ХИМИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ОБРАЗЦОВ ВИШНИ Prunus cerasus L. (Rosaceae) ФЕРГАНСКОГО РЕГИОНА

АННОТАЦИЯ

В статье приведены данные по определению количественного состава химических компонентов образцов вишни из двух районов Ферганской области Узбекистана: органических кислот (щавелевая, винная, лимонная,  янтарная в семенах), углеводов (фруктоза, глюкоза, сахароза, мальтоза в семенах и листьях), флавоноидов (дигидрокверцитин, лютионин, кверцитин, рутин, сенерозид апигенин, салидрозид в семенах). Образцы исследуемого растения собраны в Ташлакском и Алтиарикском районах. Определение провели методом ВЭЖХ.

ABSTRACT

The article presents data on determination of quantitative composition of chemical components of cherry samples from two districts of Fergana region of Uzbekistan: organic acids (oxalic, tartaric, citric, succinic in seeds), carbohydrates (fructose, glucose, sucrose, maltose in seeds and leaves), flavonoids (dihydroquercitin, luthionine, quercitin, rutin, seneroside apigenin, salidroside in seeds). Samples of the studied plant were collected in Tashlak and Altiarik districts. Determination was carried out by HPLC method.

Ключевые слова: Prunus cerasus, органические кислоты, углеводы, флавоноиды, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Keywords: Prunus cerasus, organic acids, carbohydrates, flavonoids high performance liquid chromatography (HPLC).

Вишня Prunus cerasus L. (Семейство Rosaceae) уникальное в своём роде растение. Полезные и вкусные плоды употребляются в пищу в разнообразном виде. Лечебными свойствами обладают не только плоды, но и листья. Масло семян используется в косметике [1,2]. Произрастает и культивируется на большей части территории Европы, Северной Африки,  Западной и Центральной Азии, Америке. Иногда выделяеется в особый род Cerasus (Cerasus vulgaris - Вишня обыкновенная); известно около 600 коммерческих сортов [3,4]. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАО) В ТОП-10 стран-лидеров производителей вишни в 2021 г. на четвертом месте был отмечен Узбекистан [5].

В традиционной медицине вишня используются в качестве профилактического средства против сердечно-сосудистых заболеваний, болезни Альцгеймера, воспалительных заболеваний и хронических недугов, характеризующихся повышением окислительного стресса, таких как рак и диабет. Вишня улучшает аппетит, снижает кровяное давление [6], защищает от окислительного стресса, уменьшает боль и мышечные повреждения, вызванные физическими нагрузками, модулирует уровень глюкозы в крови и уменьшает воспаление [7-9].

Сообщалось об исследованиях по определению содержания органических кислот, углеводов, фенольных соединений в плодах вишни [6]. Авторами идентифицированы и определено количество яблочной, малоновой, щавелевой, шикимовой и фумаровой кислот методом ВЭЖХ, а также установлено содержание углеводов: глюкоза, фруктоза, сорбитол, сахароза, галактоза, ксилоза [6,10].

В настоящей работе приведены результаты проведённых нами исследований по количественному определению углеводов, органических кислот и флавоноидов в семенах и листьях вишни методом ВЭЖХ.

Материалы и методы.

Образцы вишни собирали в 2023 году в период созревания плодов. Косточки очищали от остатков мякоти, сушили. Листья высушивали в тени.

Углеводы. Определение массовой доли сахарозы, глюкозы, фруктозы и мальтозы проводили методом ВЭЖХ с рефрактометрическим детектором.

Точную навеску сырья (3,0 г) экстрагировали 100 мл дистиллированной воды перемешиванием на магнитной мешалке при температуре 35-40⁰С в течение 3 час. Затем экстракт с колбой помещали в ультразвуковую баню в течении 10 мин, после чего отфильтровывали через фильтр с диаметром пор 0,20 мкм. Сначала проводят определение количественного содержания растворов стандартных образцов сахарозы, глюкозы, фруктозы и мальтозы.

