РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИБОФЛАВИН-5-ФОСФАТА НАТРИЯ В МУЛЬТИВИТАМИННОМ КОМПЛЕКСЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

 

АННОТАЦИЯ

Разработан простой и специфичный метод количественного анализа рибофлавин-5-фосфата натрия методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием, позволяющий определять целевой компонент при наличии большого количества сторонних компонентов с высокой точностью. Основные валидационные характеристики методики соответствуют критериям приемлемости. Аналитическая область применения методики составила 3,8-5,0 мкг/мл рибофлавина-5-фосфата натрия.

ABSTRACT

A simple and specific method for quantitative analysis of sodium riboflavin-5-phosphate by technique of high performance liquid chromatography with diode-array detection has been developed, which allows the determination of the target component in the presence of a large number of interfering components with high accuracy. The main validation characteristics of the method meet the eligibility criteria. The analytical area of the method was from 3.8 to 5.0 μg/ml sodium riboflavin-5-phosphate concentration.

 

Ключевые слова: рибофлавин-5-фосфат натрия, обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография, валидация.

Keywords: sodium riboflavin-5-phosphate, reversed-phase high-performance chromatography, validation.

 

ВВЕДЕНИЕ

Рибофлавин (витамин В2) – один из важных водорастворимых витаминов, относящихся к группе В. Рибофлавин является неотъемлемой частью функционирования многих систем организма, необходимым компонентом для энергетического метаболизма, роста и развития тканей, синтеза гормонов и антиоксидантной защиты. Витамин В2 взаимодействует с аденозинтрифосфатом (АТФ), образуя коэнзимы флавинпротеинов – флавинмононуклеотид (FMN) и флавинадениндинуклеотид (FAD), входящие в состав флавиновых ферментов и принимающие участие в окислительно-восстановительных реакциях, в углеводном, белковом и жировом обменах, в тканевом дыхании.

Из-за некачественного питания, нарушений работы пищеварительной системы, болезней печени и т.д. у людей может возникать недостаток рибофлавина в организме, который легко восполняется мультивитаминными комплексами и биологически активными добавками к пище [1-2].

Существенной проблемой для производителей мультивитаминных комплексов является низкая стабильность витамина В2, а также снижение его биологической активности в следствии фото- и термодеградации, чувствительности к таким факторам как рН среды и воздействие кислорода [3].

В последнее время наиболее популярной среди производителей биологически активных добавок и мультивитаминных комплексов формой витамина В2 является рибофлавин-5-фосфат натрия, т.к. он лучше растворим в воде, более стабилен в растворах, а так же является метаболитом рибофлавина, что в свою очередь значительно повышает его биологическую доступность.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием ион-парных реагентов представляет собой широко известный подход к одновременному определению водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах [4-8]. Однако, использование рибофлавин-5-фосфата натрия в современных препаратах создало проблему для применения известных подходов к разделению. В отличие от рибофлавина, натриевая соль рибофлавин-5-фосфата в классической обратнофазовой хроматографии обладает малым временем удерживания и плохо разделяется с другими витаминами. Один из подходов к решению данного вопроса – преобразование рибофлавин-5-фосфата в рибофлавин, путём удаления фосфатной группы. Нестабильность многих витаминов в жестких условиях делает невозможным применение щелочного или кислотного гидролиза. Выходом из этой ситуации может стать ферментативный гидролиз на стадии пробоподготовки, но данный метод в большинстве случаев не показывает необходимой для рутинного анализа воспроизводимости [9-10].

Целью данной работы стала разработка и валидация методики количественного определения рибофлавин-5-фосфата натрия в мультивитаминном комплексе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием. Основными критериями при выборе условий хроматографирования служили длительность и простота выполнения, полнота извлечения рибофлавина-5-фосфата натрия, хроматографическая чистота получаемых проб.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы

В работе использовались рибофлавин-5-фосфата натрия (Damashmand organic private limited, Индия и Parchn, Китай), витамин А-пальмиат (Shangyu nhu bio-chem co. Ltd, Китай), витамин Д3 (Fermenta biotech limited, Индия), витамин Е-ацетат (BASF, Германия) витамин К (BASF, Германия), витамин В6 (Xinfa pharmaceutical co.Ltd, Китай), витамин В1 (Huazong pharmaceutical co. Ltd, Китай), витамин В12 (Henan Xinxiang hoaxing pharmaceutical Factory, Китай), гексансульфонат натрия, уксусная кислота, метанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, лимонная кислота, фосфорная кислота, гидроксид натрия, бутилгидрокситолуол, бутанол квалификаций не ниже х.ч.

