ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ У ЧЕЛОВЕКА В КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

АННОТАЦИЯ

В работе проводится сравнительная оценка двух методов количественного определения церулоплазмина, таких как иммуноферментный анализ (ELISA) и биохимическая спектрофотометрия. Показано, что иммунологические методы могут давать завышенные результаты вследствие взаимодействия антител с апоформами церулоплазмина. Для преодоления этой проблемы авторы исследовали влияние ингибиторов протеолиза на стабильность структуры церулоплазмина. Кроме того, проанализировано влияние сопутствующих воспалительных процессов на концентрацию церулоплазмина. Представленные результаты имеют важное значение для оптимизации лабораторной диагностики генетических нарушений, связанных с экспрессией церрулоплазмина.

ABSTRACT

The paper presents a comparative assessment of two methods for the quantitative determination of ceruloplasmin, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and biochemical spectrophotometry. It is shown that immunological methods can give overestimated results due to the interaction of antibodies with apoforms of ceruloplasmin. To overcome this problem, the authors investigated the influence of protease inhibitors on the stability of the ceruloplasmin structure. In addition, the influence of concomitant inflammatory processes on the concentration of ceruloplasmin was analyzed. The presented results are important for optimizing the laboratory diagnosis of genetic disorders associated with the expression of ceruloplasmin.

Ключевые слова: церулоплазмин (СР), апоцерулоплазмин, биохимические методы, ингибиторы протеолиза, воспаление, биомаркеры, апоформы (apoCP).

Keywords: ceruloplasmin (CP), apoceruloplasmin, biochemical methods, protease inhibitors, inflammation, biomarkers, apoforms (apoCP).

ВВЕДЕНИЕ

Церулоплазмин (СР) представляет собой синий альфа-2 гликопротеин сыворотки крови с молекулярной массой 150 000–160 000 г/моль, который впервые был выделен из плазмы Хольмбергом и Лореллом в 1948 году [3, c. 77–86]. Он связывает 90–95 % меди (Cu) плазмы крови, содержит 6–7 ионов Cu на молекулу и проявляет ферроксидазную [5, c. 403–410], аминоксидазную, супероксидазную активность, а также участвует в метаболизме меди и железа.

Ген СР расположен на хромосоме 3 – 3q23q24. Этот белок насчитывает 1046 аминокислотных остатков, молекула функционального церулоплазмина состоит из восьми субъединиц, каждая из которых может присоединять один ион меди. Одна молекула церулоплазмина, содержит в среднем от шести до восьми атомов меди в структуре, которые определяют его биологические функции в организме. Шесть атомов меди играют важнейшую роль в ферроксидазной и свободнорадикальной активности белка, а также в окислении малых гормональных молекул. Остальные ионы легко диссоциируют от церулоплазмина и могут транспортироваться и обмениваться между церулоплазмином и альбумином или транскупреином. Церулоплазмин продуцируется и секретируется гепатоцитами [4, c. 1–23.] Каждая субъединица представляет собой мономер белка, обозначаемого как apoCP. Углеводный компонент СР (2–8 % от массы молекулы) включает 9 олигосахаридных цепей, содержащих глюкозамин (15,7–19,2 %), маннозу (14,2 %), галактозу (12,3 %), фукозу (1,6 %), сиаловые кислоты (8,6 %). Медь составляет 0,27–0,32 % от всей массы белка.

Определение концентрации СР имеет большое значение в диагностике ряда генетических заболеваний, таких как Болезнь Вильсона-Коновалова, болезнь Менкеса, ацерулоплазминемия и обладает клиническим потенциалом в качестве маркеров болезни Паркинсона или даже депрессивных расстройств и шизофрении. Кроме того, церулоплазмин является маркером острой фазы, который часто повышается при воспалении, тяжелой инфекции, повреждении тканей и некоторых видах рака [8, c. 77–84].

Как правило, в норме у человека содержание CP в сыворотке крови составляет от 20–50 мг/дл. [14, c. 512–520].

