ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ФОРМ ГЕМОГЛОБИНА В РАСТВОРАХ ПО ИХ ЭТАЛОННЫМ СПЕКТРАМ ПОГЛОЩЕНИЯ

АННОТАЦИЯ

Целью настоящей работы стал анализ приведенных в литературе формул и определение концентрации основных форм гемоглобина по эталонным спектрам поглощения. Работа представляет собой исследование известных в литературе формул по определению основных форм гемоглобина. Показано, что присутствие в растворе нескольких производных форм гембелка увеличивает отклонение рассчитанных показателей от эталонных данных при определении дезоксигемоглобина и в меньшей степени оксигемоглобина. Установлено, что формула для определения содержания метгемоглобина обладает погрешностью 79.0% при условии нахождения в моделируемом растворе только этой формы.

ABSTRACT

The purpose of this work was to analyze the formulas given in the literature and determine the concentration of the main forms of hemoglobin using reference absorption spectra. The work is a study of formulas known in the literature for determining the main forms of hemoglobin. It has been shown that the presence of several derivative forms of heme protein in solution increases the deviation of the calculated parameters from the reference data when determining deoxyhemoglobin and, to a lesser extent, oxyhemoglobin. It has been established that the formula for determining the content of methemoglobin has an error of 79.0%, provided that only this form is present in the simulated solution.

Ключевые слова: гемоглобин; оксигемоглобин; дезоксигемоглобин; метгемоглобин; эталонные спектры поглощения; концентрация гемоглобина

Keywords: hemoglobin; oxyhemoglobin; deoxyhemoglobin; methemoglobin; reference absorption spectra; hemoglobin concentration

Введение

Гемоглобин — это хромопротеид, находящийся в эритроцитах крови, который является переносчиком кислорода в организме. Этот белок играет ключевую роль в процессе дыхания, обеспечивая поступление кислорода из легких в ткани и удаление углекислого газа из тканей [7].

Гемоглобин имеет несколько лигандных форм. Оксигемоглобин — это форма гемоглобина, связанная с кислородом, образующаяся в легких при оксигенации [2]. Положение макcимумов полоc поглощения оксигемоглобина опpеделяетcя cоcтоянием электpонныx оpбиталей поpфиpиновыx колец. В cпектpаx поглощения в видимой облаcти молекула HbO₂ имеет xаpактеpные тpи наиболее интенcивные полоcы c макcимумами на λ ~ 413 нм (полоcа Cоpе, иначе — γ-полоса), на λ ~ 542 нм (β-полоcа) и на λ ~ 577 нм (α-полоcа) [4]. Дезоксигемоглобин — это форма белка, которая не связана с кислородом и образуется в тканях, где гемоглобин отдает кислород. Наиболее характерные интенсивные полосы с максимумами поглощения в видимой части спектра у дезоксигемоглобина – λ ~ 555 нм, полоса Соре λ ~ 430 нм, β-полоcа отсутствует [10]. Метгемоглобин является продуктом окисления Fe²⁺ в составе гема до Fe³⁺, при этом белок теряет способность связывать и транспортировать кислород. В организме человека постоянно появляются возможности для эндогенного окисления железа гема c образованием MtHb, основной причиной окисления является сам кислород [2]. Характерный максимум поглощения для метгемоглобина λ ~630 нм [1]. В эритроцитах гемоглобин может пребывать в различных формах, переходящих друг в друга. Соотношение этих форм определяется индивидуальными особенностями организма и может изменяться в зависимости от различных факторов [9].

Одним из ключевых методов в рамках клинических исследований является анализ крови, в ходе которого, также проводится измерение концентрации гемоглобина.

В медицинской практике наиболее часто используются колориметрические методы количественного определения уровня гемоглобина, а именно унифицированный гемиглобинцианидный метод, разработанный в 1963 году. Он заключается в том, что все формы гемоглобина в крови окисляются до метгемоглобина, из которого образуется гемиглобинцианид под действием цианид-ионов, и далее производится измерение концентрации с помощью колориметра. Более безопасным считается гемихромный метод, в ходе которого все формы гемоглобина переводятся в одну — гемихром и проводят дальнейшее измерение концентрации на фотометре [6].

Существуют и более современные методики неинвазивного определения содержание гемоглобина, в которых спектральные измерения проводятся в изобестических точках. Данные методы направлены на оценку общей концентрации гемоглобина [4].

Недостатком всех вышеперечисленных методов является то, что с их помощью нельзя оценить содержание той или иной лигандной формы гембелка. Это может приводить к тому, что отклонение содержания в крови от нормы какой-либо формы белка может остаться незамеченным и являться причиной неверной или несвоевременной постановки диагноза.

Для решения данной проблемы были получены формулы, позволяющие на основе данных, полученных при колориметрии, рассчитать количество окси- дезокси- и метгемоглобина.

Исходя из вышеизложенного, в настоящей работе исследуются приведенные в литературе формулы определения основных форм гемоглобина в части оценки их погрешности в моделируемых гемолизатах с разным содержанием этих форм. Также предложен метод нахождения концентрации основных форм гемоглобина путем сопоставления суммы эталонных спектров поглощения этих лигандных форм к спектрам поглощения гемоглобина, полученным в эксперименте с помощью численных методов анализа. В качестве целевой функции выступает сумма наименьших квадратов (метод наименьших квадратов).