Оборудование

В работе были использованы следующие приборы: высокоэффективный жидкостной хроматограф Ultimate 3000 с диодно-матричным детектором (Thermo Scientific Dionex, Германия), высокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent 1260 INFINITY II с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, США) высокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent 1200 с масс-селективным детектором и диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, США), рН-метр лабораторный настольный HI 5221-02 (Hanna Instruments, США), спектрофотометр Agilent Cary 3500 (Agilent Technologies, США), хроматографическая колонка Zorbax SB-C18, 250 × 4,6 мм, 5 мкм (Agilent Technologies, США), хроматографическая колонка Zorbax Eclipse Plus C18 150 × 3,0 мм, 3,0 мкм, Agilent Technologies, США).

Приготовление растворов.

Стандартный раствор, испытуемый раствор и раствор сравнения готовятся в мерных колбах из темного стекла в помещении с минимальным доступом света.

Подвижная фаза А. Смесь тетрагидрофурана и метанола в соотношении 10:90 (об/об).

Подвижная фаза Б. 1,25 г натрия гексансульфоната  растворяют в 500 мл воды и добавляют 20 мл уксусной кислоты. Раствор переносят в мерную колбу объёмом 1 л и доводят объём раствора до метки водой. Фильтруют через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размером пор не более 0,45 мкм.

Раствор уксусной кислоты 2%. 40 мл уксусной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 л. Доводят объём раствора до метки водой.

Раствор лимонной кислоты. 1 г лимонной кислоты безводной  переносят в мерную колбу объемом 25 мл. Растворяют в 20 мл воды. Доводят объём раствора до метки тем же растворителем.

Растворитель. Подвижная фаза А: Раствор уксусной кислоты 2% в соотношении 5:95 (об/об).

Стандартный раствор. В мерную колбу объемом 100 мл помещают навеску рибофлавина-5-фосфат натрия массой 16 мг (в пересчете на чистое и сухое вещество), растворяют в 80 мл растворителя, доводят объем раствора до метки растворителем. Фильтруют через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размером пор не более 0,45 мкм.

Раствор сравнения. 1,25 мл раствора лимонной кислоты вносят в мерную колбу объемом 50 мл прибавляю к нему 1,25 стандартного раствора, доводят объём раствора до метки растворителем. Раствор фильтруют через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размерами пор 0,45 мкм.

Испытуемый раствор. В фарфоровой ступке перетирают таблетки одного пенала препарата. В мерную колбу объемом 100 мл помещают навеску испытуемого образца массой 8,2 г, растворяют в 90 мл растворителя, прибавляют 2,5 мл воды, перемешивают и доводят объём раствора до метки растворителем. 0,65 мл полученного раствора вносят в мерную колбу объемом 10 мл, прибавляют 0,25 мл воды Р и доводят объём раствора до метки растворителем. Раствор фильтруют через мембранный фильтр из политетрафторэтилена с размерами пор 0,45 мкм.

Условия хроматографирования.

Хроматографическое разделение проводили в изократическом режиме на колонке Zorbax Eclipse Plus C18 150 × 3,0 мм, 3,5 мкм). Подвижная фаза – смесь подвижной фазы А и подвижной фазы Б в соотношении 5 : 95(об/об). Скорость потока – 1,0 мл/мин. Температура термостата автосамплера – 10 ^оС, температура термостата колонки – 40 ^оС. Время хроматографирования – 10 минут. Объём вводимой пробы – 10 мкл. Детектирование проводили при длине волны 444 нм, равной специфическому максимуму поглощения в спектре рибофлавина и его производных.