Современные аналитические процедуры для определения Cp включают иммунотурбидиметрию и иммуноферментный анализ с образованием иммуных агрегатов, светопоглощение которых пропорционально концентрации Cp в образце, [17, c. 149–157] радиальный иммунодифузионный тест (RID) [19, c. 195–210] и бихроматический анализ [9, c. 311–316]. При сравнении RID с иммунотурбидометрией была обнаружена значительная погрешность, которая частично объяснялась различиями в источниках антисывороток, используемых в двух методах. [19, c. 195–210]. В случае бихроматического метода процедура основана на оксидазной активности Cp в отношении таких веществ, как бензидин. Бихроматический метод, в данном случае, является особенным методом анализа, который требует принятия специальных мер предосторожности в связи с токсичностью бензидина, известным канцерогеном. Этот метод обнаруживает только комплексную молекулу церулоплазмина, но не его апоформу, апоцерулоплазмин (apoCp). Еще одним недостатком этого метода является его ограниченная эффективность, поскольку церулоплазмин не имеет отдельного субстрата [11, c. 499–506].

Таким образом, бихроматический метод, несмотря на свои преимущества, не является идеальным вариантом для определения концентрации апоцерулоплазмина и церулоплазмина. Дополнительные исследования и разработка новых подходов могут быть необходимы для более точного и эффективного определения концентрации обоих форм церулоплазмина.

Наиболее широкое применение в современной диагностике на сегодня получили иммунологические методы определения концентрации СР. Однако отмечено, что иммунологические методы также имеют недостатки. Важнейшей проблемой является завышение концентрации СР, обусловленные реакцией специфичных антител с субъединичными формами аппофермента, который образован в результате спонтанной диссоциации «зрелого» октамера СР. Поскольку антисыворотки вступают в реакцию как зрелыми, так и с apoCp, что приводит к повышенным концентрациям Cp [3, c. 77–86]. Так, в исследовании Соловьева и его соавторов было выявлено, что у пациентов с болезнью Вильсона, в некоторых случаях неожиданно наблюдались нормальные концентрации Cp в сыворотке крови [14, с. 512–520]. Уровень церулоплазмина в сыворотке крови при болезни Вильсона обычно снижен, также церулоплазмин может быть снижен особенно у гетерозиготных носителей и лиц с иными заболеваниями печени (например, вирусном гепатите, лекарственной или алкогольной болезни печени). Низкий уровень церулоплазмина у больных с кольцами Кайзера – Флейшера позволяет диагностировать заболевание. Кроме того, уровень церулоплазмина < 5-7 мг/дл, с высокой вероятностью указывает на наличие заболевания независимо от его клинических проявлений [4, с. 1–23].

Таким образом, в ряде случаев точное определение концентрации СР является одним из оснований постановки диагноза генетического синдрома. В случае генетических нарушений биосинтеза концентрация СР закономерно снижена. Важно также учитывать, что СР является белком воспалительной реакции и повышается при различных опухолевых и воспалительных состояниях, таких как карциномы, лейкемия, болезнь Ходжкина, первичный билиарный цирроз, системная красная волчанка и ревматоидный артрит [17, с. 149–157].

Другими наиболее часто используемыми в клинической практике методами являются ЕLISA и иммунотубидометрия.

При количественном определении СР методом ЕLISA используют стандартные калибраторы для построения графика концентраций стандартов. А поскольку ЕLISA включает в себя несколько длительных по времени этапов (связывание антигена, отмывку неспецифичных белков, окрашивание и т.п.) то, в процессе постановки возможна также частичная диссоциация субъединиц СР [11, с. 499–506].

Иммунотурбидиметрия – более быстрый и прямой метод определения специфичных белковых антигенов путем их взаимодействия со специальными антителами и образованием иммунокомплекса [18, с. 3875–3884].

Таким образом, характерной проблемой при анализе концентрации белков со сложной пространственной структурой, таких как церулоплазмин, является их спонтанная диссоциация на субъединицы. Решение данной проблемы, вероятно, должно быть направлено на предотвращение диссоциации церулоплазмина.

