toxi-tubes- B и щелочные toxi-tubes- А фирмы Varian (USA). В toxi-tubes с разными рН среды, наливали разведенные рабочие стандартные растворы ацетазоламида, встряхивали и проводили экстракцию. Затем верхнюю органическую часть отделяли и упаривали до сухого остатка. Далее проводили метилирование следующей методике: сухой остаток растворяли в 100 мкл ацетонитрила и к нему добавляли 10 мг калия карбоната и 50 мкл йодистого метила. Полученные смеси нагревали в термостате при 60⁰С в течение 1 часа. Полученные таким образом испытуемые растворы исследовали методом ГХ-МС. Для этого пробы вводили в инжектор и хроматографировали в вышеуказанных условиях [2, c.22-25; 7, c.1044-1048].

Полученные таким образом испытуемые растворы, хроматографировали в вышеуказанных условиях и при этом были зафиксированы в масс-спектрах ацетазоламида следующие характерные ионы метилпроизводных: ацетазоламид: 264, 248, 108, 83, 43 m/z; На рисунке 1 приведены хроматограмма метилпроизводного ацетазоламида и его масс- спектр.

Основные характеристические ионы в масс-спектрах исследуемого препарата ацетазоламида приведены в таблице 1.

Лекарственное вещество при вполне определенной температуре подвергается химическим превращениям (термической деструкции). Дериватография дает ценные сведения о поведении лекарственных веществ при нагревании и позволяет охарактеризовать их термическую стабильность по температурам термоэффектов и соответствующему изменению массы образца [4, c.22].

Таблица 1.

Основные характеристические ионы в масс-спектрах ацетазоламида

Эндотермические эффекты, представляющие на дериватограмме показывает распад молекулы (убыль массы) при определенной температуре. Используя данные ИК- и масс- спектрометрии можно идентифицировать продукты превращения вещества, т.е. какие ионы или функциональные группы теряет при нагревании образца.

Кривая ΔТ=ƒ( ζ) представляет собой зависимость разности температур между исследуемым образцом и эталоном от времени нагревания и называется дифференциальной кривой нагревания (ДТА). Простая кривая потери массы (ТГ) представляет собой зависимость изменения массы вещества от времени или температуры нагревания в данной среде. Дифференциальную кривую потери массы исследуемого образца по времени или температуре (ДТГ) следует откладывать по оси ординат, а время или температуру – по оси абсцисс.

Термический анализ регистрировали на дериватографе системы Паулик-Паулик-Эрдей со скоростью 8 град/мин и навеской 31-104 мг при чувствительности гальванометров Т-900. На рисунке 2 представлена дериватограмма рабочего стандартного образца ацетазоламида.

Кривая нагревания пробы (РСО ацетазоламида) характеризуется тремя экзотермическими эффектами при 270, 423, 643°С и одним эндотермическим – при 280°С. Первый экзоэффект протекает с уменьшением массы на 6,45%. Эндотермический эффект при 280°С характеризуется разложением образца. Потеря массы в диапазоне температур 275-295°С по кривой ТГ составляет 33,55%. Дальнейшее повышение температуры приводит к ступенчатому разложению, которое наблюдается по кривым ТГ и ДТГ. В области протекания экзотермического эффекта при 423°С потеря массы составляет (в диапазоне температур 295-507°С) 38,71%. Последняя стадия разложения соединения протекает в интервале температур 507-670°С и убыль массы по кривой ТГ – 17,73%. Общая потеря массы в диапазоне 25-800°С составляет 96,77%.

Рисунок 2. Дериватограмма рабочего стандартного образца ацетазоламида

Результаты. На основании дериватографических данных следует заключить, что термическое поведение образцов зависит от состава и строения веществ. В дериватограмме ацетазоламида имеется только один эндотермический эффект. Первый экзоэффект (при 270°С) протекает с уменьшением массы на 6,45%. Эндотермический эффект при 280°С характеризуется разложением образца. Эти сведения дают предположение, что ацетазоламид метаболизируются в организме в незначительной степени.

Заключение. Разработана методика определения ацетазоламида методом ГХ-МС. При этом были зафиксированы в масс-спектрах исследуемого образца следующие характерные ионы метилпроизводных: 264, 248, 108, 83, 43 m/z. ГХ-МС и дериватографическое исследование молекулы препарата подтвердила предположительную схему метаболизма. Результаты анализа мочи добровольца, принявшего внутрь ацетазоламид показали, что препарат подвергается метаболизму в незначительных количествах. Таким образом, разработанная нами методика ГХ-МС анализа ацетазоламида позволяет определять и вполне достоверно идентифицирует его в лекарственных средствах и биологических жидкостях по характерным ионам в масс-спектрах.

Cписок литературы:

1. Алиходжаева М.И., Симонов Е.А., Киричёк А.В., Попков В.А. Хромато-масс-спектрометрическое определение некоторых диуретиков в биологических жидкостях // Судебно-медицинская экспертиза. – 2009. – Т. 52. – №. 5. – С. 27-29.
2. Алиходжаева М. И., Атаханов А. Ш., Жалилов Ф. С. Определение некоторых антиаритмических лекарственных средств методами хроматографического скрининга // Universum: химия и биология.-2024.- № 2 (1 (115)).- С. 22-25.
3. Гладилович В. Д., Подольская Е. П. Возможности применения метода ГХ-МС // НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2010, том 20, № 4, c. 36–49
4. Зайченко В.С. Определение термостабильности активных фармацевтических ингредиентов суппозиториев для лечения заболеваний предстательной железы. //Материалы XIII научно-практической конференции молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абу Али ибн Сино. - 27 апреля 2018, Душанбе.- C.22.
5. Илларионова Е. А., Сыроватский И. П. Основы метода масс-спектрометрии. Практическое применение метода: учебное пособие // ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, Кафедра фармацевтической и токсикологической химии. – Иркутск : ИГМУ, 2021. – 49 с.
6. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. - М.: Реафарм.- 2004.- 144 с.
7. Крылова Е.А., Катаев С.С., Хомов Ю.А. Применение метода газовой хроматографии – масс-спектрометрии для определения различных дериватов метаболитов золпидема и продукта его гидролиза // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 5-5. – С. 1044-1048;
8. Bles C., Van der Hoeven J.G., Hoedemaekers C. Acetozolamide induced hyperammonaemia: a case report and review of the literature //Netherlands Journal of Critical Care. – 2014– no.1-volume 18 –-Р. 25-27.