АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ СЕРИЦИНА И ФИБРОИНА ШЕЛКА

АННОТАЦИЯ

В статье рссматривается анализ кристаллической и аморфной структуры белков шелка серицина и фиброина методом рентгенофазного анализа. Исследования проводились на порошках серицина и фиброина полученных из коконов тутового шелкопряда. Анализ полученных дифрактограмм серицина и фиброина показало, что в серицине степень кристалличности составляет 26,83%, а в фиброине 68,33%. Исходя из результатов исследования можно констатировать что, для серицина характерно аморфная, а для фиброина кристаллическая структура.

ABSTRACT

The article examines the analysis of the crystalline and amorphous structure of the silk proteins sericin and fibroin by X-ray phase analysis. Research was carried out on sericin and fibroin powders obtained from silkworm cocoons. Analysis of the obtained diffraction patterns of sericin and fibroin showed that in sericin the degree of crystallinity is 26.83%, and in fibroin 68.33%. Based on the results of the study, it can be stated that sericin is characterized by an amorphous structure, while fibroin is characterized by a crystalline structure.

Ключевые слова: шелк, серицин, фиброин, рентгенофазовый анализ, аморфная структура, кристаллическая структура.

Keywords: silk, sericin, fibroin, X-ray phase analysis, amorphous structure, crystalline structure.

Шелковая нить, выделяемое тутовым шелкопрядом представляет собой волокно животного происхождения, состоящее в основном из белков фиброина и серицина[1]. Основные белки шелка Bombyx mori серицин и фиброин привлекает внимание многих исследователей в области химии природных соединений, биохимии, химии высокомолекулярных соединений, биоматериалов и т.д. Исследование применение фиброина шелка в области биоматериалов является одной из актуальных задач, поскольку они обладают рядом превосходных свойств, таких как высокая прочность, высокая ударная вязкость и отличная биосовместимость [2]. Эти превосходные свойства обусловлены структурой фиброина шелка, и поэтому структурный анализ является ключом к дальнейшему развитию шелка в более широком применении. В целом шелковое волокно полученное из кокона Bombyx mori представляет собой двойное волокно, состоящее из белков серицина и фиброина. Фиброин шелка состоит из двух цепей: тяжелой и легкой. Молекулярная масса тяжелой цепи составляет 390 кДа и легкой цепи 26 кДа. Тяжелая и легкая цепь фиброина соединены дисульфидной связью и гликопротеином молекулярная масса которого составляет 30 кДа [3,4]. Исследования показывают, что тяжёлая и легкая цепи, а также гликопротеин P25 в соотношении 6:6:1 образуют ассамблею [5]. Аминокислотный состав тяжёлой-цепи в основном состоит из глицина (46%), аланина (30%), серина (12%), тирозина (5,3%), валина (1,8%) и др. [6]. Целью нашего исследования является изучении степени кристалличности белков шелка серицина и фиброина выделенных из кокона шелкопряда Bombyx mori выращенного в Ферганской области Республики Узбекистан.

Материалы и методы. Кокон тутового шелкопряда Bombyx mori вынимали из червя и промывали в дистиллированной воде. Взвешивали на аналитических весах 10 г чистого кокона, промытого в дистиллированной воде и полученную пробу поместили в термостойкую плоскодонную колбу. В колбу добавляли 500 мл бидистиллированной воды и 1,260 г соды, хорошо перемешивая колбу поместили на водяную баню на 40 минут. При кипячении кокон начинает набухаться, то есть кокон впитывает в себя воду. Постепенно серицин из кокона начинает отделяться воду, а фиброин скапливается в верхней части водной среды. Через 40 минут снимали колбу с водяной бани и медленно отфильтровали раствор серицина. Фиброин остается на фильтровальной бумаге. Промывали фиброин в 3,6 л дистиллированной воды. После промывки фиброин снова кипятили в 500 мл бидистиллированной воды на водяной бане в течение 30 минут. Через 30 минут снимали колбу с водяной бани, отфильтровывали фиброин на фильтровальной бумаге. Снова промывали в 3,6 л дистиллированной воды и ту же процедуру повторяли 3 раза [7-10].

