АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНА BADH, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА Amaranthaceae С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

АННОТАЦИЯ

Галофитные растения устойчивы к засолению, поскольку они способны поглощать воду, поддерживая высокий осмотический потенциал за счет накопления неорганических ионов. В данном исследовании был разработан дизайн праймеров для амплификации гена BADH, полученного из растений семейства Amaranthaceae с использованием биоинформатических программ. С помощью полимеразной цепной реакции был получен ампликон из растения Atriplex pratovii длиной около 3000 пар нуклеотидов.

ABSTRACT

Halophytic plants are tolerant to salinity because they are able to absorb water, maintaining a high osmotic potential due to the accumulation of inorganic ions. In this study, the design of primers for the BADH gene was developed using a bioinformatics program. Using polymerase chain reaction, an amplicon of about 3000 base pairs in length was obtained from the plant Atriplex pratovii.

Ключевые слова: Галофит, BADH, Atriplex pratovii, праймер, ПЦР, cолустойчивые растения

Keywords: Halophyt, BADH, Atriplex pratovii, primer, PCR, salt tolerant plants

Глицин-бетаин (ГБ), четвертичное аммониевое соединение, является одним из наиболее важных осмолитов, присутствующих в высших растениях, и играет решающую роль в осмотической регулировке и защите активности ферментов от холода, тепла и солевого стресса [1].

Одной из основных стратегических подходов адаптации растений к солевому стрессу является аккумуляция бетаина. Ген BADH играет ключевую роль в этом процессе, обеспечивая преобразование бетаинальдегида в бетаин. Исследования показали, что у растений с повышенной экспрессией гена BADH наблюдается выраженная устойчивость к солевому стрессу. Это свидетельствует о важности этого гена в адаптации растений к экстремальным условиям окружающей среды. Кроме того, BADH может быть основным фактором в повышении урожайности в условиях солевого стресса. Генноинженерное введение гена BADH в культурные растения может способствовать созданию новых сортов с более высокой устойчивостью к соли, что имеет огромное значение для сельского хозяйства в условиях изменяющегося климата и деградации почв. Было обнаружено, что растения с природными механизмами выносливости и лучшей солеустойчивостью накапливают большее количество ГБ [2].

В частности, у высших растений последняя стадия синтеза ГБ катализируется бетаин-альдегиддегидрогеназой (BADH), которая может защищать растения от вредного воздействия изменений температуры, солености и растворенного кислорода [3]. На сегодняшний день гены BADH выделены из нескольких видов, в том числе из Spinacia oleracea L., Beta vulgaris L., Oryza sativa L., Hordeum vulgare L. и Arabidopsis thaliana.

Ген BADH представляет собой важный объект исследований в области агрономии и молекулярной биологии, и изучение его функции может привести к разработке более устойчивых к стрессу от соли культурных растений, что в свою очередь способствует обеспечению продовольственной безопасности и устойчивости экосистемы. В этом исследовании мы сообщаем о дизайне праймеров и клонирования гена BADH из растений семейства Amaranthaceae (прежнее название Chenopodiaceae).

Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовали биоматериалы растений Atriplex pratovii, Atriplex tatrica, Climocoptera aralensis, Halocnemum strobilacium и Haloxylon aphyllum, принадлежащих к семейству Amaranthaceae и собранных с Южного Аралкума в 2021 г. Растительные материалы идентифицированы сотрудниками Института ботаники Академии наук Республики Узбекистан. Тотальная ДНК из листьев растений была выделена с использованием набора PureLink Plant Total DNA Purification Kit (Invitrogen by Thermo Fisher Scientific).

Дизайн праймеров. Для проведения амплификации гена BADH из растений семейства Amaranthaceae был проведен поиск нуклеотидной последовательности гена BADH в базе данных NCBI (NCBI-www.ncbi.nlm.nih.gov). Биоинформационным методом был проведен поиск мРНК гена BADH, видов принадлежащих к семейству Amaranthaceae. В результате были обнаружены мРНК 10 видов Atriplex; Atriplex triangularis (ID:AY256971.1), Atriplex prostrata (ID:AY083902.1), Atriplex centralasiatica (ID:AY093682.1), Atriplex micrantha (ID:EF208902.1), Atriplex semibaccata (ID:KC785454.1) Atriplex tatarica (ID:EF541130.1), Atriplex amnicola (ID:KC785455.1), Atriplex canescens (ID:JF776157.1), Atriplex nummularia (ID:KC785453.1), Atriplex hortensis (ID:DQ497233.1) в базе данных NCBI, проведен дизайн специальных праймеров для амплификации приблизительно 3000 пар нуклеотидных последовательностей в программе CLUSTAL O (1.2.4) Multiple Sequence Alignment (см. табл. 1).

