ОСОБЕННОСТИ РАЗДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ФЛАВОНОИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

АННОТАЦИЯ

Исследовано хроматографическое удерживание некоторых производных флавоноидов в условиях обращено-фазового варианта ВЭЖХ. Определены факторы удерживания при различных составах элюента (CH₃OH, фосфатный буфер и H₂O). Исследована взаимосвязь между строением, свойствами и хроматографическим удерживанием некоторых флавоноидов.

ABSTRACT

The chromatographic retention of some flavonoid derivatives was studied under reverse-phase HPLC conditions. Retention factors were determined for different eluent compositions (CH₃OH, phosphate buffer). The relationship between the structure, properties and chromatographic retention of certain flavonoids has been studied.

Ключевые слова: флавоноиды, эллюент, ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография, фактор удерживания, поток элюента, зависимость удерживания от состава элюента.

Keywords: flavonoids, eluent, HPLC, high-performance liquid chromatography, retention factor, eluent flow, dependence of retention on the composition of the eluent.

Введение. Современная аналитическая химия широко воспринимает высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) как важный метод анализа, особенно в контексте изучения флавоноидов. Флавоноиды, представляющие собой разнообразные природные соединения с выраженными биологическими свойствами, имеют широкий спектр применения: от сферы фармацевтики до пищевой промышленности. Тем не менее, для полноценного исследования и выделения требуется точный и эффективный метод хроматографического разделения.

В настоящее время высокоэффективная жидкостная хроматография является одним из наиболее перспективных методов анализа биологически активных веществ, включая изохинолины, что также позволяет выявить связь между их структурой, свойствами и активностью.

В последние годы интерес к флавоноидам, широкому классу природных соединений, значительно возрос в связи с их потенциальными фармакологическими свойствами и ролью в поддержании здоровья. Флавоноиды, которые обладают выраженными антиоксидантными, противовоспалительными и противораковыми характеристиками, привлекают все большее внимание в сферах медицины, фармакологии и пищевой промышленности.

Однако, для более глубокого изучения и применения флавоноидов в различных областях необходимо точное определение их состава и концентрации. Это подталкивает к постоянному совершенствованию методов анализа флавоноидов с целью увеличения их точности, чувствительности и скорости выполнения.

Многие гетероциклические соединения, широко используются в биохимии и медицине в качестве антиоксидантов, ингибиторов, они входят в состав ряда натуральных веществ и лекарств, обладающих антигипертензивным, антибактериальным, противовирусным, противоопухолевым и другими видами фармакологического действия [12].

Интерес к изучению биологически активных соединений, таких как флавоноиды, значительно возрастает с каждым годом. Флавоноиды представляют собой большую группу природных соединений, широко распространенных в растениях, и известных своими антиоксидантными, противовоспалительными и антиканцерогенными свойствами. Одним из ключевых методов исследования флавоноидов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

В данной статье мы обращаем внимание на метод ВЭЖХ как основательное средство анализа флавоноидов. В сравнении с другими методами, ВЭЖХ предоставляет высокую радетельную способность, чувствительность и скорость анализа, что делает его отличным выбором для исследования слоев миксов флавоноидов в растительных и пищевых образцах. При этом уникальные свойства ВЭЖХ позволяют достичь высокой точности и воспроизводимости результатов, что критически важно в области научных исследований и контроля.

Наша работа представляет собой основные принципы и преимущества ВЭЖХ в контексте анализа флавоноидов. Также в данной статье обсуждаются текущие тенденции и инновационные подходы в регионе. Погружение в мир хроматографии флавоноидов методом ВЭЖХ открывает перед читателем перспективные возможности для углубленного исследования этого класса соединений и расширений соответствующих приложений в различных областях науки и промышленности.

В области аналитической химии хроматография играет важную роль в разделении и идентификации химических соединений. Одним из уникальных классов веществ, привлекающих внимание исследователей, являются азотсодержащие гетероциклические соединения. Эти соединения обладают разнообразной биологической активностью и широко используются в фармацевтическом и органическом синтезе. Особенности хроматографического удерживания данных азотсодержащих гетероциклических соединений становятся ключевым аспектом их анализа.