Приготовление порошка серицина. Поскольку объем полученного нами белка серицина составляет более 500 мл, мы использовывали роторный испаритель для перегонки воды. Раствор серицина перегоняли под вакуумом до объёма 50 мл. Оставшийся в колбе серицин вращали внутри холодильника МК 70, белок серицина прилипает к стенкам колбы и начинает замерзать. Высушивывали замороженный серицин в лиофильной сушилке в течение 1 часа 50 минут. После этого колбу извлекали из лиофильной сушилки и осторожно соскребали высушенный серицин со стенок колбы. Взвешивали собранный белок на аналитических весах. Получили 1,46 г порошка серицина[9].

Выбор растворителя для фиброина. Помещали 6 г белка фиброина в термостойкую колбу и заливали ее 111 г раствором хлорида кальция в воде. К приготовленной смеси вливали 136 мл дистиллированной воды и 97 мл 96%-ного раствора этанола и хорошо перемешивали. Фиброин начинает медленно растворяться в растворе.

Приготовление порошка фиброина. Очищенный раствор фиброина [9] перегоняли на роторном испарителе под вакуумом до полного удаления растворителя. Через 30 минут помещали колбу с фиброином в жидкий азот и медленно охлаждали колбу. После вращения колбы белок фиброин прилипает к стенкам колбы и начинает замерзать. Замороженный фиброин сушили в лиофильной сушилке в течение 1 часа 50 минут. После этого извлекали колбу из лиофильной сушилки и аккуратно соскребали высохший фиброин со стенок колбы, взвешивали собранный белок, получили 4,06 г порошка фиброина [9]. Процесс получения фиброина из шелка приведена в рис 1.     

Рентгенофазовый анализ серицина и фиброина проводили на рентгеновском дифрактометре XRD-6100 Shimadzu (λ=1,540598 Å, Cu-Ka1). Полученные дифрактограммы анализировали в программе Match!3 (вспомогательная программа Treor 90).

Рисунок 1. Схематическое изображение получения порошка фиброина шелка

Обсуждение результатов. Рентгенофазовым анализом исследованы аморфная и кристаллическая структура серицина. Кристаллические структуры заставляют падающие рентгеновские лучи дифрагировать во многих направлениях. Анализируя дифрактограмму сероцина, установлено, что степень его кристалличности составляет 26,83%, а степень аморфности равна 73,17% (рис.2). По результатам анализа размеры единичной кристаллической решетки, образующей кристаллическую часть, составляют Å a=8,59688, Å b=8,59688, Å c=10,0628 Å, (a=90˚, b=90˚, g=90˚) и форма кристаллической решетки была определена как тетрагональная. Эти показатели согласуются с результатами, представленными в литературе. Но было замечено, что имеются некоторые различия в длинах сторон кристаллической решетки. В результате расчетов размер кристаллической решетки определен равным 743,7 Å3 [11-12].

Также была проанализирована дифрактограмма фиброина и установлено, что степень его кристалличности составляет 68,33%, а степень аморфности равна 31,67% (рис.3). По результатам анализа размеры единичной кристаллической решетки, образующей кристаллическую часть, составляют Å a=13,8693, Å b=6,5702, Å c =10,74 Å, (a=90˚, b=92,38899˚, g=90˚) и форма кристаллической решетки была определена как моноклинная. Эти показатели согласуются с результатами, представленными в литературе. Было замечено, что имеются различия в длине сторон. В результате расчетов размер кристаллической решетки определен равным 1125,9 Å3 [11-12].