Приготовление стандартных градировочных растворов смеси моносахаридов (сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза):

Стандартные градировочные растворы смеси сахаров готовят для одновременной градировочной зависимости по трем точкам, от большей массовой концентрации или массовой доли сахарозы, глюкозы, фруктозы и мальтоза к меньшей на основе стандартного раствора N 1.

Жидкостный хроматограф Agilent 1100, укомплектованный дегазатором Degasser G1379A, насосом QuatPump G1311A, автосемплером ALS G1313A, термостатом колонок  Colcom G1316A, рефрактометрическим детектором RID  G1362A и системой обработки данных Agilent Chem Station Rev. B.01.03. Колонка SupelcosilLC-NH2 5 микрон 4.6x250 мм, “Supelco”, USA. Микропипетки объемом 100 и 1000 мкл, “VWR”, Poland. Пипетка объемом 5 мл, “Biohit”, Finland. Весы аналитические AnD GR-202 (точность 0,00001 г), “AnD”, Japan. Деионизатор воды Millipore Simplicity, “Millipore”, France. Ультразвуковая баня S 30 H Elmasonic, “Elma”, Germany. Фильтр Nylon 0.45 micron 13 mm. Фруктоза стандартная, имп. Глюкоза стандартная, имп. Сахароза стандартная, имп. Мальтозы моногидрат стандартный, имп. Ацетонитрил для ВЭЖХ “Sigma-aldrich”, США.

В процессе отработки методики были определены условия анализа: - режим элюирования изократический, состав подвижной фазы ацетонитрил/вода в объемном соотношении 82/18 без смешивания из двух отдельных емкостей. Состав подвижной фазы может варьироваться для достижения полного разделения пиков глюкозы и фруктозы. Объемная скорость элюирования 1,0 мл/мин.; объем инжекции 10 мкл; температура термостата колонки 35°С; времена удерживания стандартов: фруктоза 4,9 ± 0,2 мин, глюкоза 5,7 ± 0,2 мин, сахароза 10,4 ± 0,2 мин, мальтоза 12,1 ± 0,2 мин.

Органические кислоты. Навески стандартных образцов органических кислот растворяли в 1 мл дистиллированной воды в специальных пробирках для анализа. Образцы растительного сырья экстрагировали дистиллированной водой как приведено для углеводов. С целью освобождения от механических и не растворившихся мелких частиц, растворы фильтровали с применением фильтра с размером пор 0.2 мкм, а затем растворы образцов вставляли в специальный отсек хроматографа, предназначенный для анализируемых образцов. Центрифугировали 10 мин при скорости 8000 об/мин для освобождения от протеинов. Для каждого анализа объем инъекции составил 10 мкл. Результаты анализа отображались на мониторе компьютера в виде хроматограммы, а программное обеспечение позволяло автоматически интегрировать полученные пики.

Для анализа использовали ВЭЖХ марки «Agilent Technologies -1200» Колонка Agilent C₁₈ 5мкм, 4,6х250 мм. разделение органических кислот проводили в изократическом режиме элюирования, в качестве подвижной фазы использовали 0,1% ортофосфорной кислоты и ацетонитрила в соотношении (95:5). Детектирование проводили при длине волны 210 нм, температура колонки 30^oC, объем инъекции 10 мкл. Использовались химические реактивы и элюенты фирмы “Sigma-Aldrich” со степенью чистоты> 99,9 % (gradient grade, for HPLC).

Флавоноиды. Флавоноиды в образцах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 10 г пробы отбирали на аналитических весах и помещали в плоскодонную колбу вместимостью 300 мл. К сырью добавляли 50 мл 70% раствора этанола. Смесь нагревали при 70-80°С при интенсивном перемешивании в течение 1 час, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 2 час. Смесь охлаждали и отфильтровывали. К оставшейся части добавляли 25 мл 70%-ного этанола и повторно дважды экстрагировали. Фильтраты объединяли в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили до метки 70%-ным этанолом. Полученный раствор центрифугировали при скорости 6000-8000 об/мин в течение 20-30 мин. Пробы для анализа отбирали из верхней части.

