ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА Aloe vera НА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА АССОЦИИРОВАННЫХ ЭНДОФИТНЫХ ГРИБОВ

АННОТАЦИЯ

Исследованы антибактериальные свойства эндофитных грибов, ассоциированных с Aloe vera при внесении этанольных экстрактов растения-хозяина в среду культивирования. Установлены изменения культурально-морфологических характеристик культур. Выявлены изменения в уровне накопления биомассы, вторичных метаболитов и их антибактериальных свойств. Предварительно определен качественный состав суммарных экстрактов выделенных эндофитных грибов Aloe vera. Отобранные штаммы перспективны в качестве продуцентов антибиотических соединений против тест-культур S. аureus и P. аeruginosa.

ABSTRACT

The antibacterial properties of endophytic fungi associated with Aloe vera were studied when ethanol extracts of the host plant were added to the cultivation medium. Changes in the cultural and morphological characteristics of crops have been established. Changes in the level of accumulation of biomass, secondary metabolites and their antibacterial properties were revealed. The qualitative composition of the total extracts of the isolated endophytic fungi Aloe vera was preliminarily determined. The selected strains are promising as producers of antibiotic compounds against test cultures of S. aureus and P. aeruginosa.

Ключевые слова: эндофитные грибы, растение-хозяин Aloe vera, антибактериальная активность, качественный состав, S. аureus, P. аeruginosa.

Keywords: endophytic fungi, host plant Aloe vera, antibacterial activity, qualitative composition, S. aureus, P. aeruginosa.

Введение. На сегодняшний день глобальная угроза во всем мире - проблема множественной лекарственной резистентности бактерий, к которой приводит неконтролируемое использование растущего числа разнообразных антибиотиков. Примерами этой проблемы являются устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), устойчивые к ванкомицину энтерококки и энтеробактерии (ESBL), продуцирующие β-лактамазы, устойчивый к беталактамам, аминогликозидам и фторхинолонам - Pseudomonas aeruginosa [1-3]. В зоне большого риска находятся лица с ослабленным иммунитетом, ВИЧ и COVID-19 инфицированные. Во время пандемии частой причиной пневмонии, ассоциированной с искусственной вентиляцией легких, являлась именно P.aeruginosa, способная образовывать биопленки, преодолевающие иммунную систему организма человека. Исследования показали, что 90% бактериальных штаммов устойчивы к препаратам первого выбора, в связи с чем, Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) призвала искать альтернативные антибактериальные средства и их источники [4].

По-прежнему растительные метаболиты остаются наиболее важным источником для открытия новых и потенциальных лекарственных субстанций. Однако, экстракция из растительных источников имеет ряд неудобств - сезонность, влияние климатических условий, наличие посевных площадей. Другим, альтернативным и весьма перспективным неистощимым и возобновляемым источником получения высокоценных биоактивных продуктов, являются эндофитные грибы, бессимптомно обитающие в различных частях всех существующих растений [5-7].

Продукция эндофитами биоактивных метаболитов, схожих с метаболитами растения-хозяина определяет отбор требуемых растений, в частности лекарственных, в качестве источника выделения эндофитов и их вторичных метаболитов, обладающих биологической активностью [8, 9].

Одним из таких уникальных растений является алоэ, пришедшее из Африки и используемое уже более 6000 лет для лечения кожных и гастроэнтерологических заболеваний. Огромное количество физиологически активных соединений, обладающих противовоспалительным, иммуномодулирующим, гипогликемическим, противоопухолевым, антиоксидантным, ранозаживляющим и другими эффектами, обуславливает высокую терапевтическую активность различных препаратов из алоэ [10].

Род Алоэ насчитывает более 400 видов, но лекарственными свойствами обладают лишь 5 из них: Aloe Barbadensis Miller, Aloe Perryi Baker, Aloe Ferox, Aloe Arborescens и Aloe Saponaria. Наибольшее признание и применение получил Aloe Barbadensis Miller или Aloe vera - многолетний суккулент-ксерофит с толстыми мясистыми листьями, накапливающий воду в виде геля и произрастающий на сухой, песчаной почве в жарком климате [11]. Именно такие условия окружающей среды характерны для Узбекистана.