Рисунок 2. Анализ дифрактограммы серицина

Рисунок 3. Анализ дифрактограммы фиброина

Выводы. Методом рентгенофазового анализа изучено аморфная и кристаллическая структура серицина и фиброина. В результате исследований установлено, что степень кристалличности серицина составляет 26,83%, а степень аморфности равна 73,17%. Степень кристалличности фиброина составляет 68,33%, а степень аморфности равна 31,67%. В молекуле серицина преобладет аморфная структура, а в молекуле фиброина кристаллическая структура. Соотношение аморфной и кристаллической структуры в серицине составляет 2,73:1, а в фиброине соотношение кристаллической и аморфной структуры 2,18:1. Преобладание кристаллической структуры в фиброине обусловливает более широкое применение фиброина.

Список литературы:

1. Kushal Sen, Murugesh Babu K. Studies n Indian silk. Indian silk. I. Macrocharacterization and analysis of amino acid composition. J Appl Polym Sci. 2004. 92.рр. 1080–1097.
2. Asakura, T. Structure of Silk I (Bombyx mori Silk Fibroin before Spinning) -Type II β-Turn, Not α-Helix-. Molecules. 2021. 26. 3706.
3. Takei, F.; Kikuchi, Y.; Kikuchi, A.; Mizuno, S.; Shimura, K. Further evidence for importance of the subunit combination of silk fibroin in its efficient secretion from the posterior silk gland cells. J. Cell Biol. 1987, 105. рр. 175–180.
4. Tanaka, K.; Kajiyama, N.; Ishikura, K.; Waga, S.; Kikuchi, A.; Ohtomo, K.; Takagi, T.; Mizuno, S. Determination of the site of disulfide linkage between heavy and light chains of silk fibroin produced by Bombyx mori. Biochim. Biophys. Acta Protein Struct. Mol. Enzymol. 1999. 1432.рр. 92–103.
5. Inoue, S.; Tanaka, K.; Arisaka, F.; Kimura, S.; Ohtomo, K.; Mizuno, S. Silk Fibroin of Bombyx mori is Secreted, Assembling a High Molecular Mass Elementary Unit Consisting of H-chain, L-chain, and P25, with a 6:6:1 Molar Ratio. J. Biol. Chem. 2000. 275. рр.40517–40528.
6. Zhou, C.-Z.; Confalonieri, F.; Medina, N.; Zivanovic, Y.; Esnault, C.; Yang, T.; Jacquet, M.; Janin, J.; Duguet, M.; Perasso, R.; Li Z.G. Fine organization of Bombyx mori fibroin heavy chain gene. Nucleic Acids Res. 2000. 28. рр.2413–2419.
7. Сафонова Л.А., Боброва М.М., Агапова О.И., Котлярова М.С., Архипова А.Ю., Мойсенович М.М., Агапов И.И. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка. СТМ ∫. 2015. том 7. №3. С.6-13.
8. Feng Y, Lin J, Niu L, Wang Y, Cheng Z, Sun X, Li M. High Molecular Weight Silk Fibroin Prepared by Papain Degumming. Polymers. 2020. 12(9). рр. 2105.
9. Xiao Sh., Wang Z., Ma H., Yang H., Xua W. Effective removal of dyes from aqueous solution using ultrafine silk fibroin powder. Advanced Powder Technology. 2013. 25(2). рр.574-581.
10. Карабаева Р.Б., Ибрагимов А.А., Назаров О.М. Определение содержания химических элементов и аминокислот в Prunus persica var.nectarina // Universum: химия и биология : электрон. научн. журн. 2020. № 9(75). С.15-18.
11. Klug, Harold P.; Alexander, Leroy E. (1954). X-ray diffraction Procedures for polycrystalline and amorphous materials (2nd ed.). Canada: John Wiley & Sons, Inc. p. 122. ISBN 978-0-471-49369-3.
12. B. E. Warren (1969/1990) X-ray diffraction (Addison–Wesley, Reading MA/Dover, Mineola NY). p.381. ISBN 0-486-66317-5.