СКРИНИНГ АНТИКОАГУЛЯНТНЫХ СВОЙСТВ ЭТАНОЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ ЭНДОФИТНЫХ ГРИБОВ

АННОТАЦИЯ

Проведен масштабный скрининг эндофитных грибов коллекционной базы по определению активированного времени рекальцификации плазмы крови. Отработана методика определения, отличающаяся использованием спиртовых экстрактов вторичных метаболитов. Установлено, что более 30% экстрактов исследуемых культур в различной степени увеличивают активированное время рекальцификации, свидетельствующее о наличии соединений, обладающих антикоагулянтными свойствами. Отобраны эндофитные грибы родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, способные полностью предотвращать образование нитей фибрина, ассоциированные с такими растениями как базилик, шафран, каштан, цикорий, кориандр, характеризующиеся наличием антикоагулянтных свойств. Предварительно определен качественный состав вторичных метаболитов этанольных экстрактов. Выявлены соединения, относящиеся к таким классам как танины, фенолы, алкалоиды, флавоноиды, терпеноиды, антрахиноны, сердечные гликозиды.

ABSTRACT

A large-scale screening of endophytic fungi from the collection base was carried out to determine the activated time of recalcification of blood plasma. A determination method has been developed, characterized by the use of alcohol extracts of secondary metabolites. It was found that more than 30% of the extracts of the studied cultures increase the activated recalcification time to varying degrees, indicating the presence of compounds with anticoagulant properties. Endophytic fungi of the genera Aspergillus, Penicillium, Fusarium were selected, capable of completely preventing the formation of fibrin threads, associated with plants such as basil, saffron, chestnut, chicory, coriander, characterized by the presence of anticoagulant properties. The qualitative composition of secondary metabolites of alcohol extracts has been preliminarily determined. Compounds belonging to such a class as tannins, phenol, alkaloids, flavоnoids, terpenoids, anthraquinone, cardiac glycosides were identified.

Ключевые слова: антикоагулянтные свойства, активированное время рекальцификации, эндофитные грибы, качественный состав.

Keywords: anticoagulant properties, activated recalcification time, endophytic fungi, qualitative composition.

Введение. Свертывание крови представляет собой гомеостатический механизм, посредством которого останавливает кровотечение или кровоизлияние в организме. Однако, повышенная коагуляция и образующиеся сгустки крови могут остановить нормальный кровоток и препятствовать поступлению питательных веществ и кислорода к клеткам и тканям, что может привести к их гибели [1]. Основными клиническими признаками густой крови является: сухость во рту; быстрая утомляемость; частая сонливость; рассеянность; выраженная слабость; депрессивное состояние; артериальная гипертензия; головные боли; тяжесть в ногах; постоянно холодные ноги и руки; онемение и покалывание в участках с нарушенной микроциркуляцией крови; узелки на венах. Синдром повышенной вязкости крови не является заболеванием, но при наличии серьезных патологий может вызывать тяжелые и грозные осложнения [2]. Повышенной свертываемостью крови характеризуются такие заболевания как сахарный диабет, ожирение, ревматизм. При инфекции COVID-19 обнаружен синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, при котором повреждается фибринолиз - процесс, обеспечивающий разрушение уже сформированных кровяных сгустков [3]. В связи с вышеизложенным, востребованность тромболитиков и разжижающих кровь препаратов в качестве профилактических и лечебных мер, возрастает из года в год.  

Сегодня в качестве антикоагулянтов широко применяют гепарин, клексан, варфарин. Однако, большинство из них имеют побочные эффекты. Например, варфарин, широко используемый антикоагулянт, демонстрирует такие побочные эффекты, как синяки, кровоточивость десен, покраснение или темно-коричневая моча, красные или черные испражнения, носовые кровотечения, кровохарканье, одышка и дисфагия, более тяжелые, чем обычно менструальные периоды, сильное кровотечение из раны, сильная головная боль и головокружение, отек и дискомфорт [4].

Одновременно с этим известны и лекарственные растения с антикоагулянтными свойствами и меньшими побочными эффектами, которые могут быть более лучшим и мягким вариантом при лечении широкого спектра ряда заболеваний, включая сердечно-сосудистые [5 - 8].

Альтернативным, доступным и неисчерпаемым источником антикоагулянтных веществ могут также стать эндофитные грибы, бессимптомно обитающие внутри растений, и являющиеся продуцентами как схожих с растением – хозяином соединений, так и новых еще неизученных.

В этой связи, целью настоящего исследования стал скрининг антикоагулянтных свойств метаболитов эндофитных грибов, ассоциированных с лекарственными растениями Узбекистана.