Регистрация и обработка хроматографических данных выполнены с помощью программного обеспечения OpenLab (Agilent Technologies,США) и Chromeleon 7 («Thermo Scientific», США).

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с Фармакопеей Евразийского экономического союза (ФЕАЭ) ст.2.3.13.0 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний» [11] и с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода

При выборе условий хроматографического анализа в качестве подвижной фазы были изучены растворы гексансульфоната натрия концентрацией 1,0 г/л и 1,25 г/л со значениями рН от 2,0 до 6,4, ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран и их смеси в различных соотношениях. Температуру термостата колонки варьировали в диапазоне от 20 до 50 °С, скорость потока – от 0,5 до 2,0 мл/мин. Разделение проводили с использованием хроматографической колонки заполненной диизобутил н-октадецилсиланом Zorbax SB-C18 (250 × 4,6 мм, 5 мкм) и колонки, заполненной октадецильным силикагелем Zorbax Eclipse Plus C18 (150 × 3,0 мм, 3,5 мкм).

За основу разрабатываемой методики был взят классический метод разделения витаминов группы В, основанный на элюировании аналитов подвижной фазой, состоящей из раствора гексансульфоната натрия и метанола в соотношении 75/25, соответственно, и использовании хроматографической колонки Zorbax SB-C18 (250 × 4,6 мм, 5 мкм). Используемый метод позволял определять витамин В2 в форме рибофлавина, но пики, соответствующие рибофлавин-5-фосфату натрия обладали малым временем удерживания и накладывались на пики компонентов плацебо.

Для лучшего разделения пика рибофлавин-5-фосфата натрия с компонентами плацебо были использованы подвижные фазы состава: подкисленный раствор гексансульфоната натрия (1,0 г/л) / метанол в соотношении 80/20, 85/15, 90/10, соответственно. Как и ожидалось, с увеличением содержания водного компонента в подвижной фазе время удерживания пика аналита увеличилось, однако пик стал обладать ярко выраженной хвостовой асимметрией.        

С целью уменьшения фактора симметрии пика аналита был проведен ряд экспериментов по изменению состава органического компонента подвижной фазы:

a) 50 % ацетонитрила / 50 % метанола,

b) 47,5 % ацетонитрила / 47,5 % метанола / 5 % тетрагидрофурана (ТГФ).

Как показано на рисунке 1, увеличение концентрации компонента с большой элюирующей способностью в органической фазе приводило к улучшению фактора симметрии пика, однако уменьшало коэффициент разделения между основным пиком на хроматограмме раствора сравнения и ближайшим к нему (относительное время удерживания 1,2).

 

Рисунок 1. Хроматограммы раствора сравнения
(органическая фаза: 100 % метанол (хроматограмма 3), фаза а (хроматограмма 2), фаза b (хроматограмма 1))

 

В ходе подбора условий разделения было так же изучено влияние рН водного компонента подвижной фазы на хроматографическую систему: повышение значения рН до 6,4 не повлияло на коэффициент разрешения, но ухудшило фактор симметрии обоих пиков, понижение значения рН до 2,0 уменьшило время удерживания пиков и ухудшило разделение (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Хроматограммы раствора сравнения при различных рН водного компонента подвижной фазы

(рН = 6,4 (хроматограмма 2), рН=2,0 (хроматограмма 1))

 

Наилучшего результата с использованием колонки Zorbax SB-C18 (250 × 4,6 мм, 5 мкм) удалось достигнуть, используя систему: (1,0 г/л гексансульфоната натрия, 0,2 мл/л уксусной кислоты ледяной) / (47,5 % ацетонитрила / 47,5 % метанола / 5 % ТГФ) в соотношении 90 / 10 (об/об) (рисунок 3). Однако, даже при таких условиях коэффициент симметрии основных пиков на хроматограмме раствора сравнения был за пределами норм, регламентируемых ФЕАЭС.