Материалы и методы

Методологической основой настоящей работы являлось математическое моделирование.

Рисунок 1. Миллимолярные эталонные спектры поглощения окси-, дезокси- и метгемоглобина

Благодаря эталонным данным поглощения были смоделированы растворы гемоглобинов в различном соотношении, как если бы в смеси находились только они. Базисом моделирования растворов являлся закон аддитивности: «Оптическая плотность смеси при определенной волне равна сумме оптических плотностей каждого из веществ присутствующих в ней».

Рисунок 2. Миллимолярные спектры поглощения окси-, дезокси- и метгемоглобина в разном соотношении лигандных форм

Основываясь на полученных молярных спектрах поглощения гемоглобинов, производилась проверка точности следующих формул, представленных в литературе [6].

 ,                    (1)

   ,                     (2)

   ,                  (3)

где [HbO₂], [Hb] и [MtHb] — концентрации (моль/л) окси-, дезокси- и метформ гемоглобина, A₅₇₇, A₅₆₉, A₅₀₀ — значения поглощения при длинах волн 577, 569 и 500 нм.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования на основе эталонных молярных спектров поглощения произведено моделирование растворов с разным соотношением в нем окси-, дезокси- и метгемоглобина.

На основе полученных данных молярного поглощения основных форм гемоглобинов с помощью их эталонных спектров были проверены представленные в литературе формулы (1), (2) и (3) на предмет границ их использования.

Таблица 1.

Результаты проверки формулы (1) для определения концентрации оксигемоглобина

Таблица 2.

Результаты проверки формулы (2) для определения концентрации дезоксигемоглобина

Таблица 3.

Результаты проверки формулы (3) для определения концентрации метгемоглобина

Заключение

В результате проверки формулы для определения концентрации HbO₂(5), показано, что наименьшая погрешность содержания оксигемоглобина (7,4%) наблюдается при соотношении оксигемоглобина к дезоксигемоглобину 1,00:0,00, то есть, когда в моделируемом растворе находится исключительно HbO₂. При увеличении соотношения дезоксигемоглобина в модели погрешность становится равной 8,0%, завышая показания содержания HbO₂.

Установлено, что формула (2) для определения концентрации дезоксигемоглобина при соотношении HbO₂:Hb 0,00:1,00 обладает погрешностью с отклонением 15,2%. По мере увеличения соотношения оксигемоглобина в моделируемом растворе отмечается рост погрешности до 20% при HbO₂:Hb 0,75:0,25. Данная формула завышает показания содержания дезоксигемоглобина.

При определении концентрации по формуле (3) для метгемоглобина погрешность составила 79,2% при условии, что в моделируемом растворе находится только MtHb. В смеси с соотношением HbO₂:Hb:MtHb 0,333:0,333:0,333 отклонение составило 79,0%. В случае нахождения в растворе 3,0% MtHb (что является нормой для здорового человека), погрешность составляет 80,0%. Во всех приведенных случаях, формула занижала реальное содержание метгемоглобина в моделируемом растворе.

Из представленных данных следует, что наименьшей погрешностью обладает формула (1) для определения оксигемоглобина, повышение в смеси дезоксигемоглобина не меняет величину отклонения, следовательно ее применение возможно при допущении завышения показателей содержания на 8,0%.

Список литературы:

1. Метгемоглобинемии / С. М. Бахрамов и др. // Дневник Казанской медицинской школы. — 2015. — №. 3. — С. 56–62.
2. Герман С.В. Метгемоглобинемии: особенности патогенеза и клиники // Клиническая медицина. — 1999. — Т. 77, № 4. — С. 9-12.
3. Кривенцев Ю. А. Гемоглобины человека / Ю. А. Кривенцев, Р. А. Бисалиева, А. И. Носков // Вестник Астраханского государственного технического университета. — 2007. — №. 6. — С. 34–41.
4. Лаврик Н. Л. Влияние лизиса эритроцитов некоторых животных на спектры поглощения оксигемоглобина / Н. Л. Лаврик, Т. Н. Ильичёва // Биофизика. — 2018. — Т. 63, №. 5. — С. 903–912.
5. Лысенко С. А. Метод неинвазивного определения содержания гемоглобина в биологических тканях / С. А.Лысенко, М. М. Кугейко // Журнал прикладной спектроскопии. — 2012. — Т. 79, №. 4. — С. 651–657.
6. Никулина Н. С., Калинина Е. Н. Метрологическая оценка методик контроля качества эритроцитсодержащих компонентов крови //Сибирский научный медицинский журнал. – 2019. – Т. 39. – №. 1. – С. 136-141.
7. Стусь Л. К. Осцилляция форм гемоглобина в процессе хранения крови / Л. К. Стусь, Е. Д. Розанова // Биофизика. — 1992. — Т. 37, № 2. — С. 387–388.
8. Проссер Л., Браун Ф. Сравнительная физиология животных, пер. с англ., М., 1967, с. 238–79.
9. Alan N. Schechter. Hemoglobin research and the origins of molecular medicine // Molecular Medicine Branch Blood. — 2008. — V. 112, N 10. — P. 3927–3938.
10. Functional brain mapping by blood oxygenation level-dependent contrast magnetic resonance imaging. A comparison of signal characteristics with a biophysical model / Ogawa S. et al. // Biophysical journal. — 1993. — Т. 64, N 3. — P. 803–812.