РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОДНОВРЕМЕННОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ В В КОРМОВОЙ ДОБАВКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

АННОТАЦИЯ

Предложен специфичный метод одновременного количественного анализа рибофлавина (витамина В2), пиридоксина гидрохорида (витамина В6), кальция пантотентата (витамина В3), никотинамида (витамина В5) высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием, позволяющего определять целевые компоненты при наличии большого количества сторонних компонентов с высокой точностью. Основные валидационные характеристики методики соответствуют критериям приемлемости. Аналитическая область применения методики составила 2,91-5,40 мкг/мл для рибофлавина, 3,64-6,76 мкг/мл для пиридоксина гидрохлорида, 9,10-16,90 мкг/мл для кальция пантотената, 14,86-27,60 мкг/мл для никотинамида.

ABSTRACT

A simple and specific method for simultaneous quantitative analysis of riboflavin (vitamin B2), pyridoxine hydrochloride (vitamin B6), calcium pantothenate (vitamin B3), nicotinamide (vitamin B5) by technique of highperformance liquid chromatography with diode-array detection has been developed, which allows the determination of the target component in the presence of a large number of interfering components with high accuracy.The main validation characteristics of the method meet the acceptability criteria. The analytical area of the method was from2,91to 5,40 μg/ml riboflavin concentration, from3,64to 6,76 μg/mlpyridoxine hydrochloride concentration, from9,10to 16,90 μg/ml calcium pantothenate concentration and from14,86to 27,60 μg/ml nicotinamide concentration.

 

Ключевые слова: никотинамид, пиридоксина гидрохлорид, рибофлавин, кальция пантотенат, обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография, количественное определение, ВЭЖХ.

Keywords: nicotinamide, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, calcium pantothenate, reversed-phase high-performance chromatography, quantitative analysis, HPLC.

 

ВВЕДЕНИЕ

Витамины — это широкая группа органических соединений, необходимых для поддержания нормальных эукариотических клеточных и метаболических функций. Витамины делятся на 2 большие группы: водорастворимые и жирорастворимые. Как правило, к водорастворимым витаминам относят витамины группы В (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотинамид (никотиновую кислоту), цианокобаламин, фолиевую кислоту и кальция пантотенат (пантотеновую кислоту) [1].

Для профилактики и лечения авитаминоза у животных применяют различные витаминные премиксы и кормовые добавки. При этом в состав кормовых добавок входят сразу несколько витаминов, что обуславливает необходимость разработки методик их одновременного определения с целью уменьшения трудозатрат и стоимости анализа. Самым распространённым методом определения водорастворимых витаминов является обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография [2-4].Поскольку одновременное определение витаминов в изократическом режиме является затруднительным, разработчики методик прибегают к применению градиентного режима элюирования или использованию ион-парных реагентов [5-7]. Основной проблемой во всех вариантах хроматографических методик является влияние компонентов матрицы на степень разделения пиков аналитов друг с другом и пиками «плацебо».Для решения данной задачи была разработана специфическая методика, основанная на градиентном элюировании.

Целью работы являлась разработка и валидация методики количественного одновременного определения рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида, кальция пантотентата, никотинамида в условиях градиентного элюирования.Основными критериями при выборе условий хроматографирования служили длительность процесса, степень извлечения аналитов (открываемость) и разрешение между анализируемыми веществами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы

В работе использовались рибофлавин, пиридоксина гидрохлорид, кальция пантотенат, никотинамид, натрия дигидрофосфат дигидрат, уксусная кислота ледяная, ацетонитрил, метанол, гексансульфонат натрия, фосфорная кислота квалификаций не ниже Ч.Д.А.

Оборудование

В работе были использованы следующие приборы: высокоэффективный жидкостной хроматограф Ultimate 3000 с диодно-матричным детектором (Thermo Scientific Dionex, Германия), хроматографическая колонка Ultisil XB C-18 250 x 4,6 мм 3 микрона (Welch, Китай), рН-метр лабораторный настольный HI 5221-02 (Hanna Instruments, США).

При проверке воспроизводимости методики на различном оборудовании были использованы:высокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent 1260 INFINITY II с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, США), высокоэффективный жидкостной хроматограф HanonWooking K2025 с диодно-матричным детектором (Hanon, Китай).

Приготовление растворов.

Стандартные растворы, испытуемый раствор и раствор сравнения готовили мерных колбах из темного стекла в помещении с минимальным доступом света.