В настоящее время высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) представляет собой метод, обладающий большим потенциалом для надежного изучения закономерностей удержания сложных соединений, которые трудно испаряются и чувствительны к теплу. Этот метод особенно ценен при исследовании биологических объектов, содержащих биологически активные вещества. Среди них флавоноиды, такие как дигидрокверцетин (ДКВ) и дигидрокемпферол (ДКФ), обнаруживают широкий спектр биологической активности, включая антиоксидантные, противоопухолевые, противоаллергические, противовоспалительные, капилляроукрепляющие, гепатопротекторные [2; 5; 7–9] и другие свойства. Оценка содержания флавоноидов в экстрактах лекарственных растений становится ценным источником информации о перспективах использования растительного сырья в фармацевтике.

Изучение хроматографического разделения становится важным шагом в понимании поведения этих соединений в системах разделения. В настоящее время, с ростом интереса к разработке новых лекарственных препаратов и поиску более эффективных методов анализа, понимание особенностей удержания гетероциклических соединений, содержащих гетероатомы в хроматографических системах, является лучевым фактором для достижения точности и действия результатов анализа. В данном исследовании рассмотрены основные аспекты изучения хроматографического удерживания некоторых представителей этого класса соединения и его значение для различных областей научных знаний.

Определению флавоноидов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в научной литературе посвящено огромное количество опубликованных работ. Однако в подавляющем большинстве из них приводятся результаты применения ВЭЖХ при определении состава флавоноидных комплексов природных объектов. И, несмотря на серьезные усилия в определении взаимосвязи между структурой и удерживанием веществ в хроматографии [11], значительных успехов применительно к удерживанию флавоноидов нами в научной литературе не обнаружено. Проблема, по нашему мнению, связана с тем, что попытки связать удерживание сорбатов в случайно выбранной хроматографической системе (т.е. с некоторым типом стационарной фазы и при некотором составе подвижной фазы) с каким бы то ни было параметром сорбата бесперспективны. Применение метода относительного анализа удерживания [1; 10] показывает, что линии трендов для различных веществ на карте разделения определяются двумя ортогональными факторами: положением точки конвергенции (являющейся функцией строения вещества) и наклоном линии тренда (также являющимся функцией строения вещества).

Флавоноиды принадлежат к группе полифенольных соединений растительного происхождения и являются вторичными продуктами метаболизма растений. Однако рассматриваемая категория веществ выделяется среди других вторичных продуктов своим значительным влиянием на ключевые процессы роста и развития растений. Флавоноиды принимают участие в процессах пигментации растений, влияют на окраску цветов, играют важную роль в клеточной сигнализации, действуют как мессенджеры химических сигналов, участвуют в процессах репродукции и влияют на развитие пыльцы, накопление нектара, созревание плодов и семян. Новые исследования предполагают, что флавоноиды могут влиять на экспрессию генов, модулировать активность регуляторных белков и участвовать в регуляции клеточного деления. Однако основную роль флавоноиды играют в защите растений от различных негативных воздействий окружающей среды, таких как ультрафиолетовое излучение, температурные колебания, повышенные концентрации тяжелых металлов, ионизирующее излучение. Они также активно участвуют в защите растений от бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, предотвращая проникновение паразитов и уменьшая повреждения, вызванные насекомыми. Одной из ключевых функций флавоноидов является их способность защищать растения от окислительного стресса благодаря выраженной антиоксидантной активности [6].

Софора лисохвостая произрастает на полях и пастбищах в равнинных районах. Основное различие между софорой толстоплодной и лакрицей заключается в том, что семена софоры толстоплодной светло-коричневые, в два раза мельче и в два с половиной раза светлее, чем семена лакрицы. Растение покрыто мягкими, шелковистыми волосками, прижатыми к поверхности. Стебель прямой и прочный, верхняя часть ветвистая на высоте 30–80 см. Листья длиной 10–12 см состоят из 8–12 пар продолговатых яйцевидных листочков. Цветки собраны в плотные соцветия с верхушечным расширением длиной 5–15 см. Венчик часто опушен и имеет белый цвет. Бобы четко сжатые, длиной 6–8 см, покрыты густыми волосками. Растение произрастает как сорняк на тугайных лугах, в рощах, пустынях с обильными грунтовыми водами, на орошаемых посевах и на пустырях. Обычно встречается в густых, но небольших зарослях, часто в смеси с другими растениями, главным образом в ложбинах и на богатых влажных почвах в долинах рек.