В этой связи, целью нашего исследования явилось, выделение эндофитных грибов, характеристика их антибактериальных свойств, для оценки перспективности применения вторичных метаболитов в качестве основы терапевтических препаратов, а также изучение влияния экстракта растения-хозяина на ассоциированные с Aloe vera эндофитные грибы.

Материалы и методы исследования

Поверхностная стерилизация, подготовка растительных образцов, условия культивирования и хранения. Для эффективного удаления эпифитной микрофлоры применяли оптимизированный способ поверхностной стерилизации, заключающийся в тщательной промывке корней и листьев Aloe vera в проточной воде в течении 15 минут, ополаскиванием деионизированной водой, последовательном выдерживании в 70% этаноле (3 минуты) - 1,5% гипохлорит натрия (3 минуты) - 70% этаноле (30 секунд) и промывкой стерильной водой. Последние промывные воды высевали на питательную среду в чашку Петри для контроля эффективности поверхностной стерилизации [12].

Эндофитные грибы выделяли модифицированным методом, описанным ранее Hazalin et al [13]. Для этого гель из листьев извлекали стерильно и выкладывали тонким слоем в 90 мм чашки Петри на агаризованную питательную среду Чапека-Докса, содержащую антибиотик цефтриаксон в концентрации 250 мг/мл для ингибирования роста бактерий. Подготовленные корни и кожуру листьев асептически разрезали на сегменты не более 5 мм, и слегка вдавливая, также помещали на поверхность питательной среды. Чашки инкубировали при температуре 28⁰C в течении 14-28 суток. Выросшие отдельные колонии субкультурировали на агаризованных косячках Чапека-Докса, не содержащей антибиотика. Морфологию колоний, рост и спорообразование изолятов изучали на картофельно-декстрозной среде. Хранение культур осуществляется в лаборатории «Биохимии и биотехнологии физиологически активных соединений» Института микробиологии Академии наук Узбекистана, при температуре +4°С на агаризованных косячках Чапека-Докса.

Жидкофазная ферментация эндофитных грибов. С целью накопления и извлечения вторичных метаболитов из биомассы эндофитных грибов, штаммы выращивали глубинным методом культивирования в колбах объемом 500 мл, содержащих 250 мл жидкой среды Чапека-Докса, на качалке при 180 об/мин, температуре 28°С в течении 10-12 суток. Биомассу культур сепарировали путем центрифугирования при 6 тыс. об/мин и хранили при - 40°С. Для определения сухого веса биомассу высушивали до постоянного веса при температуре 105⁰С.

Экстракция вторичных метаболитов эндофитных грибов. Для определения биологических активностей экстракцию метаболитов из биомассы эндофитных грибов проводили по Lang et al. с модификациями Hazalin et al. Для этого 5 г замороженной биомассы растирали в ступке со стеклянным песком и 50 мл этилового эфира уксусной кислоты, переносили в коническую колбу и оставляли на сутки на качалке при комнатной температуре для перемешивания. Затем смесь отфильтровывали через бумажный фильтр (ватман бумага №1) и добавляли Na₂SO₄ из расчета 40 мкг/мл для удаления водного слоя. Далее смесь упаривали досуха на роторном испарителе и добавляли 1 мл диметилсульфоксида. Полученный экстракт использовали как маточный раствор и хранили при температуре +4⁰С [14].

Экстракция метаболитов растения-хозяина. Для изучения влияния экстрактов растения-хозяина на ассоциированные с ним эндофитные грибы получали этанольные экстракты растительных веществ путем измельчения листьев и выдерживания их в 96% этаноле в течении 72 часов. Экстракты растений добавляли непосредственно в среду культивирования при посеве изолятов в конечной концентрации 2%.    