Материалы и методы исследования

Из 24 растений, обладающих антикоагулянтными свойствами и произрастающих в различных климатических условиях и географических поясах республики, было выделено более 80 изолятов эндофитных грибов.

Выделение эндофитных грибов проводили по  Strobel et al., с небольшими изменениями. Для выделения эндофитных грибов образцы стеблей и листьев растений предварительно замачивали в 70%-ном этиловом спирте на 1 мин, затем промывали стерильной водой, образцы асептически измельчали до толщины 0,5 см и высевали на питательную среду Чапека – Докса с агаром в чашку Петри. В среду добавляли 50 мг/мл хлортетрациклина и 250 мг/мл стрептомицина для остановки роста бактерий. Чашки выращивали при 28°С в течение 7–14 дней. Выросшие изоляты грибов культивировали на чистой агаризованной среде Чапека – Докса, не содержащей антибиотиков [9].

Вторичные метаболиты выделяли из биомассы эндофитных грибов, выращенных на картофельно – декстрозном будьоне (КДБ) в условиях жидкофазной ферментации при рН-6,8-7,2, температуре 28⁰С и 180 об/мин на качалке.

По методу Lang с сотр. с модификациями Hazalin 1г замороженной при - 40°С биомассы гомогенизировали растиранием с кварцевым стеклом в ступке, переносили в коническую колбу, содержащую 5 мл этилового эфира уксусной кислоты (этилацетат), и оставляли на сутки на качалке при комнатной температуре для перемешивания. Затем смесь отфильтровывали через бумажный фильтр (ватман бумага №1) и добавляли Na₂SO₄ из расчета 40 мкг/мл для удаления водного слоя. Далее смесь упаривали досуха на роторном испарителе и получали сухой остаток, который ресуспензировали в 1 мл этиловом спирте. Полученные экстракты хранили при температуре +4⁰ С и использовали для определения антикоагулянтных свойств [10].

Образцы крови, получали от здоровых людей, не получавших антикоагулянты. Венозную кровь в объеме 3 мл отбирали в вакуумированные пробирки (BD Vacutainer 4557-3204XF433), содержащие 3,8% цитрата натрия. Эти пробирки поддерживали соотношение крови и антикоагулянта на уровне 9:1. Далее пробирки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 минут и отделяли плазму. Время рекальцификации крови обычно измеряли в течение получаса после забора образца. 200 мкл плазмы инкубировали при 37°С в течение 120 секунд и добавляли 40 мкл спиртовых экстрактов эндофитных грибов. К этой смеси добавляли 200 мкл 0,025 М хлорида кальция, обеспечивающего стандартизацию контактной активизации факторов свертывания, и одновременно включали секундомер [11].

Пробирки осторожно наклоняли вперед и назад с легким вращательным движением с интервалами примерно в 20 секунд, чтобы наблюдать за появлением нитей фибрина. Время, прошедшее между добавлением хлорида кальция и образованием самых ранних нитей фибрина, регистрировали как время рекальцификации крови. Испытание проводили дважды, а результаты усредняли. Положительный контроль – плазма, отрицательный контроль – плазма + этанол, испытуемые образцы - плазма + этанольные экстракты. Норма образования нитей фибрина - 1-2 минуты.

Наличие танинов и фенольных веществ определяли путем добавления к 2 мл полученного экстракта 2-3 капель 1% раствора FeCL3. В присутствии ионов железа танины дают черно-синий или черно-зеленый цвет, фенолы - фиолетовый.

Наличие сапонинов устанавливали путем растворения 1 мл экстракта в 5 мл горячей воды (60°С) с дальнейшим интенсивным встряхиванием в течение 5 минут до образования стойкой пены. Объем пены сохранялся в течении последующих 30 минут.

Наличие терпеноидов определяли путем смешивания 0,5 мл экстракта с 2 мл хлороформа и 3 мл. H2SO4 (конц.). Образование между фазами красно-коричневого окрашивания говорило о наличии терпеноидов.

Наличие антрахинонов устанавливали смешиванием 2 мл экстракта с 4 мл гексана и последующим встряхиванием. При этом наблюдалось разделение экстракта на 2 слоя. Верхний слой отделяли, обрабатывали 4 мл разведенного 10% аммиака и определяли окраску нижнего слоя. Фиолетово-розовая окраска говорила о наличии антрахинонов.

Наличие сердечных гликозидов определяли путем смешивания 1 мл экстракта с 1 мл ледяной уксусной кислоты и последующим добавлением 1 капли 3% хлорида железа в метаноле. Затем добавляли по стенке пробирки H2SO4 (конц.) и определяли окраску нижнего слоя. Сине-зеленое окрашивание говорило о наличии сердечных гликозидов.