Софора лисохвостая имела большое значение в монгольской и тибетской медицине. Согласно древней тибетской книге, корень софоры способен лечить 404 болезни. В других источниках указывается, что корень софоры рекомендуется для лечения заболеваний сердца, аорты и сосудов. Его также назначают как жаропонижающее средство при повышенной температуре, а также для борьбы с сибирской язвой, дифтерией, ревматизмом, используя его как общеукрепляющее средство для организма. Древние источники также отмечают, что софора может помочь в излечении рака желудка и нервно-психических расстройств (Haidav, 1985) [4].

Флавоноиды широко используются в биохимии и медицине в качестве антиоксидантов, ингибиторов, они входят в состав ряда природных веществ и лекарственных препаратов, обладающих гипотензивным, антибактериальным, противовирусным, противоопухолевым  и другими видами фармакологического действия. Поэтому разработка новых методов синтеза, изучения их состава и свойства является актуальной. В теории жидкостной хроматографии к настоящему времени известно значительное число моделей удерживания, связывающих параметры хроматографической системы с различными электронными и физико-химическими характеристиками сорбатов, такими, как поляризуемость, ван-дер-ваальсов объем или площадь поверхности молекул, фактор гидрофобности, индексы молекулярной связанности, молекулярная масса или температура кипения, и другими [3; 4]. Однако, в такой  сложной многокомпонентной системе, которую представляет собой хроматографическая колонка, заполненная сорбентом, и через которую движется поток элюента с растворенным в нем сорбатом (или смесью сорбатов), учесть все многообразие взаимодействий в условиях жидкостной хроматографии оказывается достаточно проблематично.

Поэтому до настоящего времени не создана универсальная модель удерживания, способная в полной мере описать любую хроматографическую систему.

Флавоноиды представляют собой группу природных химических соединений, которые в основе обнаруживаются в растениях. Они обладают разнообразными биологическими свойствами и широким спектром действия. А фармакология флавоноидов может оказывать различное положительное воздействие на организм человека. Некоторые из основных свойств и действий флавоноидов в фармакологии включают: антиоксидантные, противовоспалительные свойства, антисердечно-сосудистые эффекты, антибактериальные и противовирусные свойства, противораковые эффекты, антитромботические свойства

Флавоноиды можно получить из пищевых источников, таких как фрукты, овощи, чай, вино и подобных им. Положительное воздействие такой пищи на здоровье делает ее центром интереса для исследований и разработки новых фармацевтических препаратов.

Целью нашей работы явилось изучение влияния состава элюента на хроматографическое удерживание некоторых флавоноидов, оптимизации условий анализа рутина и кверцетина с применением ВЭЖХ, а также в количественной оценке их содержания в экстрактах лекарственных растений.

Объектами исследования были выбраны рутин и кверцетин.

Закономерности удерживания флавоноидов, в частности, рутина и кверцитина исследовали в условиях ВЭЖХ.

Экспериментальная часть. Материалы и методы исследования. Эксперимент был выполнен на жидкостном хроматографе “Agilent 1200 Series Rapid Resolution LC System”с УФ детектором. Детектирование проводили при длине волны 254 нм. Сорбентом служил Exlipse  XDB C-18, размер частиц 5 мкм. Размеры хроматографической колонки 4.0x250 мм. Объем подвижной фазы в колонке принимали равным объему удерживания нитрита натрия. В качестве элюентов применяли смесь ацетонитрил – вода с содержанием ацетонитрила от 15 до 40 % (по объему). Для приготовления подвижной фазы использовали дистилированную воду и ацетонитрил. Элюирование проводили в изократическом режиме; объемный расход элюента составлял 400 мкл/мин. Растворы сорбатов (концентрации 10-4 моль/л) готовили растворением индивидуальных образцов в соответствующей подвижной фазе; пробу вводили в количестве 20 мкл. Для изучения влияния природы подвижной фазы на хроматографическое удерживание в качестве элюента применяли смесь ацетонитрила с водой в разных объемных соотношениях (60:40, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15).

Рисунок 1. Хроматограмма смеси флавоноидов (состав элюента: CH₃CN/фосфатный буфер = 30:70)

Рисунок 2. Хроматограмма смеси флавоноидов (состав элюента: CH₃CN/фосфатный буфер = 20:80)

Наилучшей селективностью к исследуемым соединениям обладает система с объемным содержанием органического модификатора (СH₃OH) в элюенте равным 30 %. Экспериментальные данные показали, что при содержании в элюенте 40 % метанол сорбаты быстрее элюируются из колонки, что сопровождается пониженной селективностью такой хроматографической системы к рассматриваемым соединениям.