Буферный раствор: 1,56 г натрия дигидрофосфата растворяли в 930 мл воды, доводили значение рН раствора до 3,8 20% раствором фосфорной кислоты. Объём раствора доводили до 1 л водой.

Подвижная фаза (а): смешивали 30 мл ацетонитрила и 970 мл буферного раствора, перемешивали.

Подвижная фаза (б): ацетонитрил.

Стандартные растворы: стандартный раствор витамина В2 (0,04 мг/мл) готовили в 2% растворе уксусной кислоты при нагревании до 90 °С, стандартный раствор витамина В6 (0,26 мг/мл), стандартный раствор витамина В3 (0,5 мг/мл), стандартный раствор витамина В5 (0,5 мг/мл) готовили в воде.

Раствор сравнения. В мерную колбу объёмом 50 мл вносили 5,2 мл стандартного раствора витамина В2, 1,0 мл стандартного раствора витамина В6, 1,3 мл стандартного раствора витамина В3, 2,1 мл стандартного раствора витамина В5, и 10 мл воды, перемешивали. Доводили объём раствора до метки тем же растворителем.

Испытуемый раствор. Непосредственно перед проведением испытания не менее 30 г испытуемого препарата перемалывали в лабораторной мельнице до однородного состояния. В мерную колбу объёмом 50 мл помещали навеску испытуемого образца массой 2,6 г. К навеске прибавляли 40 мл водыи тщательно перемешивали в течение 1 минуты, помещали в ультразвуковую баню на 10 минут. Полученный раствор тщательно перемешивали, прибавляли 2,5 мл 2 % раствора уксусной кислоты, и тщательно перемешивали в течение 1 минуты. Раствор помещали в ультразвуковую баню на 10 минут. Раствор перемешивали и доводили объём раствора до метки водой.

Условия хроматографирования.

Хроматографическое разделение проводили в градиентном режиме (таблица 1) на колонкеUltisil XB-C18, 250х4,6 мм, 3 мкм. Скорость потока – 1,0 мл/мин. Температура термостата автосамплера – 20 ^оС, температура термостата колонки – 30 ^оС. Объём вводимой пробы – 50 мкл. Детектирование проводили при длине волны 275 нм – для витаминов В5 и В6, 210 нм – для витамина В3, 440 нм – для витамина В2.

Таблица 1.

Программа градиентного элюирования

Время, мин	ПФ А, %	ПФ Б, %
0	100	0
2	100	0
8	98	2
25	75	25

 

Регистрация и обработка хроматографических данных выполнены с помощью программного обеспечения Chromeleon 7 (Thermo Scientific, США), При проверке воспроизводимости методики на различном оборудовании было использовано программное обеспечение OpenLab (AgilentTechnologies,США),WorkStation (Hanon, Китай).

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с Фармакопеей Евразийского экономического союза (ФЕАЭ) ст.2.3.13.0 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний»[8]и спомощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Широко известным подходом к определению витаминов группы В является обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография с использованием ион-парных реагентов. Исходя из этого на первом этапе работы была апробирована методика со следующими условиями хроматографирования: подвижная фаза – (раствор гексансульфоната натрия в концентрации 2,0 г/л с добавлением 2% уксусной кислоты) : метанол = 75 : 25, режим элюирования – изократический, скорость потока – 1 мл/мин, температура колонки – 35 °С, объем вводимой пробы – 50 мкл, хроматографическая колонка – ZorbaxEclipse 150х4,6 мм, 5 мкм, длина волны детектирования 275 нм – для витаминов В5 (никотинамид) и В6 (пиридоксина гидрохлорид), 210 нм – для витамина B3 (кальция пантотенат), 440 нм – для витамина В2 (рибофлавин). Длины волн детектирования были выбраны в соответствии со специфическими максимумами поглощения в спектрах анализируемых витаминов.

При анализе раствора кальция пантотената(витамина В3) с концентрацией 15 мкг/мл описанным выше методом на хроматограммах не наблюдалось пика аналита, что вероятно было связано со значительным поглощением гексансульфоната натрия в низковолновой области ультрафиолетового спектра (около 200 нм). Для нивелирования мешающего влияния подвижной фазы были использованы растворы гексансульфоната натрия концентрацией 1,5 г/л и 1,0 г/л. Уменьшение концентрации ион-парного реагента не привело к ожидаемому результату, что позволило сделать вывод о невозможности его применения для анализа кальция пантотената в рабочем диапазоне концентраций.