Определение антибактериальных свойств экстрактов эндофитных грибов. Антибактериальные свойства экстрактов определяли луночно-диффузионным методом против следующих тест-культур: грамположительных - S. aureus и B. Subtilis, грамотрицательных - E. Coli и P. aeruginosa, а также дрожжи - C. аlbicans. При тестировании экстрактов применяли - мясопептонный агар (производство “HiMedia”, Индия). Для этого чашки Петри с питательной средой засевали суточной суспензией тест-культуры в физиологическом растворе с концентрацией 1,5х10⁸ КОЕ/мл в соответствии со стандартом МакФарланда, подсушивали и вырезали в агаре лунки диаметром 5 мм и закапывали в них по 100 мкл экстракта в трех повторностях. Затем чашки инкубировали при 37⁰С в течение 24-48 часов. В качестве положительного контроля использовали антибиотик цефтриаксон (группа цефалоспоринов III поколения - 30 мкг/диск). В качестве отрицательного – диметилсульфоксид (ДМСО), растворитель для экстрактов вторичных метаболитов эндофитных грибов. Учет полученных результатов заключался в измерении диаметров зон ингибировании роста тест-культур вокруг лунок в мм [15].

Определение качественного состава экстрактов вторичных метаболитов эндофитных грибов. Определение фитохимического состава экстрактов проводили по Prabhavathi R.M. c cотр. [16].

Наличие танинов и фенольных веществ определяли путем добавления к 2 мл полученного экстракта 2-3 капель 1% раствора FeCL₃. В присутствии ионов железа танины дают черно-синий или черно-зеленый цвет, фенолы - фиолетовый.

Наличие сапонинов устанавливали путем растворения 1 мл экстракта в 5 мл горячей воды (60⁰С) с дальнейшим интенсивным встряхиванием в течение 5 минут до образования стойкой пены. Объем пены сохранялся в течении последующих 30 минут.

Наличие терпеноидов определяли путем смешивания 0,5 мл экстракта с 2 мл хлороформа и 3 мл. H₂SO₄ (конц.). Образование между фазами красно-коричневого окрашивания говорило о наличии терпеноидов.

Наличие антрахинонов устанавливали смешиванием 2 мл экстракта с 4 мл гексана и последующим встряхиванием. При этом наблюдалось разделение экстракта на 2 слоя. Верхний слой отделяли, обрабатывали 4 мл разведенного 10% аммиака и определяли окраску нижнего слоя. Фиолетово-розовая окраска говорила о наличии антрахинонов.

 Наличие сердечных гликозидов определяли путем смешивания 1 мл экстракта с 1 мл ледяной уксусной кислоты и последующим добавлением 1 капли 3% хлорида железа в метаноле. Затем добавляли по стенке пробирки H₂SO₄ (конц.) и определяли окраску нижнего слоя. Сине-зеленое окрашивание говорило о наличии сердечных гликозидов. Все эксперименты проводили в 3-х повторностях.

Статистический анализ. Все эксперименты были проведены в 3-х кратной повторности. Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием t-критерий Стьюдента. Значения достоверно отличаются от показателя контрольного варианта при Р<0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании эндофитной микофлоры Aloe vera, нами с применением модифицированных способов поверхностной стерилизации было выделено 16 эндофитных изолятов: 9 - из корней, 7 - из листьев и 8 - из цветков. Необходимо особо отметить, что эндофитные грибы в геле Aloe vera не обнаружены. Некоторые изоляты обладали способностью выделять пигменты различной окраски во внеклеточную среду с 10-14 день культивирования (Рис.1).

Несмотря на то, что эндофитные грибы являются одним из наиболее важных элементов растительных микроэкосистем, все еще мало информации о точных отношениях между эндофитными грибами и растениями-хозяевами. Тот факт, что метаболизм эндофитов может быть связан с растением-хозяином, отмечен рядом сообщений об ослаблении или прекращении производства определенных соединений в эндофитах после нескольких субкультивирований в синтетической среде [17]. Действительно, культивирование эндофита без его хозяина может привести к потере синтеза желаемого продукта, в связи с чем, проблема сохранения и/или повышения продуктивности эндофитов, при культивировании в аксенических условиях, является весьма актуальной. Например, эндофитный гриб Periconia sp., продуцирующий таксол, был выделен из растения Torreya grandifolia. Перенос гриба в полусинтетическую среду привело к постепенному ослаблению выработки таксола до тех пор, пока уровень его продукции не стал минимальным, хотя рост гриба был относительно незатронутым. Продукция таксола полностью возобновилась после введения в культуральную среду растительного экстракта [18].