 

Рисунок 3. Хроматограмма раствора сравнения
(подвижная фаза: (1,0 г/л гексансульфоната натрия, 0,2 мл/л уксусной кислоты ледяной ) : (47,5 % ацетонитрила / 47,5 % метанола / 5 % ТГФ) =  90/10 (об/об))

 

Важным параметром, влияющим на симметрию пика в соответствии с уравнением Ван-Деемтера является размер зерна сорбента.  Исходя из чего следующим этапом работы стала апробация методики на хроматографической колонке с размером частиц 3,5 мкм, заполненной октадецильным силикагелем Zorbax Eclipse Plus C18 (150 × 3,0 мм, 3,5 мкм).

В связи с уменьшением длины колонки изменилось и время удерживания пиков, для регулирования которого доля водного компонента подвижной фазы была увеличена до 95 % (рисунок 4).

Учитывая положительное влияние на характеристики хроматографической системы замены колонки на более мелкозернистую, было решено попробовать упростить органическую составляющую подвижной фазы, убрав из её состава ацетонитрил. Хроматограмма раствора сравнения рибофлавин-5-фосфата натрия, полученного с использованием подвижной фазы состава: (1,0 г/л гексансульфоната натрия, 0,2 мл/л уксусной кислоты ледяной) / (90 % метанола / 10 % ТГФ) в соотношении 95 : 5 (об/об), представлена на рисунке 5.

 

Рисунок 4. Хроматограммы раствора сравнения
(доля водного компонента подвижной фазы: 90% (хроматограмма 1), 95% (хроматограмма 2))

 

Рисунок 5. Хроматограмма раствора сравнения
(подвижная фаза состава: (1,0 г/л гексансульфоната натрия, 0,2 мл/л уксусной кислоты ледяной): (90 % метанола / 10 % ТГФ) = 95 : 5)

 

Хроматограммы растворов сравнения, полученные в подобранных условиях, отвечали требованиям ФЕАЭС. Однако, на хроматограммах испытуемого раствора пики со временем удерживания рибофлавин-5-фосфата натрия не соответствовали требованиям к фактору симметрии. Для решения этой задачи было принято решение увеличить содержание ион-парного реагента в водном компоненте подвижной фазы до 1,25 г/л (рисунок 6). Подробно условия хроматографического разделения описаны в разделе «Материалы и методы».

 

Рисунок 6. Хроматограммы испытуемого раствора
(концентрация гексансульфоната натрия в водной компоненте подвижной фазы – 1 г/л (хроматограмма 2), 1,25 г/л (хроматограмма 1))

 

Для подтверждения химической структуры основного пика на представленной выше хроматограмме было принято решение провести анализ методом хромато-масс-спектрометрии.

В связи с невозможностью использования буферных растворов, содержащих соли, в сочетании с масс-детектором анализ проводили в следующих условиях: ацетонитрил : 0,05% раствор муравьиной кислоты = 5:95, хроматографическая колонка размером 250 × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм заполненная диизобутил н-октадецилсиланом (Zorbax SB-C18 250 × 4,6 мм, 5 мкм), скорость потока 0,5 мл/мин.

Молекулярная масса вещества со временем удерживания целевого пика составила 479 (рисунок 7), из чего можно сделать вывод о том, что пик соответствует рибофлавин-5-фосфату натрия.

 

Рисунок 7. Масс-спектр основного пика на хроматограмме раствора сравнения

 

В ходе разработки методики количественного определения рибофлавин-5-фосфата натрия были подобраны хроматографические условия, позволяющие получать хроматограммы, отвечающие требованиям ФЕАЭС к пригодности хроматографической системы (таблица 1), а также уменьшить время хроматографирования с 20 минут (хроматографическая колонка Zorbax SB-C18, 250 × 4,6 мм, 5 мкм), до 10 минут (хроматографическая колонка Zorbax Eclipse Plus C18 150 × 3,0 мм, 3,5 мкм) (рисунок 8).

 

Рисунок 8. Примеры хроматограмм, полученных в соответствии с разработанной методикой

 (раствор плацебо (прерывистая линия), раствор сравнения (непрерывистая линия), испытуемый раствор (линия «штрих-пунктир»))

 

Валидация методики

Валидацию методики проводили в соответствии с ФЕАС 2.3.14.0 «Валидация аналитических методик» по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость), промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность, диапазон применения.