Для возможности детектирования пиков в широком диапазоне ультрафиолетового спектра в качестве основного компонента буферного раствора был выбран натрия дигидрофосфат дигидрат и следующие условия хроматографирования: подвижная фаза – (раствор натрия дигидрофосфата дигидрата в концентрации 1,56 г/л со значением рН равным 3,4 ед.):(ацетонитрил), режим элюирования – градиентный, скорость потока – 1 мл/мин, температура колонки – 30 °С, объем вводимой пробы – 50 мкл, хроматографическая колонка – Ultisil XB-C18 250х4,6 мм, 5 мкм, длина волны детектирования соответствовали описанным выше.

В приведенных условиях пик витамина В3 (кальция пантотенатата) обнаруживался на хроматограмме раствора сравнения со временем удерживания 14,4 минуты (рисунок 1). Соотношение сигнал/шум для данного пика составляло 540, что выше уровня допустимого для предела количественного определения в 54 раза. Вышеописанные условия хроматографирования позволяли проводить количественное определение витамина В3 (рисунок 1), но были не достаточны для полного разделения пиков витаминов В5 и В6 (рисунок 2) – коэффициент разделения составил 1,8.

 

Рисунок 1. Фрагмент хроматограммы раствора сравнения

Условия хроматографирования:

хроматографическая колонка: Ultisil XB-C18 250*4,6 мм, 5 мкм;

буфер А: (1,56 г/л NaH₂PO₄×2H₂O, рН 3,4 ед.); буфер Б: ацетонитрил

режим элюирования – градиентный;

скорость потока – 1 мл/мин;

температура колонки – 30 °С;

объем вводимой пробы – 50 мкл;

длина волны детектирования 210 нм

 

Рисунок 2. Фрагмент хроматограммы раствора сравнения

Условия хроматографирования:

хроматографическая колонка: Ultisil XB-C18 250*4,6 мм, 5 мкм;

буфер А: (1,56 г/л NaH₂PO₄×2H₂O, рН 3,4 ед.); буфер Б: ацетонитрил

режим элюирования – градиентный;

скорость потока – 1 мл/мин;

температура колонки – 30 °С;

объем вводимой пробы – 50 мкл;

длина волны детектирования 275 нм

 

Для разделения пиков витаминов В5 и В6 хроматографическая колонка была заменена на колонку с меньшем размером частиц сорбента (Ultisil XB-C18 250х4,6 мм, 3 мкм), также был разработан ряд режимов градиентного элюирования - лучший из полученных вариантов представлен на рисунке 3 пунктирной линией. В показанном примере, несмотря на значительное разделение пиков витаминов В5 и В6, нерешенным остался вопрос разделения пика витамина В6 и пиков примесей.

Основываясь на том, что большинство витаминов по своей природе являются кислотами или основаниями и поэтому большое влияние на время удерживания и степень разделения оказывает значение рН буферного компонента подвижной фазы, в качестве подвижных фаз были использованы буферные растворы со значениями рН 3,4 ед.; 3,6 ед.; 3,8 ед. Результаты изучения влияния рН подвижной фазы показаны на рисунке 3. Так как влияние изменения значения рН на время удерживания пиков витаминов, основанное на значения рКа, увеличивается в ряду: рибофлавин (витамин В2), пантотенат кальция (витамин В3), пиридоксина гидрохлорид (витамин В6), никотинамид (витамин В5), то внесенные изменения позволили значительно изменить время удерживания и форму пиков витаминов В6 и В5 не приведя при этом к изменению хроматографического профиля пиков витаминов В2 и В3. Наилучшего результата удалось добиться, используя значение рН равное 3,8 ед.

 

Рисунок 3. Фрагмент хроматограммы раствора сравнения с различным значением рН буферного компонента подвижной фазы:

 пунктирная линия – 3,4 ед.рН, линия «штрих-точка» – 3,6 ед.рН, непрерывная линия – 3,8 ед.рН

Условия хроматографирования:

хроматографическая колонка: Ultisil XB-C18 250*4,6 мм, 5 мкм;

буфер А: (1,56 г/л NaH₂PO₄×2H₂O, рН 3,8); буфер Б: ацетонитрил

режим элюирования – градиентный;

скорость потока – 1 мл/мин;

температура колонки – 30 °С;

объем вводимой пробы – 50 мкл;

длина волны детектирования 275 нм

 

При апробации подобранных условий хроматографирования на испытуемых растворах было обнаружено изменение формы пика витамина В6 в присутствии компонентов матрицы (рисунок 4).

