ИЗВЛЕЧЕНИЕ АМИГДАЛИНА ИЗ СОСТАВА ОРЕХА И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

АННОТАЦИЯ

Процесс извлечения и определения амигдалина был оптимизирован. В этом процессе влияние времени, концентрации растворителя, соотношения твердой и жидкой фаз и температуры на содержание амигдалина в экстрактах оценивалось с помощью двух математических моделей. Согласно результатам исследования, оптимальные условия: 120 минут, 100% (v/v) вода, соотношение твердой и жидкой фаз 1:25 (m/v) и температура 34,4°C. При таких условиях предполагаемое содержание амигдалина в высушенном экстракте составляет (11,42 г на 100 г), что экспериментально подтверждено (9,15 г на 100 г высушенного экстракта). Амигдалин (>90%) был выделен из сложной экстракционной смеси и систематически охарактеризован с помощью ИК-спектроскопия и ВЭЖХ методов.

ABSTRACT

The process of extraction and determination of amygdalin was optimized. In this process, the effects of time, solvent concentration, solid-to-liquid ratio, and temperature on the amygdalin content in the extracts were evaluated using two mathematical models. According to the research results, the optimal conditions are: 120 minutes, 100% (v/v) water, a solid-to-liquid ratio of 1:25 (m/v), and a temperature of 34.4°C. Under these conditions, the predicted amygdalin content in the dried extract is 11.42 g per 100 g, which was experimentally confirmed at 9.15 g per 100 g of the dried extract. Amygdalin (>90%) was isolated from the complex extraction mixture and systematically characterized using IR.

Ключевые слова: амигдалин, высокоэффективная жидкостная хроматография, ИК-спектроскопия, экстракция.

Keywords: amygdalin, high-performance liquid chromatography, IR spectroscopy, extraction.

ВВЕДЕНИЕ

Амигдалин — это природное химическое соединение, относящееся к группе цианогенных гликозидов. Природный амигдалин имеет хиральный фенильный центр с конфигурацией (R). При легких основных условиях этот стереогенный центр изомеризуется; (S)-эпимер называется неоамигдалином. Хотя синтезированный вариант амигдалина является (R)-эпимером, стереогенный центр, связанный с нитрилом и фенильными группами, легко подвержен эпимеризации (Рисунок 1) [1].

Рисунок 1. Структурная формула амигдалина

Амигдалин встречается в растениях семейства Rosaceae и Passifloraceae. Его токсичность связана с выделением цианистого водорода в метаболических процессах. Это обеспечивает естественную защиту растения. При пероральном приеме амигдалин считается очень токсичным. Цианистый водород, выделяющийся в результате ферментативного гидролиза амигдалина, может вызвать тошноту, головную боль и головокружение, судороги, а также привести к коме и смерти. Его токсичность связана с высокой сродством к ионам железа (Fe³⁺). В результате блокируется клеточное дыхание и происходит избыток выделения молочной кислоты. Метаболизм амигдалина в организме зависит от множества факторов, таких как пищеварительные ферменты, микробиом кишечника, добавки и лекарства [2]. Однако амигдалин также обладает лечебными свойствами. Его противоопухолевая активность связана с двумя гидролитическими ферментами (β-глюкозидазой и роданазой). Избыток недостатка β-глюкозидазы и роданазы может привести к выходу и накоплению токсичного цианистого водорода, что вызывает клеточную смерть. Некоторые используют амигдалин как ошибочно интерпретируемый витамин B17, нехватка которого может способствовать развитию рака. Наконец, исследования in vitro, проведенные в конце 20 века, подтвердили противоопухолевую активность амигдалина и его полезное влияние на кровообращение, дыхательную и пищеварительную системы. Установлено, что амигдалин ингибирует размножение раковых клеток и вызывает их апоптоз. Кроме того, было отмечено, что при высоких концентрациях и длительных периодах воздействия амигдалин оказывается более эффективным против раковых клеток шейки матки, простаты или печени. В настоящее время использование амигдалина в лечении рака имеет как сторонников, так и противников [3]. Анализ амигдалина в различных матрицах (растительный материал, вода, сточные воды и биологические материалы) изучается многими учеными [4]. Сюй и другие исследовали экстракцию амигдалина из семян яблок и анализировали неоамигдалин и амигдалин с помощью ВЭЖХ-MС/MС и ВЭЖХ-DAD [5]. Кроме того, Фэн и др. [6] анализировали содержание амигдалина в семенах вишни с помощью капиллярного электрофореза. С помощью ВЭЖХ определили его концентрацию в семенах яблок, свежих яблоках и яблочном соке. Дискуссии о применении амигдалина как витамина Б 17 продолжаются активно. С одной стороны, это соединение обладает высокой терапевтической активностью и используется как противораковое средство. С другой стороны, амигдалин классифицируется как опасное вещество, способное проявлять высокую токсичность из-за выделения молекулы высокотоксичного HCN в биологических процессах. Исходя из свойств амигдалина, анализ этого соединения направлен на изучение его содержания в двух различных образцах. Для определения содержания амигдалина в различных пищевых и биологических материалах применяются различные методы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Реактивы. Стандарт амигдалина с чистотой ≥99% (Sigma Aldrich LOT: A6005), бромид калия спектроскопической чистоты (Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия), ацетонитрил ВЭЖХ-качества (Merck, Дармштадт, Германия), диэтиловый эфир с чистотой ≥99% (VWR International, Луттеруорт, Великобритания), этанол 96%, абсолютный этанол, уксусная кислота.