Проверка пригодности хроматографической системы.

В соответствии с требованиями ФЕАЭС хроматографическая система считается пригодной если:

для 3-х последовательных вводов пробы раствора сравнения относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площадей пика рибофлавин-5-фосфата натрия не более 3,0 %,

фактор симметрии для пика рибофлавин-5-фосфата натрия находится в диапазоне 0,8-1,5,

коэффициент разделения между основным пиком и пиком с относительным временем удерживания 1,2 более 2,0.

Основные параметры хроматографической системы, рассчитанные из хроматограмм раствора сравнения рибофлавин-5-фосфата натрия, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

 Результаты проверки пригодности хроматографической системы

 

Полученные результаты доказывают пригодность хроматографической системы для количественного определения рибофлавин-5-фосфата натрия.

Специфичность

Для проверки специфичности методики анализировали раствор плацебо, раствор сравнения и модельные растворы, содержащие все компоненты плацебо и рибофлавин-5-фосфат натрия, в концентрации соответствующей раствору сравнения (рисунок 1).

На хроматограмме раствора плацебо не обнаружены пики, совпадающие по времени удерживания с пиками рибофлавин-5-фосфата натрия на хроматограммах раствора сравнения;

Открываемость (соотношение среднего значения площади пика рибофлавин-5-фосфата натрия на хроматограммах модельного раствора и раствора сравнения, умноженное на 100 %) составила 100,9 %.

Среднее время удерживания пика рибофлавин-5-фосфата натрия на хроматограммах раствора сравнения соответствовало среднему времени удерживания пика рибофлавин-5-фосфата натрия на хроматограммах модельных растворов и составило 3,1 мин.

Таким образом, экспериментально подтверждено, что присутствие сопутствующих компонентов не влияло на результат анализа.

Линейность

Для проверки линейности путём разведения стандартного раствора были приготовлены растворы, содержащие рибофлавин-5-фосфат натрия в концентрациях, 3,3 мкг/мл, 3,8 мкг/мл, 4,2 мкг/мл, 4,6 мкг/мл, 5,0 мкг/мл, что составляет 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 % от номинальной концентрации рибофлавин-5-фосфата натрия в растворе сравнения.

Для каждого уровня концентрации приготовили по 3 раствора и получили по 3 хроматограммы.

Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием линейной модели. По полученным значениям построили градуировочный график зависимости площади пика рибофлавин-5-фосфата натрия от концентрации (рисунок 9).

 

Рисунок 9. График зависимости площади пика рибофлавин-5-фосфата натрия от концентрации

 

Полученный коэффициент корреляции удовлетворяет требованиям ФЕАЭС, что подтверждает линейность методики на выбранном диапазоне концентраций.

Повторяемость.

Повторяемость была определена одним аналитиком путем анализа шести проб одного и того же однородного образца с использованием одного оборудования, одного набора реактивов в один и тот же день. Испытания проводились, используя навески мультивитаминного комплекса.  

Для каждого испытуемого раствора было найдено содержание рибофлавин-5-фосфата натрия (мг/табл), среднее содержание и величина доверительного интервала. Результаты 6 параллельных испытаний образца БАД приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты исследования повторяемости

ПОВТОРЯЕМОСТЬ
Результаты испытаний
Содержание рибофлавин-5-фосфата натрия, мг/таблетку	4,17	3,96	4,10	4,01	3,97	3,92
Xср, мг/таблетку	4,02
Стандартное отклонение, мг/таблетку	0,09
RSD, %	2,24
Xср ± ΔХср = 4,02 ± 0,09

 

Относительное стандартное отклонение среднего значения (RSDxср, %), рассчитанное для содержания рибофлавин-5-фосфата натрия, полученное в условиях повторяемости, не превышало 3,0 % и соответствовало установленным требованиям.

Внутрилабораторная прецизионность.

Внутрилабораторная прецизионность оценивалась по результатам параллельных испытаний одной серии мультивитаминного комплекса проводимых двумя аналитиками в разные дни. В качестве результатов испытаний, выполненных одним из аналитиков, использовались результаты, полученные при проверке повторяемости. Результаты представлены в Таблице 3.