 

 

Рисунок 4. Фрагменты хроматограмм испытуемого раствора (пунктирная линия) и раствора сравнения (непрерывная линия)

Условия хроматографирования:

хроматографическая колонка: Ultisil XB-C18 250*4,6 мм, 5 мкм;

буфер А: (1,56 г/л NaH₂PO₄×2H₂O); буфер Б: ацетонитрил

режим элюирования – градиентный;

скорость потока – 1 мл/мин;

температура колонки – 30 °С;

объем вводимой пробы – 50 мкл;

длина волны детектирования 275нм

 

Для нивелирования влияния компонентов матрицы был изучен ряд программ градиентного элюирования лучшая из которых описана в разделе «Материалы и методы». В результате изменения угла наклона градиента форма пика витамина В6 для испытуемого раствора и раствора сравнения стали идентичны (рисунок 5). Стабильность раствора сравнения и испытуемого раствора показаны в разделе «Изучение стабильности растворов».

 

Рисунок 5. Фрагменты хроматограмм испытуемого раствора (пунктирная линия) и раствора сравнения (непрерывная линия) в хроматографических условиях, описанных в разделе «Материалы и методы» (длина волны детектирования 275нм)

 

При разработке методики помимо подбора хроматографических условий важным аспектом является пробоподготовка и подбор растворителей. В соответствии с литературными данными рибофлавин (витамин В2) является наименее растворимым из всех анализируемых витаминов группы В, при этом наиболее растворим в кислой среде[1]. Исходя из этого в качестве растворителя для стандартного раствора рибофлавина и испытуемого раствора был выбран 2% раствор уксусной кислоты. При этом при анализе хроматограмм испытуемого раствора, полученных при подборе условий пробоподготовки было обнаружено, что в зависимости от концентрации кислоты в растворе меняется форма и время удерживания пика никотинамида (витамина В5). Как показано на рисунке 6 с уменьшением концентрации уксусной кислоты от 2% до 0,1% ширина пика изменилась с 1,2 минут до 0,8 минут.

На основании полученных данных было принято решение о целесообразности использования 2% уксусной кислоты для растворения стандартного раствора рибофлавина (40 мкг/мл), а для растворения испытуемого раствора (концентрация рибофлавина – 4,16 мкг/мл) – 0,1% уксусной кислоты. Полнота экстракции витамина В2 при таком подходе доказана в разделе «Правильность».

 

Рисунок 6. Фрагмент хроматограмм испытуемого раствора при различной концентрации уксусной кислоты: 2% уксусной кислоты – время удерживания никотинамида равно 8,68 мин., 1% кислоты – 8,78 мин., 0,1 % кислоты – 8,87 мин (длина волны детектирования 275 нм)

 

При использовании подобранных условий приготовления растворов и их хроматографирования удалось достичь результатов, соответствующих требованиям ФЕАЭС к пригодности хроматографической системы. Хроматограммы растворов сравнения приведены на рисунках 7-9.

 

Рисунок 7. Хроматограмма раствора сравнения в хроматографических условиях, описанных в разделе «Материалы и методы» (длина волны детектирования 275 нм)

 

Рисунок 8. Хроматограмма раствора сравнения в хроматографических условиях, описанных в разделе «Материалы и методы» (длина волны детектирования 210 нм)

 

Рисунок 9. Хроматограмма раствора сравнения в хроматографических условиях, описанных в разделе «Материалы и методы» (длина волны детектирования 440 нм)

 

Валидация

Валидацию методики проводили в соответствии с ФЕАС 2.3.14.0 «Валидация аналитических методик» по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность, диапазон применения.

Проверка пригодности хроматографической системы.

В соответствии с требованиями ФЕАЭС хроматографическая система считается пригодной если:для 3-х последовательных вводов пробы раствора сравнения относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площадей пикааналита не более 3,0 %,фактор симметрии для пика аналита находится в диапазоне 0,8-1,5.

Основные параметры хроматографической системы, рассчитанные из хроматограмм раствора сравнения представлены в таблице 2. Полученные результаты доказывают пригодность хроматографической системы для количественного определения витамина В2, В6, В3 и В5 (испытание проводили навысокоэффективном жидкостном хроматографе Ultimate 3000).

Таблица 2.

2. Результаты проверки пригодности хроматографической системы

 

Специфичность

В процессе валидации проверяли специфичность методики относительно каждого аналита. Для проверки специфичности методики анализировали раствор плацебо (содержащий все компоненты плацебо без аналита), раствор сравнения и модельные растворы, содержащие все компоненты плацебо и аналит в концентрации, соответствующейраствору сравнения.