Наличие алкалоидов основаны на способности алкалоидов образовывать не растворимые в воде соединения с солями тяжелых металлов, с комплексными йодидами, комплексными кислотами и другими соединениями кислотного характера. Эти реакции позволяют установить наличие алкалоидов даже при незначительном их содержании. Раствор йода в растворе калия йодида (реактив Вагнера, реактив Бушарда) с алкалоидами образуют бурые, трудно растворимые в воде осадки. К 1 мл эстракта добавляют 5 капель реактива для осаждения алкалоидов. При наличии алкалоидов появляется бурый осадок.

Тест на белок: к 2 мл каждого экстракта добавляли 1 мл 40% гидроксида натрия и несколько капель 1% сульфата меди; образование фиолетового цвета указывает на присутствие молекул пептидной связи в экстракте образца.

Тест на флавоноиды: к 2 мл каждого экстракта добавляли несколько капель 20% гидроксида натрия, наблюдается образование интенсивного желтого цвета. К нему было добавляем несколько капель 70% разбавленной соляной кислоты и желтый цвет исчезает. Образование и исчезновение желтого цвета указывает на присутствие флавоноидов в экстракте пробы [12].

Результаты и обсуждение

Проведен первичный скрининг антикоагулянтных свойств вторичных метаболитов эндофитных грибов, ассоциированных с такими растениями как: ферула, барвинок, тимьян, базилик, каштан, ромашка, цикорий, подорожник, гинко, хрен и др. Экстракцию вторичных метаболитов из биомассы эндофитных грибов осуществляли этилацетатом, с последующим получением этанольных экстрактов. Для скрининга этанольных экстрактов вторичных метаболитов большого количества эндофитных изолятов с предполагаемыми антикоагулянтными свойствами разработана методика определения времени рекальцификации плазмы крови (АВР) (Рис.1).

Активированное время рекальцификации плазмы крови (АВР) – представляет собой промежуток времени, который затрачивается на образование из плазмы фибринового сгустка после добавления солей кальция. Данный показатель дает информацию об общей активности свертывающей системы крови.

Результаты первичного скрининга этанольных экстрактов антикоагулянтных свойств вторичных метаболитов исследуемых эндофитных грибов представлены на рисунке 2, таблице 1.

Рисунок 1. Схема определения активированного времени рекальцификации плазмы крови (АВР)

Учитывая норму образования нитей фибрина в 1-2 минуты, определено 3 группы экстрактов, отличающиеся активностью:

1 группа (21%) - АВР больше нормы в 5-10 раз

2 группа (29%) - АВР больше нормы в 20-40 раз

3 группа (50%) - нити фибрина не образуются

Рисунок 2. Активированное время рекальцификации плазмы (АВР) этанольных экстарктов эндофитных грибов

(Контроль АВР – 1,43, Этанол АВР – 1,48)

Таблица 1.

Эндофитные грибы с высоким АВР (>120.0 мин.)

Наиболее интересная  третья группа - экстракты, которые способны полностью предотвращать образование нитей фибрина, включила в себя представителей родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium ассоциированные с такими растениями как: Базилик (Ocimum basilicum), Шафран (Crocus sativus), растения рода Vinca, Кориандр посевной (Coriandrum sativum), Каштан посевной (Castanea sativa), Цикорий (Cichórium íntybus), Подорожник (Plantago major), Гинкго билоба (Ginkgo biloba).

Для  идентификации и определения качественного состава вторичных метаболитов этанольных экстрактов отобраны штаммы с АВР более 120 минут и ассоциированные с растениями, обладающими антикоагулянтными свойствами: Aspergillus terreus - OB4R, Penicillium sp.- CS50R, Penicillium concavoradulozum - VE89L, Aspergillus terreus - VR176L, Aspergillus amstelodami - VR177L, Penicillium sp. - CS13L, а также 5 вновь выделенных изолятов эндофитных грибов.

Состав экстрактов вторичных метаболитов определяли фитохимическими качественными реакциями. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Известные на сегодняшний день антикоагулянты относятся к различным классам веществ и имеют разные механизмы действия. Например, антикоагулянт терпеноидной природы - гинкголид - это терпеновый лактон, который получают из листьев гинкго билоба. Гинкголиды способны ингибировать фактор активации тромбоцитов и предотвращать агрегацию тромбоцитов [16]. Также препятствовать образованию тромбов способны танины чая, фенолы фруктов и ягод (ресвератрол винограда, кверцетин яблок, эллаговая кислота граната, малины, ежевики), флавоноиды цитрусовых.

Таблица 2.

Фитохимический анализ качественного состава этанольных экстрактов отобранных эндофитных грибов с высоким АВР (>120.0 мин.)