Процедура экстракции и очистки

Растительный материал (2,00 г) помещался в круглую колбу объемом 100 см³ и заливался точно отмеренным объемом этанола. Экстракция при высокой температуре проводилась в обратном холодильнике, при низкой — в закрытых емкостях. Температура системы поддерживалась с помощью водяной бани. После экстракции экстракт отделялся от твердого растительного материала путем фильтрации. Растительные экстракты выпаривались в ротационном испарителе под низким давлением для удаления растворителя, а затем хранились в эксикаторе до постоянной массы. После добавления 10 см³ диэтилового эфира к комплексной экстракционной смеси амигдалин выпадал в осадок, а жирные соединения оставались в растворе. Жирные соединения удалялись путем декантации. Остаточный растворитель удалялся, а твердая фаза высушивалась при 30°C. Таким образом, образец был подготовлен для определения его чистоты с использованием методов высокоэффективная жидкостная хроматография с диодной массивной детекцией и ИК-спектроскопия.

Подготовка образцов для ВЭЖХ анализа.

Для определения содержания амигдалина в высушенном экстракте и его чистоты образцы этанолового экстракта (10 мг) помещались в колбу объемом 100 см³, после чего заполнялись подвижной фазой до метки. После 5 минут экстракции раствор переносился в колбу объемом 10 см³ и разбавлялся 1 см³ подвижной фазы. Образец фильтровался через целлюлозный мембранный фильтр (0,45 мкм, Econofilters, Agilent Technologies, Германия) и отправлялся в ВЭЖХ-систему. Определение времени удерживания амигдалина в экстракте и изоляции семян проводилось на основе сравнения с хроматограммами стандартного образца и ИК-спектрами.

Выделение амигдалина из растительного экстракта и определение его количества проводилось с использованием разработанного и подтвержденного метода ВЭЖХ. Состав амигдалина был рассчитан и выражен для 100 г высушенного экстракта. Чистота амигдалина, выделенного методом экстракции, была определена с помощью стандарта в ВЭЖХ, а его структура была подтверждена методом ИК-спектроскопии.

ВЭЖХ анализ

Для определения содержания амигдалина в образцах использовался метод ВЭЖХ с колонкой Shim-pack GIST-HP C18 150x4,6 мм 3 мкм (Shimadzu, Япония), с использованием ацетонитрила и воды в соотношении 15:85, скорость потока 1 мл/мин, температура термостата 40°C. Образец объемом 10 мкл анализировался в течение 6 минут, при этом были получены хроматограммы стандартных образцов на приборе ВЭЖХ (LC 2030 C 3D Plus Shimadzu, Япония) (Рисунок 2, Таблица-1).

Рисунок 2. Хроматограмма стандартного образца амигдалина

Таблица 1.