Результаты испытаний проверили на однородность выборки (по Q(P;n)) и показали, что данные не содержат грубые ошибки. Статистические характеристики, вычисленные для однородной выборки, являются достоверными и могут быть использованы для оценки внутрилабораторной прецизионности.

В этом случае задача сводилась к установлению значимости различия между двумя сред­ними значениями  и  для чего использовался модифицированный тест Стьюдента. Тестом для сравнения двух дисперсий являлся тест Фишера.

Таблица 3.

 Результаты исследования внутрилабораторной прецизионности

ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ ПРЕЦИЗИОННОСТЬ
АНАЛИТИК 1
Результаты испытаний
Содержание рибофлавин-5-фосфата натрия, мг/таблетку	3,92		3,96	3,97			4,01	4,10		4,17
Размах (R)	0,25
Qn (1)	-		0,16	0,04			0,16	0,36		,28
Xср (1), мг/таблетку	4,02
S1, мг/таблетку	0,09
RSD 1, %	2,2
АНАЛИТИК 2
Результаты испытаний
Содержание рибофлавин-5-фосфата натрия, мг/таблетку		3,96				4,05			4,14
Размах (R)		0,2
Qn (2)		-			0,45				0,45
Xср (2), %		4,05
S2, мг/таблетку		0,1
RSD 2, %		2,5
F		1,23
T		0,40

Правильность

Для проверки правильности были приготовлены модельные растворы, содержащие рибофлавин-5-фосфат натрия в концентрациях, соответствующих примерно 80 %, 100 %, 120 % от номинальной в испытуемом растворе.

Подтверждение правильности полученных данных осуществлялось путем вычисления смещения |хср – m| и проверки значимости отличия случайной величины хср от константы m (принятого эталонного значения).

Различие являлось незначимым (полученные результаты определения не отягощены систематической ошибкой) при выполнении неравенства (1):

где     m – принятое эталонное значение определяемого компонента (в проводимых испытаниях m = С (заданное содержание определяемых веществ в пробе));

ν – число степеней свободы;

n – число измерений;

P - доверительная вероятность;

S – абсолютное СКО среднего значения;

t (P, ν) – табличное значение критерия двухстороннего распределения Стьюдента.

Результаты проверки правильности приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Результаты исследования правильности

ПРАВИЛЬНОСТЬ
Искомое содержание (μ) = 4,24 мг/мл
№ испытания	1		2	3
Содержание рибофлавин-5-фосфата натрия, мг/мл	4,126		4,213	4,347
Размах (R)	0,221
Qn	-		0,39	0,61
Мах Qn	0,61
Xср, мг/мл	4,229
S, мг/мл	0,111
	0,17	< t (P, ν)табл. = = t (0,95; 2) = 4,30		Соотв.
Искомое содержание (μ) = 5,30 мг/мл
№ испытания	1		2	3
Содержание рибофлавин-5-фосфата натрия, мг/мл	5,276		5,366	5,399
Размах (R)	0,123
Qn	-		0,73	0,27
Мах Qn	0,73
Xср, мг/мл	5,35
S, мг/мл	0,06
	1,44	< t (P, ν)табл. = = t (0,95; 2) = 4,30		Соотв.
Искомое содержание (μ) = 6,36 мг/мл
№ испытания	1		2	3
Содержание рибофлавин-5-фосфата натрия, мг/мл	6,406		6,429	6,500
Размах (R)	0,0094
Qn	-		0,24	0,76
Мах Qn	0,76
Xср, мг/мл	6,45
S, мг/мл	0,05
	3,15	< t (P, ν)табл. = = t (0,95; 2) = 4,30		Соотв.

Полученные выборки являлись однородными, смещение результата измерения, отнесенное к абсолютному СКО среднего значения, не превышало значения критерия двухстороннего распределения Стьюдента для Р2 = 0,95 и заданного числа измерений.

Изучение стабильности

Определение стабильности проводили для раствора сравнения и модельного раствора.

Растворы анализировали согласно методике после приготовления и спустя определенное время, прошедшее после приготовления раствора (хранение при температуре 10 ^оС, поддерживаемой автосамплером).