Критериями подтверждения специфичности являлись: отсутствие на хроматограммах растворов плацебо пиков, совпадающих по временам удерживания с пиками аналитов на хроматограммах раствора сравнения, совпадение по времени удерживания пиков аналитов на хроматограммах модельных растворов и раствора сравнения, открываемость (соотношение среднего значения площади пикааналита на хроматограммах модельного раствора и раствора сравнения, умноженное на 100 %)  в пределах 97,0-103,0 %.

Результаты изучения специфичности методики приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты проверки специфичности методики

 

Исходя из выше представленных данных можно утверждать, что присутствие сопутствующих компонентов не влияло на результат анализа.

Линейность

Для проверки линейности путём разведения стандартных растворов были приготовлены растворы, содержащие аналитыв концентрациях, составляющих 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 % от номинальной концентрации аналитов в растворе сравнения. Для каждого уровня концентрации приготовили по 3 раствора и получили по 3 хроматограммы.

Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием линейной модели. По полученным значениям построили градуировочные графики зависимости площадей пика аналитов от концентрации (рисунок 6-9).

 

Рисунок 6. График зависимости площади пикавитамина В2 от концентрации

 

Рисунок 7 – График зависимости площади пика витамина В6 от концентрации

 

Рисунок 8 – График зависимости площади пика витамина В3 от концентрации

 

Рисунок 9 – График зависимости площади пика витамина В5 от концентрации

 

Полученные коэффициенты корреляции удовлетворяют требованиям ФЕАЭС, что подтверждает линейность методики на выбранном диапазоне концентраций.

Повторяемость.

Повторяемость была определена одним аналитиком путем анализа шести проб одного и того же однородного образца с использованием одного оборудования, одного набора реактивов в один и тот же день.

Для каждого испытуемого раствора было найдено содержание аналитов, среднее содержание и величина доверительного интервала. Результаты 6 параллельных испытаний образца кормовой добавки приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Результаты исследования повторяемости

 

Относительное стандартное отклонение среднего значения (RSDxср, %), рассчитанное для содержания всех аналитов, полученное в условиях повторяемости, не превышало 3,0 % и соответствовало установленным требованиям.

Внутрилабораторная прецизионность.

Внутрилабораторная прецизионность оценивалась по результатам параллельных испытаний одного образца проводимых двумя аналитиками в разные дни. В качестве результатов испытаний, выполненных одним из аналитиков, использовались результаты, полученные при проверке повторяемости. Результаты представлены в Таблице 5.

Результаты испытаний проверили на однородность выборки (по Q(P;n)) и показали, что данные не содержат грубые ошибки. Статистические характеристики, вычисленные для однородной выборки, являются достоверными и могут быть использованы для оценки внутрилабораторной прецизионности.

В этом случае задача сводилась к установлению значимости различия между двумя сред­ними значениями  и  для чего использовался модифицированный тест Стьюдента. Тестом для сравнения двух дисперсий являлся тест Фишера. Результаты испытаний приведены в таблице 5.

По результатам проверки внутрилабораторнойпрецизионности относительное стандартное отклонение среднего значения (RSDxср, %), рассчитанное для концентрацийаналитов, полученных каждым аналитиком, не превышает 3,0%; различие значений дисперсий средних результатов выборок, полученных в условиях внутрилабораторной воспроизводимости не превышает табличного значения коэффициента Фишера для двух серий данных; различие между средними значениями  и  незначимо.

Таблица 5.

Результаты исследования внутрилабораторнойпрецизионности

 

Правильность

Для проверки правильности были приготовлены модельные растворы, содержащие аналиты в концентрациях, соответствующих примерно 80 %, 100 %, 120 % от номинальной концентрации в испытуемом растворе.

Подтверждение правильности полученных данных осуществлялось путем вычисления смещения |хср – m| и проверки значимости отличия случайной величины хср от константы m (принятого эталонного значения).

Различие являлось незначимым (полученные результаты определения не отягощены систематической ошибкой) при выполнении неравенства (1):

                                                                       (1)

где     m – принятое эталонное значение определяемого компонента (в проводимых испытаниях m = С (заданное содержание определяемых веществ в пробе));

ν – число степеней свободы;

n – число измерений;

P - доверительная вероятность;

S – абсолютное СКО среднего значения;

t (P, ν) – табличное значение критерия двухстороннего распределения Стьюдента.