Одним из возможных путей совершенствования методики определения концентрации церулоплазмина может стать применение хорошо растворимых, нейтральных ингибиторов протеолиза. Данные ингибиторы могут быть как природного, так и синтетического происхождения, демонстрируя разнообразие своей структуры и химических свойств [17, с. 149–157].

В связи с этим, целью данного исследования стала сравнительная оценка различных методов количественного определения церулоплазмина, таких как иммуноферментный анализ (ELISA) и биохимическая спектрофотометрия, а также сравнительное изучение влияния ингибиторов протеолиза и физиологических факторов воспаления на определение концентрации СР.

Для решения этой проблемы мы провели сравнительное исследование, в результате которого была определена концентрация церулоплазмина у 100 пациентов с генетическими нарушениями с использованием двух протеолитических ингибиторов протеаз.

Использование ингибиторов протеаз таких, как cOmplete™, Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche), представленных в стеклянном флаконе, являются эффективным средством для защиты белков от протеолитического разрушения. Они обладают способностью подавлять активность протеаз и широко применяются в биохимических исследованиях [5, с. 403–410].

PMSF (фенилметилсульфонилфторид) – это сильный и неспецифический ингибитор протеаз, широко используемый в биохимических и биологических исследованиях. PMSF способен образовывать ковалентные связи с нуклеофильными аминокислотами в активном сайте протеазы, что приводит к ее нерегулярным и необратимым изменениям [6, с. 1860–1866]. Этот ингибитор применяется для предотвращения протеолитической деградации белков в ходе экспериментов, в частности, при изоляции белков из клеток или тканей.

Задачи данного исследования

1. Сравнить два метода исследований метод ELISA и иммунотурбидометрический, и определить наиболее эффективный метод определения более точной концентрации СР для клинической практики.

2. Оценить влияние ингибиторов на протеолиз октамерной молекулы СР.

3. Провеcти параллельное определение маркеров воспаления (СРБ, СОЭ), с целью определения их влияния на концентрацию СР.

Материалы и методы

2.1. Процедура исследования, отбор проб и подготовка

В данное исследование были вовлечены в совокупности 250 детей в возрасте от 1 года, проходивших обследование и лечение у высококвалифицированных врачей-генетиков. Группу контроля составили 250 детей, у которых отсутствовали как семейный анамнез, так и клинические проявления синдромов, ассоциированных с нарушениями обмена церулоплазмина.

 Родители детей-пациентов, принявших участие в исследовании, предоставили информированное письменное согласие на их участие после ознакомления с целями и методологией проводимого исследования. Информирование родителей и получение их согласия на участие в работе осуществлялось на этапе отбора пациентов. Окончательный диагноз каждому ребенку устанавливался высококвалифицированными врачами-генетиками.

2.2. Определение концентрации СР методом ELISA

Определение концентрации церулоплазмина осуществлялось с использованием коммерческого иммуноферментного набора HUMAN CERULOPLASMIN ELISA Assay Kit (HCP31-K01) USA, предназначенного для иммуноферментного (Immunoperoxidase Assay) количественного анализа содержания церулоплазмина в образцах человеческого происхождения.

Натощак, у каждого испытуемого из обеих групп отобрали по 5 мл венозной крови и поместили ее в вакуумтейнер. Постановку ELISA анализа выполнили согласно инструкции от производителя, а именно:

На первом этапе 100 мкл разведенных образцов и калибровочных стандартов вносили в лунки планшета и инкубировали 60 минут при комнатной температуре. После двукратной промывки добавляли 100 мкл биотин меченных антител, и инкубировали еще 2 часа при 37°С. Затем лунки промывали трижды, вносили 100 мкл субстратного раствора и инкубировали 30 минут. Промывали 5 раз и добавляли 90 мкл ТМБ. Для проявления краски инкубировали 20 минут в темноте. Реакцию останавливали 50 мкл стоп-раствора и измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты были считаны на приборе при длине волны 450 нм, и был построен калибровочный график.