По результатам изучения стабильности было показано, что раствор сравнения и модельный раствор стабильны в течении 16 часов после приготовления при хранении в защищенном от света месте при температуре +10 °С.

Регулирование хроматографических условий

Для проверки пригодности хроматографической системы при изменении хроматографических условий анализировали раствор сравнения при варьировании определенных параметров, описанных ниже:

- состав подвижной фазы (± 30 % ТГФ (относительное содержание));

- концентрация гексансульфоната натрия в буферном компоненте подвижной фазы (± 10 % (относительное содержание));

- скорость потока (-50 %);

- температура термостата колонок (± 10 °С).

Пригодность хроматографической системы была подтверждена для всех описанных случаев.

Аналитическая область

Аналитическая область методики (диапазон применения методики) доказана подтверждением того, что методика имеет приемлемую степень линейности, правильности и прецизионности при анализе образцов с содержанием рибофлавина-5-фосфат натрия в данном диапазоне.

На основании проведенной валидации методики диапазон её применения равен 3,8-5,0 мкг/мл рибофлавина-5-фосфата натрия в испытуемом растворе.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана методика для определения количественного содержания рибофлавина-5-фосфата натрия в мультивитаминном комплексе методом обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пригодность методики подтверждена соответствием основных валидационных характеристик – специфичности, линейности, правильности, промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности, аналитического диапазона – критериям приемлемости. Методика может быть применена для контроля качества различных мультивитаминных комплексов, содержащих рибофлавин-5-фосфат натрия.

 

Список литературы:

1. Hilary J Powers. Riboflavin (vitamin B-2) and health / H. Powers // The American Journal of clinical nutrition – 2003. – Vоl. 77, № 6. – P. 1352–1360.
2. Northrop-Clewes C. The Discovery and Characterization of Riboflavin / C.A. Northrop-Clewes  // Annals of nutrition and methabolism – 2012. – Vоl.61, №3. – P. 224-230.
3. Muhammad Ali Sheraz. Photo, thermal and chemical degradation of riboflavin / M. Sheraz // Beilstein journal of organic chemistry– 2014. – Vоl. 10. – P. 1999–2012.
4. Kim H. J. Development of an ion-pairing reagent and HPLC-UV method for the detection and quantification of six water-soluble vitamins in animal feed //International Journal of Analytical Chemistry. – 2016. – Т. 2016.
5. Yefimov S. HPLC/MS Analysis of Riboflavin Sodium Phosphate Consisting of Several Structural Isomers Together with Thiamine HCL, Pyridoxine HCL, Dexpanthenol, and Nicotinamide in A Multi-Vitamin Injection Solution /S. Yefimov // Scholars Academic Journal of Pharmacy. – 2024. – Vol.13(2). – P.42-54
6. F.L.Lam. The simultaneous assay of riboflavin Sphosphate sodium and other water-soluble vitamins in liquid multivitamin formulations by liquid chromatography   / F.L.Lam  // Journal of pharmaceutical and biomedical analysis– 1988. – Vоl.6, №1. – P. 87-95.
7. Jennifer L. Golbach. Riboflavin in nutrition, food processing and analusis / J. L. Golbach // Journal of food research– 2014. – Vоl.3, №6. – P. 23-35.
8. Ramesh. B.V. Stability indicating method for the validation of riboflavin in dosage forms / B.V. Ramesh // Rasayan J.Chem. 2016.  – Vol.9 (4). – P.573-581
9. Keiko O. High-Performance Liquid Chromatographic Determination of Riboflavin Sodium Phosphate Based on Its Conversion to Riboflavin with Acid Phosphatase / O. Keiko // Eisei Kagaku. – 1995. – Vol.41. – P.358-363.
10. Golbach J. L. et al. Adaptation of Lactobacillus rhamnosus riboflavin assay to microtiter plates //Journal of Food Composition and Analysis. – 2007. – Т. 20. – №. 7. – С. 568-574.
11. Фармакопея Евразийского экономического союза Ч.2. Т1. / Евразийская экономическая комиссия. — Москва, 2023. — 458 с.