Результаты проверки правильности приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Результаты исследования правильности

 

Полученные выборки являлись однородными, смещение результата измерения, отнесенное к абсолютному СКО среднего значения, не превышало значения критерия двухстороннего распределения Стьюдента для Р2 = 0,95 и заданного числа измерений.

Изучение стабильности

Определение стабильности проводили для раствора сравнения и испытуемого раствора.

Растворы анализировали согласно методике после приготовления и спустя определенное время, прошедшее после приготовления раствора (хранение при температуре 20 ^оС, поддерживаемой автосамплером).

По результатам изучения стабильности было показано, что раствор сравнения и испытуемый модельный раствор стабильны в течении 10 часов после приготовления при хранении в защищенном от света месте при температуре +20 °С.

Регулирование хроматографических условий

Для проверки пригодности хроматографической системы при изменении хроматографических условий анализировали раствор сравнения при варьировании температуры термостата колонок (± 5 °С). Пригодность хроматографической системы была подтверждена для всех описанных случаев.

Для подтверждения воспроизводимости методики на высокоэффективных хроматографах различных производителей раствор сравнения анализировали в соответствии с методикой на приборах Agilent 1260 INFINITY II (Agilent, США) и HanonWooking K2025 (Hanon, Китай). Результаты анализа приведены в таблице 7.

Таблица 7.

Результаты проверки воспроизводимости методики на приборах различных производителей

 

Результаты, полученные в ходе проверки воспроизводимости методики на различных приборах, соответствуют требованиям к пригодности хроматографической системы и сопоставимы между собой, а также с результатами, полученными на высокоэффективном жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (таблица 2), что говорит об отсутствии приборного влияния на воспроизводимость методики.

Аналитическая область

Аналитическая область методики (диапазон применения методики)доказана подтверждением того, что методика имеет приемлемую степень линейности, правильности и прецизионности при анализе образцов с содержанием аналитов в данном диапазоне.

На основании проведенной валидации методики диапазон её применения равен 2,91-5,40 мкг/мл рибофлавина (витамина В2), 3,64-6,76 мкг/мл пиридоксина гидрохлорида (витамина В6),9,10-16,90 мкг/мл кальция пантотената (витамина В3), 14,86-27,60 мкг/мл никотинамида (витамина В5) в испытуемом растворе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана методика для одновременного определения количественного содержания рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида, никотинамида и кальция пантотената в кормовой добавке методом обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пригодность методики подтверждена соответствием основных валидационных характеристик – специфичности, линейности, правильности, промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности, аналитического диапазона – критериям приемлемости. В процессе работы была показана воспроизводимость методики на хроматографах различных производителей. Методика может быть применена для контроля качества различных мультивитаминных комплексов, кормовых добавок и биологически-активных добавок к пище.

 

Список литературы:

1. Zempleni J. Handbook of Vitamins // CRC Press. – 2007.
2. Mateeva A. Simultaneous analysis of water-soluble and fat-soluble vitamins through RP-HPLC/DAD in food supplements and brewer’s yeast  // Heliyon – 2023. – Vol. 9
3. Yessaad M. Development of a Stability Indicating Method for Simultaneous Analysis of Five Water-Soluble Vitamins by Liquid Chromatography // Pharmaceutical Technology in Hospital Pharmacy – 2018. – Vol.3 №4.
4. Бендрышев А. Определение водорастворимых витаминов в витаминных премиксах, биологически-активных добавках и фармацевтических препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с градиентным элюированием // Вестник Московского университета – 2010. – Т.51 №4. – с.315-324
5. Kim H. J. Development of an ion-pairing reagent and HPLC-UV method for the detection and quantification of six water-soluble vitamins in animal feed //International Journal of Analytical Chemistry. – 2016. – Т. 2016.
6. Hosain M. Development of a rapid and reliable high-performance liquid chromatography method for determination of water-soluble vitamins in veterinary feed premix // Veterinary World – 2021. – Vol.14(12). – P.3084-3090
7. Li K. Simultaneous determination of nicotinamide, pyridoxine hydrochloride, thiamine mononitrate and riboflavin in multivitamin with minerals tablets by reversed-phase ion-pair high performance liquid chromatography // Biomedical Chromatography. – 2002. – Vol. 16 (8). – P.504-507
8. Фармакопея Евразийского экономического союза Ч.2. Т1. / Евразийская экономическая комиссия–  2023. – 458 с.