Концентрацию церулоплазмина в образцах определяли по калибровочному графику стандартных аналогов. Следует отметить, что заявленная производителем чувствительность набора составляла 75 pg/ml и в этой связи исследуемые образцы разводились в миллион раз 10ˉ⁹.Полученные значения для калибровочной кривой пересчитывали с учетом этого разведения.

2.3. Иммунотурбидиметрический анализ

Определение содержания СР проводили с помощью биохимического спектрофотометрического набора согласно инструкции производителя Ceruloplasmin Turbidimetry. (Spectrum, Germany).

Принцип набора основан на способности церулоплазмина образовывать комплекс с п-фениленилендиамином (PPD), в присутствии раствора Tris buffer 20 mmol/L с PEG 8000 при pH 8.3, что приводит к изменению цвета реакции. Измерение абсорбции с использованием спектрофотометра позволяет определить концентрацию церулоплазмина в образце на основе калибровочной кривой. Такой подход обеспечивает более точные и надежные результаты, и позволяет исследователям определить содержание церулоплазмина с высокой точностью и повторяемостью. Методика спектрофотометрического анализа с использованием набора фирмы SPECTRUM является универсальной, простой в использовании и широко применяемой в клинической диагностике и научных исследованиях.

Для определения концентрации церулоплазмина были приготовлены калибровочные растворы, по которым построили калибровочный график. Исследуемую сывороточную пробу использовали без предварительного разведения, сразу после забора и центрифугирования.

Анализ включал добавление 7 мкл образца или калибратора к реагенту R1, перемешивание и регистрацию первого значения оптической плотности (А1) по автоматической программе. Затем добавляли 200 мкл реагента R2 и через 2 минуты считывали второе значение оптической плотности (А2). Концентрацию церулоплазмина в образце рассчитали по специальной формуле.

Согласно характеристикам набора, предел чувствительности составлял 3,27 мг/дл, а диапазон линейности – до 120 мг/дл.

2.4. Приготовление растворов ингибиторов протеаз

В качестве ингибиторов протеаз мы выбрали и использовали 2 ингибитора:

Использование PMSF

Для приготовления раствора PMSF (SIGMA, США) ранее добавляли 0,087 грамма PMSF к 1 мл изопропанола. Раствор перемешивали на вортексе при комнатной температуре для эффективного смешивания. Полученный раствор был пресыщенным и готовым к использованию. Для полного растворения кристаллов PMSF раствор нагревали при 42°C в течение 60 минут. После этого раствор хранили в темном месте. Для кратковременного хранения раствор можно было оставлять при комнатной температуре, а для длительного рекомендовалось хранить при 4°C. Перед использованием раствор следовало снова прогреть. В зависимости от объема пробы, добавляли 0,2–0,5 мкл рабочего раствора PMSF, тщательно перемешивая для равномерного распределения ингибитора. Далее проводили определение содержания церулоплазмина с использованием указанного протокола.

Для приготовления рабочего (7х) раствора ингибиторов протеаз, одна таблетка COMPLETE MINI PROTEASE INHIBITOR COCKTAIL TABLETS (Roche) была растворена в 1,5 мл охлажденного забуференного физиологического раствора или деионизированной воды. Раствор тщательно перемешивался с помощью вортекса или пипетирования до полного растворения таблетки. Приготовленный раствор использовался непосредственно после приготовления. Для экспериментов отбиралось необходимое количество раствора ингибиторов протеаз в 100–150 мкл сыворотки в соотношении 1:70 согласно рекомендациям производителя. После добавления раствора ингибиторов протеаз к образцу белка, смесь тщательно перемешивалась для обеспечения равномерного распределения ингибиторов. Все манипуляции проводились с соблюдением мер предосторожности при работе с химическими веществами.