Эксперимент проводили на приборе ВЭЖХ марки «Agilent-1200» Использовали колонку Agilent Eclipse XDB-C18 5 мкм, 4,6х250мм. Элюирование проводили в изократическом режиме, в качестве подвижной фазы использовали смесь 0,1% ортофосфорной кислоты и ацетонитрила в соотношении (70:30). Объемная скорость потока элюента – 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы 10мкл. Длина волны 254, 276 нм. В хроматограф вводили сначала стандартные растворы, а затем приготовленные рабочие растворы.

Результаты и обсуждение.

Результаты количественного определения углеводных компонентов приведены в таблице 1. Идентифицированы два моносахарида фруктоза и глюкоза, а также дисахариды с их участием: сахароза, мальтоза. Сравнение по местам произрастания показывает небольшое преобладание углеводов в Ташлакском районе как по отдельным компонентам, так и суммарно (~22%).

Таблица 1.

Количественное определение моносахаридов в составе вишни

Анализ данных по органам растения указывает, что в семенном материале по всем обнаруженным компонентам углеводов больше, чем в листьях. В то же время порядок изменения количественного содержания компонентов сравним с таковым для Алтиарикских семян. Что касается листьев, то в них содержание углеводов в 3 – 3,4 раза меньше, чем в семенах. Следует отметить полное отсутствие дисахаридов влистьях Ташлакского региона. Доминирующими компонентами являются глюкоза (68,8 – 73,8%) и фруктоза (19,8 – 23,8% в семенах). Естественно ожидать значительно большего содержания сахаров в мякоти плодов вишни. Действительнно, по литературным данным общее количество сахаров в плодах вишни колеблется в пределах 4,1-16,4% [11,12], а в плодах черешни доходит до 26,5% [13-15]. В углеводном составе преобладали глюкоза и фруктоза, которые составляли 54,8-78,7% [10], то есть общая тенденция вполне коррелирует с литературными данными.

В таблице 2 приведены результаты определения органических кислот в органах вишни методом ВЭЖХ.

Таблица 2.

Количественное определение органических кислот в составе вишни

Преобладающими компонентами являются винная, лимонная и янтарная кислоты. Значительно меньше по содержанию щавелевая кислота. По месту произрастания образцы с Ташлакского района богаче органическими кислотами по сравнению с образцами с Алтиарикского района. Сравнение с составом кислот в плодах вишни из литературных источников показывает следующее. В плодах обнаружены яблочная, малоновая, щавелевая, шикимовая и фумаровая кислоты. Суммарное содержание в зависимости от сорта колеблется в пределах 13-21 мг/гр [10], то есть в мякоти плодов примерно в 2,5 раз кислот содержится больше. Количество щавелевой кислоты колеблется в пределах 0,05-0,24 мг/гр, что близко к найденным нами значениям для других органов. Следует отметить, что кислотный состав плодов, листьев и семян существенно различается.

В таблице 3 приведены результаты определения флавоноидов в органах вишнёвого дерева. Идентифицировано семь компонентов. 

Таблица 3.

Количественное определение флавоноидов в составе вишни

Главными в порядке убывания по содержанию в Ташлакских образцах являются рутин, апигенин и дигидрокверцитин, в то время как в Алтиарикских образцах преобладают апигенин, кверцетин и рутин. При этом в последних количество указанных соединений значительно больше. Лютионин, сенерозид и салидрозид обнаружены в сопоставимых количествах. В литературных источниках имеются некоторые данные по определению флавоноидов, главным образом в плодах растения [1, 2]. Более детальные результаты приведены в работе [16], в которой индийскими химиками охарактеризованы флавоноиды вишнёвого дерева, произрастающего в Тибете. Ими в ядре древесины P. cerasus обнаружено наличие дигидротектохризина, дигидровогонина, пиноцембрина, сакуранетина, нарингенина, аромадендрина, таксифолина, кемпферола, кверцетина, тектохризина и хризина. По-видимому, в отдельных органах растения различные флавоноиды выполняют вполне определённые функции.