Таблица 1.

Олигонуклеотидная последовательность праймеров для амплификации гена BADH, полученного из некоторых видов растений семейства Amaranthaceae

Полимеразная цепная реакция

Амплификацию участков гена BADH исследуемых галофитных растений проводили в амплификаторе MiniAmp™ Plus Thermal Cycler (Applied BioSystems, США) с помощью специальных праймеров.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) гена BADH проводили по протаколом из набора Phusion^TM  High–Fidelty DNA Polymerase (Thermofisher SCIENTIFIC, USA). Для амплификации гена BADH термоциклированние ПЦР проводили при следующих условиях: первичная денатурация 1 минута при 98°С, 1 цикл; денатурация 30 секунд при 98°С, отжиг 35 секунд при 56, 57, 58°С; элонгация 72°С, 1,5 минуты. Этапы повторялись последовательно в 35 циклах; заключительная стадия элонгации проводилась 10 минут при 72°С.

Для количественного определения нуклеотидов в продуктах ПЦР проводили электрофорез в 2% агарозном геле. Длину продуктов ПЦР определяли с помощью ДНК-маркера 100bp и 50 bp DNA Ladder (Invitrogen, USA) (рис. 1).

Рисунок 1. Электрофореграмма ПЦР продукта гена BADH M - DNA marker;

 1. Atriplex pratovii, 2. Atriplex tatrica, 3. Climocoptera aralensis, 4. Halocnemum strobilacium 5. Haloxylon aphyllum

Результаты и обсуждение. По результатам исследования установлено, что в ПЦР продуктах растений содержатся 3000 (Atriplex pratovii), 3200 (Atriplex tatrica), (в Climocoptera aralensis реакция не состоялась), 3000 (Halocnemum strobilacium), 1500 (Haloxylon aphyllum) пар нуклеотидов (рис. 1). Применяли метод ПЦР на разных отжигах и получены разные конечные продукты. Нами  обращено внимание на то, что результаты амплификации гена BADH со специальным дизайном соответствуют нуклеотидной последовательности из 3000 (Atriplex pratovii) пар оснований. Дальнейшее секвенирование решили проводить полученными ПЦР продуктами из растения Atriplex pratovii.

Заключение. Выделены фрагменты ДНК из растений семейства Amaranthaceae, распространенных в Южном Аралкуме. Используя биоинформатические программы проведен дизайн специальных праймеров. Ген BADH был получен методом ПЦР из ДНК растений Atriplex pratovii, Atriplex tatrica, Climocoptera aralensis, Halocnemum strobilacium и Haloxylon aphyllum. Установлено, что ПЦР продукты, полученные из Atriplex pratovii, оказались приемлемыми для секвенирования последовательностей пар нуклеотидов. Согласно данным результатам, имеется перспективная возможность глубокого анализа и изучения функциональности гена BADH растения Atriplex pratovii.

Список литературы:

1. Chen T, Murata N // Glycine betaine: an effective protectant against abiotic stress in plants // (2008) Trends Plant Sci 13(9):499–505
2. Wu G, Zhou Z, Chen P, Tang X, Shao H, Wang H  // Comparative ecophysiological study of salt stress for wild and cultivated soybean species from the yellow river delta China // (2014) The Scientific World J 2014:651745
3. Hong D, Yu T, Hongyue Z, Xianyu M, Xing Z, Zhenhua W  // Enhanced salinity tolerance in transgenic maize plants expressing a BADH gene from atriplex micrantha // (2015) Euphytica 206:775–783
4. Arakawa K, Katayama M, Takabe T // Levels of betaine and betaine aldehyde dehydrogenase activity in the green leaves, and etiolated leaves and roots of barley // (1990) Plant Cell Physiol 31:797–803