Результаты и их обсуждения

1. Концентрация СР как важный диагностический показатель

Содержание СР может изменяться при ряде генетических заболеваний, таких как болезнь Вильсона-Коновалова и болезнь Менкеса. Эти заболевания, связанные с нарушением обмена меди в организме, могут привести к снижению или полному отсутствию церулоплазмина в крови. Однако, в некоторых исследованиях, с подозрением на гипоцерулоплазмению отмечается завышенный уровень церулоплазмина у пациентов. В настоящее время проведено лишь небольшое исследование, в ходе которого были обнаружены повышенные уровни церулоплазмина у лиц с обсессивно-компульсивным расстройством [7, с. 590–596]. Интересно отметить, что, вопреки ожиданиям, уровень трансферрина также оказывался повышенным в некоторых случаях, когда предполагалось его снижение [8, с. 77–84].

Поскольку концентрация СР служит важным диагностическим показателем, то определение условий для получения наиболее точной концентрации СР является актуальной научной задачей.

В этой связи в данной работе, с целью сравнительного изучения, авторы статьи использовали на первых этапах своего труда набор ELISA для количественного определения СР. Однако, уже на начальных этапах постановки было выявлено сильное варьирование как клинических проб, так и самих стандартов из набора. По-видимому, это связано с низким рангом определяющих концентраций набора и его чувствительности. Кроме того, метод ELISA имеет и другие минусы и неудобства. Во-первых, он может быть времязатратным процессом, требующим нескольких этапов и инкубаций, что ведет к распаду октамера СР. Также при использовании набора ELISA образцы сыворотки крови необходимо сильно разводить, что ведет к погрешностям.

С практической точки зрения, решающее значение имеет сохранение глобулярной структуры СР, а при проведении иммуноферментного анализа (ELISA) наблюдается диссоциация глобулы СР на субъединицы. Вероятно, вариабельность результатов в ELISA связана преимущественно с перечисленными факторами.

На этом основании для дальнейших исследований мы использовали биохимический метод определения СР. С этой целью изначально были получены значения оптической плотности для стандартов разведения СР (табл. 1).

Постановка калибровочных стандартов осуществлено в нескольких повторах. В таблице 1 приведены усредненные данные по последним трем повторам разведений калибровочных растворов.

Таблица 1.

Данные по концентрпации СР для растворов стандартов

На основании полученных значений по оптической плотности растворов стандартов строили калибровочный график (рис. 1):

Рисунок 1. Стандартная калибровка СР в интервале от 3 mg/dl до 35 mg/dl. Как видно из представленного графика имеется четко линейная закономерность на заданном интервале

Нормальные значения содержания церулоплазмина в крови человека различаются в зависимости от возраста и составляют:

- Новорожденные (0–28 дней): 15–60 мг/дл

- Дети (1 месяц – 18 лет): 20–60 мг/дл

- Взрослые (18–65 лет): 20–50 мг/дл

- Пожилые (старше 65 лет): 25–60 мг/дл

При проведении исследования было обследовано 100 детей с подозрением на генетические нарушения ряда биохимических маркеров, прежде всего из-за отклонения в показателях содержания меди в крови и в моче [18, с. 3875–3884]. В ходе этой работы основным методом определения концентрации СР был выбран биохимический метод. Тем не менее, уже в начале работы у части пациентов были выявлены образцы с отклонениями от ожидаемых значений СР. Предполагая, что это может быть обусловлено диссоциацией белковой глобулы СР на апоформы, мы стали добавлять ингибиторы к свежеотобранным образцам пациентов.

Следует отметить, что изменение концентрации Сu², как правило при генетических синдромах напрямую связано с ее изменением СР [12, с. 6082–6092].

1. Влияние ингибиторов протеолиза на стабильность макромолекул церулоплазмина

В рамках нашего исследования применялись два вида ингибиторов, призванных предотвратить протеолитическое расщепление и диссоциацию глобулы церулоплазмина. С целью оценки эффективности данных ингибиторов мы провели тестирование 10 образцов пациентских проб, разделенных на три группы. В первую группу ингибиторы протеаз не добавлялись, тогда как во вторую и третью группы они были введены. Последующий анализ данных выявил следующие закономерности.