Увеличение концентрации фосфатного буфера с 70 до 80 % приводит к возрастанию характеристик удерживания и высокой селективностью такой системы к изучаемым соединениям.

При этом были определены оптимальные условия разделения смеси экстрактов флавоноидов: элюент – ацетонитрил: фосфатный буфер = 20:80, скорость подвижной фазы – 1 мл/мин. Детектор УФ, длина волны 220 нм. Хроматограмма смеси, полученной в этих условиях, представлена ​​на рисунках 1 и 2.

На основании полученных результатов можно отметить, что найденные оптимальные условия обеспечивают высокую эффективность (N = 3287; ВЭТТ = 0,03 мм), селективность (α=1,28) и полное разделение (Rs=2,75). Время разделения 18–25 минут.

Нами было выявлено, что при постоянной концентрации ацетонитрила в элюенте удерживание сильно зависит от природы заместителей и от их взаимного расположения.

Обсуждение результатов. Особенности хроматографического поведения флавоноидов гидроксильная и карбонильная группы считаются полярными группами, рост их числа в молекуле должен приводить к росту гидрофильности сорбатов. Но для удерживания флавоноидов в ОФ ВЭЖХ все не так просто. Например, в работе [1], в которой сопоставлено удерживание 34 флавоноидов на стационарной фазе µBondapak C18 в подвижных фазах на основе смесей метанола с водой, подкисленных уксусной кислотой, удерживание 3,3’,4’,7-тетрагидроксофлаванона (фустина) оказалось меньше удерживания дигидроквецетина (ДГК), отличающегося от фустина дополнительной ОН-группой. При этом удаление из ДГК карбонильной группы сказывается в резком уменьшении удерживания получающихся при этом диастереомерных катехинов. В принципе, объяснить такой эффект можно, если предположить относительную лиофильность связанных водородной связью карбоксильной и гидроксильно.

Свойства флавоноидов могут изменяться неодинаково при введении одних и тех же функциональных групп в различные положения каркаса молекулы. Наконец, точечный анализ удерживания любых соединений ненадежен, поскольку часто при смене состава подвижной фазы изменяется порядок элюирования аналитов.

Из изученных соединений менее всего удерживается рутин: при увеличении содержания ацетонитрила в подвижной фазе до 30 об. % время выхода этого соединения совпадает с «мертвым» временем. Установлено, что удерживание соединений возрастает по мере уменьшения содержания ацетонитрила в подвижной фазе. Так, например, рутин практически не удерживается на колонке при содержании ацетонитрила в подвижной фазе более 30 %, а время выхода рутина увеличивается от 1,5 до 2,5 мин. при уменьшении содержания ацетонитрила от 50 % до 25 %. На основании анализа данных по влиянию состава подвижной фазы на удерживание некоторых флавоноидов сделан вывод (табл. 1), что в исследуемой хроматографической системе за приемлемое время анализа (менее 20 мин) возможно разделение следующих смесей флавоноидов: 1) при соотношении в подвижной фазе ацетонитрила и 0,1 %-го водного раствора H₃PO₄ 20:80, рН=4,5: рутин, кверцетин, (время анализа 20 мин); 2) при соотношении в подвижной фазе ацетонитрила и 0,1 %-го водного раствора H₃PO₄ 30:70, рН 4,5: рутин, кверцетин (время анализа 10 мин.

Таблица 1.

Время и факторы удерживания исследованных флавоноидов в различных составах подвижной фазы

По результатам анализа, как видно из таблицы 1, наилучшей селективностью по отношению к изучаемым соединениям обладает система с объемом органического модификатора (CH₃CN) в элюенте, равным 20 %.

Экспериментально показано, что если в элюенте содержится 20 % ацетонитрила, то сорбаты элюируются из колонки медленнее, что приводит к увеличению селективности такой хроматографической системы по отношению к рассматриваемым соединениям. Уменьшение концентрации фосфатного буфера с 80 до 70 % приводит к снижению удерживаемости, высокой селективности изучаемых соединений и их разделения, что хорошо видно по данным хроматограммы, полученным в таблице 1.