Результаты хроматограммы амигдалина в высокоэффективной жидкостной хроматографии

ИК-спектроскопия ИК-спектры были зарегистрированы на спектрометре ИК-спектроскопия Shimadzu с использованием стандартного детектора DTGS/KBr и сканирования в диапазоне 4000–500 см⁻¹ с разрешением 2 см⁻¹. Для подготовки образцов использовалась техника диска из бромида калия.

Рисунок 3. ИК-спектр стандартного образца амигдалина

Рисунок 4. ИК-спектр очищенного амигдалина после экстракции

РЕЗУЛЬТАТЫ  И  ОБСУЖДЕНИЯ.

Извлечённый из экстракта орехового семени амигдалин представляет собой бесцветный порошок без запаха. Его чистота более 90% была подтверждена сравнением с существующим стандартом амигдалина с использованием метода ВЭЖХ. ИК-спектроскопический метод подтвердил наличие функциональных групп в амигдалине. ИК-спектры изолированного амигдалина и его стандарта представлены на дополнительном рисунке 4. В структуре амигдалина первичные и вторичные гидроксильные группы глюкозной части дают интенсивные и широкие полосы в диапазоне 3640–3630 см⁻¹. Полосы на более высоких длинах волн соответствуют первичным гидроксильным группам, а на более низких — вторичным. Линии выше 3000 см⁻¹ указывают на колебания растяжения CH ароматического кольца, а сигнал на 2900 см⁻¹ относится к растяжению алфатического CH. Растяжение связи CO приводит к появлению полос на 1100 см⁻¹. Также из-за наличия CN-группы в амигдалине можно заметить полосу на 2200 см⁻¹. Молекула амигдалина вызывает две полосы на 1600 и 1400 см⁻¹, которые являются результатом растяжения связи C=C в бензольном кольце. Деформационные колебания CH ароматического кольца проявляются в виде полосы на 1450 см⁻¹. Все эти линии, соответствующие группам молекулы амигдалина без новых колебаний в ИК-спектре, указывают на удовлетворительную чистоту выделенного амигдалина (Рисунок 3,4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данного исследования были предложены условия для извлечения амигдалина из плодов ореха. Основным преимуществом извлечения амигдалина из сухих плодов является его высокое содержание. Чистота экстрагированного амигдалина, проверенная методом HPLC в сравнении с существующим стандартом, была более 90%. Структура выделенного амигдалина была подтверждена с помощью методов ИК-спектроскопии и ВЭЖХ.

Список литературы:

1. Bolarinwa I. F., Orfila C., and Morgan M. R. Amygdalin content of seeds, kernels and food products commercially-available in the UK. Food Chem. 152. 2014. 133–139. doi: 10.1016/j.foodchem.2013.11.002.
2. Zhou C., Qian L., Ma H., Yu X., Zhang Y., Qu W., et al. Enhancement of amygdalin activated with β-D-glucosidase on HepG2 cells proliferation and apoptosis. Carbohydr. Polym. 90, 2012. 516–523. doi: 10.1016/j.carbpol.2012.05.073
3. Kokosa J. M., Przyjazny A., and Jeannot M. Solvent Microextraction: Theory and Practice. New York, NY: 2009. John Wiley and Sons.
4. Lv W.F.; Ding M.Y.; Zheng R. Isolation and quantitation of amygdalin in Apricot-kernel and Prunus Tomentosa Thunb. by HPLC with solid-phase extraction. J. Chromatogr. Sci. 2005. 43. 383–387.
5. Xu S.; Xu X.; Yuan S.; Liu H.; Liu M.; Zhang Y.; Zhang H.; Gao Y.; Lin R.; Li X. Identification and analysis of amygdalin, neoamygdalin and amygdalin amide in different processed bitter almonds by HPLC-ESI-MS/MS and HPLC-DAD. Molecules 2017. 22. 1425.
6. Feng Y.; Liu H.; Wang L. Determination of Amygdalin in Cherry Seed by Capillary Electrophoresis. In Proceedings of the IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, Malang City. Indonesia, 12–13 March 2019. Volume 218.
7. Hwang E. Y., Lee S. S., Lee J. H., and Hong S. P. Development of quantitative extraction method of amygdalin without enzymatic hydrolysis from tōnin (Persicae semen) by high performance liquid chromatography. Arch. Pharm. Res. 2002a. 25, 453–456. doi: 10.1007/BF02976601.