Таким образом, учитывая, что эндофиты являются продуцентами как схожих с растением – хозяином соединений, так и новых еще неизученных, проведенные нами исследования показывают перспективность отобранных в результате скрининга штаммов эндофитных грибов, ассоциированных с лекарственными растениями республики, в качестве источников природных антикоагулянтов.

Список литературы:

1. Key, N., Makris, M., O’Shaughnessy, D., Lillicrap, D., 2009. Practical Hemostasis and Thrombosis. Wiley Online Library.
2. Testa S., Prandoni P., Paoletti O. et al. Direct oral anticoagulant plasma levels’ striking increase in severe COVID-19 respiratory syndrome patients treated with antiviral agents: The Cremona experience. J Thromb Haemost. 2020; 18(6): 1320–23. doi: 10.1111/jth.14871.
3. П.А. Воробьев, А.П. Момот, А.А. Зайцев, В.А. Елыкомов, Д.А. Сычев, Л.С. Краснова, А.П. Воробьев, С.А. Васильев, Н.А. Воробьева. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при инфекции COVID-19. Журнал Терапия, 2020, №5. DOI: https://dx.doi.org/10.18565/therapy.2020.5.25-34.
4. Kuhn, M., Campillos, M., Letunic, I., Jensen, L.J., Bork, P., 2010. A side effect resource to capture phenotypic effects of drugs. Mol. Syst. Biol. 6, 343.
5. Muhammad Akram & Abid Rashid. Anti-coagulant activity of plants: mini review. J Thromb Thrombolysis. 2017, 44:406-411 DOI 10.1007/s11239-017-1546-5.
6. Johra Khan. Anticoagulation effect of extracts of leaves of Ocimum basilicum L. and Ficus palmata F. Ann. Citation Phytomed., 2021, 10(2):1-4.
7. Tarik Khouya et al. Anti-inflammatory, anticoagulant and antioxidant effects of aqueous extracts from Moroccan thyme varieties. Asian Pac J Trop Biomed 2015; 5(8): 636–644.
8. Hossein Ayatollahi,1 Atefeh Ordoei Javan,2 Mohammad Khajedaluee,3 Masood Shahroodian4 and Hossein Hosseinzadeh5*.Effect of Crocus sativus L. (Saffron) on Coagulation and Anticoagulation Systems in Healthy Volunteers. Phytother. Res. 2014, 28: 539–543.
9. Strobel G, Yang X, Sears J, Kramer R, Sidhu R.S., and Hess W. M., “Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallachiana,” Microbiology (Reading), vol. 142 ( Pt 2), pp. 435–440, Feb. 1996, doi: 10.1099/13500872-142-2-435.
10. Hazalin N.A., Ramasamy K., Lim S.M., Wahab I.A., Cole A.Lj, Majeed A.A. Cytotoxic and antibacterial activities of endophytic fungi isolated from plants at the National Park, Pahang, Malaysia. BMC Complementary and alternative medicine. 2009, 9:46. 49.
11. Синюк И.В., Дударев В.А., /Свертывающей системы крови и кровоснабжения головки тазобедренного сустава в патогенезе болезни пертеса. Международный журнал экспериментального образования. – 2015. – № 11 (часть 1) – С. 78-80.
12. Prabhavathi R. M., Prasad M. P., Jayaramu M. Studies on Qualitative and Quantitative Phytochemical Analysis of Cissus quadrangularis. // Applied Science Research, 2016. - 7(4):11-17.
13. Abdulmyanova L.I., Ruzieva D.M., Sattarova R.S., Gulyamova T.G. Vinca Alkaloids Produced by Endophytic Fungi Isolated from Vinca Plants. // International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. Vol.7, N 06, 2018. - рр. 2244-2250.
14. Abdulmyanova L.I., Gulyamova T.G., Ruzieva D.M., Rasulova G.A., Yusupov U.K. The Impact Of Plant Extracts On The Metabolic Profile Of Endophytic Fungi Isolated From Vinca Plants. // J. Plant Cell biotech. and molecular biology, 2020, 21(57&58):109-117.
15. Abdulmyanova L.I., Yusupov U.K., Yodgorova N.T., Sharipova Z.O., Shakhmurov N. A. Endophytic Fungi Of Medicinal Plants Of Uzbekistan As Producers Of Antibiotic Compounds.// European Journal of Molecular and Clinical Medicine, Volume 07, Issue 03, 2020, рр. 3247-3257.
16. Zhao H, Guo Q, Li B and Shi M (2022) The Efficacy and Safety of Ginkgo Terpene Lactone Preparations in the Treatment of Ischemic Stroke: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Clinical Trials. Front. Pharmacol. 13:821937. doi: 10.3389/fphar.2022.821937.