Количество ацетонитрила в элюенте и функциональные группы в веществах, а также их взаимное расположение сильно зависят от характера удерживания исследуемых веществ.

Таким образом, ВЭЖХ представляет собой эффективный метод для хроматографического разделения и анализа флавоноидов. Его преимущества в высокой чувствительности, скорости анализа и точности делают его важным инструментом в исследованиях флавоноидов. Дальнейшие исследования в этой области позволят расширить наше понимание структуры и биологической активности различных флавоноидов, что в свою очередь может привести к разработке новых применений в медицине и пищевой промышленности. Исследование влияния структуры сорбатов на хроматографическое удерживание и сорбции некоторых флавоноидов как рутин и кверцитин методом ВЭЖХ на неполярном сорбенте показало, что наиболее выраженное разделение смеси производных азотсодержащих гетероциклов протекает при соотношении компонентов бинарной подвижной фазы ацетонитрил/вода (30/70 % об.).

Заключение

1. Разработан быстрый и весьма воспроизводимый метод определения рутина и кверцетина в метанолных экстрактах лекарственных растений. Этот метод может быть применен для стандартизации препаратов на основе указанных данных о флавоноидах.

2. Исследование сорбции некоторых флавоноидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на неполярном сорбенте показало, что наиболее избирательно этот процесс протекает при соотношении компонентов бинарной подвижной фазы ацетонитрил / фосфатный буфер (30/70 % об.) в изократическом режиме.

3. Исследовано хроматографическое поведение некоторых производных рутина и кверцетина в условиях ВЭЖХ при использовании в качестве элюента смеси вода – фосфатный буфер в различных объемных соотношениях. Изучено влияние условий хроматографирования и структуры сорбатов на хроматографическое удерживание этих соединений.

4. Методом ВЭЖХ установлено присутствие основных некоторых флавоноидных веществ в метанолной фракции Sophóra pachycárpa растительного средства. Установлено количественное содержание в Sophóra pachycárpa рутина, кверцетина.

Список литературы:

1. Дейнека В.И. Экспериментальное обоснование метода относительного анализа удерживания ВЭЖХ // Журнал физической химии. – 2006. – Т. 80. –№ 3. – С. 511–516.
2. Колхир В.К., Тюкавкина Н.А., Быков В.А. Диквертин – новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство // Химический фармакологический журнал. – 1995. – № 9. – С.61–64.
3. Рузиев И. Х., Журакулов Ш. Н. Физико-химические закономерности хроматографического удерживания некоторых производных ряда изохинолина // Научный вестник. СамГУ. – 2019. – №. 5. – С. 117.
4. Рузиев И. Х., Тошматова Р. В. Особенности удерживания некоторых азотсодержащих гетероциклических соединений // Kimyo va tibbiyot: nazariyadan amaliyotgacha. – 2022. – С.227–229.
5. Тарасова Е.А. Практическая фитотерапия. – 1999. – №1. – С. 37–41.
6. Тараховский Ю. С., Ким Ю. А., Абдрасилов Б. С., Музафаров Е. Н. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина. – Пущино: Sуnchrobook, 2013. – 310 c.
7. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Дигидрокверцетин-новая антиоксидантная и биологически активная пищевая добавка // Вопросы питания. – 1997. – № 6. – С. 12–15.
8. Bronner C., Landry Y. Kinetics of the inhibitory effect of flavonoids on histamine secretion from mast cells // Agents Actions. – 1985. – Vol. 16(3-4). – P. 147–151.
9. Chu S.C., Hsieh Y.S., Lin J.Y. Green fabrication of agar-conjugated Fe3O4 magnetic nanoparticles // Journal of Natural Products. – 1992. – Vol. 55(2). – P. 179-183.
10. Héberger, K. Quantitative structure–(chromatographic) retention relationships // Journal of Chromatography A. – 2007. – Vol. 1158. – P. 273–305. 
11. Karpov S.I., Matveeva M.V., Selemenev V.F. Kinetics of the sorption of amino acids by KU-2-8 gel cationite // Russian Journal of physical Chemisnry A. – 2001. – Vol. 75. – No 2. – Pp. 266–271.
12. Kh R.I., Bebitova K.E., Kilicheva D.M. Influence of Chromatography Conditions on the Retention of Some Isoquinoline and Pyramidinone Derivatives // World Bulletin of Management and Law. – 2023. – Vol. 21. – P. 91–93.