Выводы

Таким образом, в статье изложены результаты экспериментального количественного определения трёх классов органических соединений – углеводов, органических кислот, флавоноидов - в семенах и листьях вишнёвого дерева, культивируемого в двух административных районах Ферганской области Узбекистана, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Поскольку основной массив литературы посвящён исследованию состава плодов вишни, нами проведён сравнительный анализ полученных результатов в том числе и по плодам. Высказаны предположения о возможных причинах различий по органам растения в связи с выполняемыми функциями веществ в растительном организме.

Список литературы

1. Imtiyaz Ahmad, Shariq Shamsi, Roohi Zaman. A review on sour cherry: A high value Unani medicinal fruit // International Journal of Green Pharmacy. Jan-Mar 2017. Vol. 11. No1 | 1
2. Serradilla M.J., Hernández A., López-Corrales M., Ruiz-Moyano S., de Guía Córdoba M., Martín A. Composition of the Cherry (Prunus avium L. and Prunus cerasus L.; Rosaceae). //In book “Nutritional composition of fruit cultivars”. Academic Press, 2016. Chapter 6. Pp.128-147. doi: 10.1016/B978-0-12-408117-8.00006-4
3. Cerasus vulgaris Mill.// Plantarium. Plants and lichens of Russia and neighboring countries: open online galleries and plant identification guide. URL: Режим доступа https://www.plantarium.ru/page/view/item/9914.html
4. Kovalenko N.N. Evaluation of nutrient media on suitability for cultivation of cherry ordinary germs (Cerasus vulgaris mill.) // Плодоводство и виноградарство Юга России № 59(5), 2019 г. Cс.49-64. doi 10.30679/2219-5335-2019-5-59-49-64. http://journalkubansad.ru/pdf/19/05/06.pdf
5. Агро-тайм URL: Режим доступа https://agrotime.kz/top-10-vedushhih-stran-proizvoditelej-vishni-28928/
6. Anna Sokół-Ł˛etowska, Alicja Z. Kucharska, Grzegorz Hodun and Marta Gołb. Received: 14 September 2020; Accepted: 5 October 2020; Published: 8 October 2020.//Molecules 2020, 25, 4587; doi:10.3390/molecules25194587 www.mdpi.com/journal/molecules.
7. Alba, C.M.A.; Daya, M.; Franck, C. Tart cherries and health: Current knowledge and need for a better understanding of the fate of phytochemicals in the human gastrointestinal tract. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2019, 59, 626–638.
8. Blando, F.; Oomah, B.D. Sweet and sour cherries: Origin, distribution, nutritional composition and health benefits //Trends Food Sci. Technol. 2019, 86, 517–529.
9. Kelley, S.D.; Adkins, Y.; Laugero, D.K. A Review of the health benefits of cherries //Nutrients 2018, 10, 368.
10. Sturm, K.; Koron, D.; Stampar, F. The composition of fruit of different strawberry varieties depending on maturity stage // Food Chem. 2003, 83, 417–422.
11. Kucharska, A.Z.; Sokół-Ł˛ órecki, N. Morphological physical & chemical, and antioxidant profiles of polish varieties of cornelian cherry fruit (Cornus mas L.) // Zywnosc-Nauka Technol. Jakosc 2011, 18, 78–89.
12. Kucharska, A.Z. Zwi, ów Derenia (Cornus mas L.) // Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu: Wroclaw, Poland, 2020.
13. Nawirska-Olsza, P.; Paprstein, F. Comparison of old cherry cultivars grown in Czech Republic by chemical composition and bioactive compounds // Food Chem. 2017, 228, 136–142.
14. Usenik, V.; Fabˇ sweet cherry (Prunus avium L.). //Food Chem. 2008, 107, 185–192.
15. Cao, J.; Jiang, Q.; Lin, J.; Li, X.; Sun, C.; Chen, K. Physicochemical characterisation of four cherry species (Prunus spp.) grown in China. //Food Chem. 2015, 173, 855–863.
16. G.R.Nagarajan, V.S.Parmar. Flavonoids of prunus cerasus // Planta Med. 1977 Aug;32(1):50-3. doi: 10.1055/s-0028-1097557.