Таблица 2.

Влияние ингибиторов протеаз на концентрацию СР

Согласно проведенным исследованиям при биохимическом определении может действительно варьировать за счет диссоциации глобулы. Поскольку атнисыворотка биохимического набора реагирует как с цельной глобулой, так и с апоформами, то регистрируемая концентрация условно повышается. В то же время добавление ингибиторов к образцам, очевидно, замедляет диссоциацию глобулы СР, что дает более объективные с клинической точки зрения данные о содержании СР в сыворотке пациента. При этом стоит отметить, что наиболее выраженная ингибиторная способность регистрируется при добавлении к образцам PMSF.

Сравнивая значения в двух последних столбцах (2 и 3), можно заметить, что во всех случаях уровень показателя образования СР ниже в образцах с добавлением ингибитора протеаз по сравнению с образцами без ингибитора. Как видно из представленных результатов уровень СР одного и того же образца зависит от наличия или отсутствия ингибиторов.

2. Влияние общевоспалительных маркеров на содержание СР в крови (СОЭ, СРБ)

Другим важным моментом является состояние пациента на момент забора образца крови, особенно при первичном обследовании на заболевания, связанные с генетическими нарушениями продукции церулоплазмина. Поскольку СР является белком воспалительной реакции, то воспаление в организме индуцирует усиление продукции СР и его концентрация повышается на определенный период времени [13, с. 321–336]. В этой связи на начальном этапе работы нами проведено обследование 10 пациентов, у которых вместе с СР, определяли СОЭ и СРБ.

Рисунок 2. Концентрация СОЭ

Пациенты, с повышенной концентрацией СОЭ и СРБ, были направлены на повторное тестирование концентрации СР, после нормальной концентрации СОЭ и СРБ.

Заключение

В данной работе была проведена сравнительная оценка двух методов количественного определения церулоплазмина: иммуноферментного анализа (ELISA) и биохимической спектрофотометрии. Установлено, что использование ELISA для количественного определения концентрации церулоплазмина является малоэффективным и недостоверным. Это связано с диссоциацией высокомолекулярных белков на апоформы, что приводит к неточному воспроизведению результатов, как и в случае с другими высокомолекулярными белками. Полученные нами результаты по определению концентрации церулоплазмина методом ELISA согласуются с данными, полученными Aisen P., William C. Cho и другими авторами при исследовании макромолекулы трансферрина [4, с. 1–23].

Показано, что добавление ингибиторов протеолиза (PMSF и Coctail Tablets) оказывает положительное влияние на сохранение структуры церулоплазмина.

Установлено, что наличие выраженной воспалительной реакции влияет на концентрацию церулоплазмина: при повышении скорости оседания эритроцитов наблюдается тенденция к увеличению концентрации церулоплазмина на 20–35 %, аналогичная закономерность прослеживается и в отношении С-реактивного белка – повышение его уровня сопровождается увеличением концентрации церулоплазмина в среднем на 15–25 %.

Таким образом, результаты исследования показывают, что наиболее точное определение концентрации церулоплазмина следует проводить методом биохимической спектрофотометрии, особенно у пациентов с подозрением на ацерулоплазминемию в период ремиссии.

Список литературы:

1. Оксенюк О.С., Калмыкова Ю.А., Смирнова О.Б., Пасечник Д.Г. Роль окислительного стресса в развитии хронической болезни почек и способы его оценки // Журнал фундаментальной медицины и биологии. – 2016. – № 1. – С. 15–24.
2. Соловьев Н., Ала А., Шильски М., Миллс С., Уиллис К., Харрингтон К.Ф. Биомедицинское определение меди в связи с болезнью Вильсона с использованием сильноанионообменной хроматографии в сочетании с трехквадрупольной масс-спектрометрией плазмы с индуктивной связью // Analytica Chimica Acta. – 2020. – Vol. 1098. – P. 27–36.
3. Ткачук Е.А., Семинский И.Ж. Классификация наследственных заболеваний (лекция) // Байкальский медицинский журнал. – 2023. – Т. 2. – № 2. – С. 77–86.
4. An Y., Li S., Huang X., Chen X., Shan H., Zhang M. The role of copper homeostasis in brain disease // International Journal of Molecular Sciences. – 2022. – Vol. 23. – P. 1–23.
5. Brissot P., Ropert M., Le Lan C., Loréal O. Non-transferrin bound iron: A key role in iron overload and iron toxicity // Biochim Biophys Acta Gen Subject. – 2012. – Vol. 1820. – No. 3. – P. 403–410.
6. Członkowska A., Rodo M., Wierzchowska-Ciok A., Smolinski L., Litwin T. Accuracy of the radioactive copper incorporation test in the diagnosis of Wilson disease // Liver International. – 2018. – Vol. 38. – P. 1860–1866.
7. Dong Y., Wang R.M., Yang G.M., Yu H., Xu W.Q., Xie J.J., Zhang Y., Chen Y.C., Ni W., Wu Z.Y. Role for Biochemical Assays and Kayser-Fleischer Rings in Diagnosis of Wilson's Disease // Clinical Gastroenterology and Hepatology. – 2021. – Vol. 19. – P. 590–596.
8. Harris, Z. L. Chapter 9 − Ceruloplasmin // Clinical and Translational Perspectives on Wilson Disease. – Academic Press, 2019. – P. 77–84.
9. Lippi G., Salvagno G.L., Montagnana M., Brocco G., Guidi G.C. Influence of hemolysis on routine clinical chemistry testing // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. – 2006. – Vol. 44. – No. 3. – P. 311–316. doi: 10.1515/CCLM.2006.054.
10. Lopez M.J., Royer A., Shah N.J. Biochemistry, Ceruloplasmin // StatPearls. – Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2024. – PMID: 32119309.
11. Martinez X., Chavent M., Baaden M. Visualizing protein structures─tools and trends // Biochemical Society Transactions. – 2020. – Vol. 48. – No. 2. – P. 499–506.
12. Patel C.K., Mukherjee T.K. Biomolecular Condensation of Trypsin Prevents Autolysis and Promotes Ca2+-Mediated Activation of Esterase Activity // Biomacromolecules. – 2024. – Vol. 25. – No. 9. – P. 6082–6092.
13. Patil M., Sheth K.A., Krishnamurthy A.C., Devarbhavi H. A review and current perspective on Wilson disease // Journal of Clinical and Experimental Hepatology. – 2013. – Vol. 3. – P. 321–336.
14. Poujois A., Woimant F. Wilson's disease: A 2017 update // Clinics and research in hepatology and gastroenterology. – 2018. – Vol. 42. – P. 512–520.
15. Salman H.M., Amin M., Syed J., Sarfraz Z., Sarfraz A., Sarfraz M., Farfán Bajaña M.J., Felix M., Cherrez-Ojeda I. Biochemical testing for the diagnosis of Wilson's disease: A systematic review // Journal of Clinical Laboratory Analysis. – 2022. – Vol. 36. – e24191.
16. Sánchez-Monteagudo A., Ripollés E., Berenguer M., Espinós C. Wilson's Disease: Facing the Challenge of Diagnosing a Rare Disease // Biomedicines. – 2021. – Vol. 9. – P. 1100.
17. Stepien K.M., Guy M. Caeruloplasmin oxidase activity: Measurement in serum by use of o-dianisidine dihydrochloride on a microplate reader // Annals of Clinical Biochemistry. – 2018. – Vol. 55. – P. 149–157.
18. Sun H., Liu J., Xiao P. Epitope mapping of antibodies in C-reactive protein assay kits by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry explains differential results across kits Annals of Clinical Biochemistry. – 2022. – Vol. 414. – P. 3875–3884.
19. Vasilyev V.B. Looking for a partner: Ceruloplasmin in protein-protein interactions // Biometals. – 2019. – Vol. 32. – P. 195–210.