В этой связи нами было изучено влияние экстракта растения-хозяина Aloe vera на морфолого-культуральные и антибактериальные свойства вторичных метаболитов выделенных эндофитных грибов.

Рисунок 1. Изоляты эндофитных грибов Aloe vera

В результате культивирования эндофитных грибов в присутствии экстракта Aloe vera у более 30% культур наблюдалось изменение, как пигментации мицелия, так и морфологии колоний. Так, например, изоляты AV5L, AV6L и AV7L потеряли пигментацию при добавлении экстракта растения-хозяина, тогда как AV2K наоборот, проявил повышенную пигментацию. У изолята AV7K наблюдалось полное изменение окраски биомассы с желтой на розовую. При этом потеря пигментации сопровождалась уменьшением размеров колоний. В то же время у некоторых изолятов, как например у AV6K наоборот наблюдалось укрупнение размеров колоний. (Рис.2).

Рисунок 2. Рост изолятов эндофитных грибов на жидкой среде Чапека-Докса без добавления (-) и в присутствии (+) экстракта растения-хозяина

Следует отметить, что влияние растительных экстрактов на эндофиты было установлено в работе Zhao X.M. с сотр., где при выращивании эндофитного гриба Colletotrichum gloeosporioides ES026, выделенного из Huperzia serrata, продуцирующего ингибитор ацетилхолинэстеразы гуперцин А, в 7-м пассаже происходило снижение роста и содержания алкалоида, а в 9-м пассаже мицелий превращался из белого в желтый, выход мицелия и содержание гуперцина А были значительно ниже исходного значения. Чтобы преодолеть эту проблему, клетки сначала выращивали в экстракте растения-хозяина, а затем в базовых или обогащенных средах. Эта стратегия помогала поддерживать жизнеспособность грибов и стабильность продукции алкалоида на исходном уровне в течении 3 лет [19].

Добавление экстракта растения-хозяина также неоднозначно отразилось и на накоплении вторичных метаболитов. В целом у половины всех исследованных изолятов при внесении экстракта растения-хозяина увеличился выход вторичных метаболитов в сухом экстракте на 30-40% (Рис.3). Интересно отметить, что большинство изолятов, ярко отозвавшихся на внесение экстракта, выделены из корня Aloe vera. Так у изолятов корней AV1R, AV2R и AV1R - в 3 раза, а у изолятов AV8R из корня, AV1L и AV1L из листьев и AV6F из цветков - в 2 раза, увеличился выход вторичных метаболитов.

Рисунок 3. Выход вторичных метаболитов изолятов эндофитных грибов без добавления и в присутствии экстракта растения-хозяина

С целью определения антибактериальных свойств выделенных эндофитных изолятов, проведен скрининг против тест-культур: S. аureus, B. subtilis, E. coli, P. аeruginosa и C. albicans суммарных этилацетатных экстрактов, полученных из биомассы культур, выращенных методом жидкофазной ферментации без добавления и в присутствии экстракта растения-хозяина. Активность культур оценивали по зоне подавления роста условных патогенов (Рис.4).

Как видно из представленных данных, в результате культивирования ассоциированных с Aloe vera эндофитных грибов в присутствии экстракта растения-хозяина, большинство изолятов отозвались увеличением антибактериальной активности на 10-20%. В целом эндофитные изоляты, выделенные из листьев, обладают почти в 1,5 раза большей антибактериальной активностью, чем изоляты корня ко всем исследованным тест-культурам. В это же время, у изолятов лиcтьев АV1L, АV4L, АV6L, АV7L и корней АV1R, АV2R, АV6R, АV7R обнаружено увеличение антибактериальной активности на 30-40% как минимум по отношению к одной тест-культуре. При этом большинство экстрактов изолятов листьев угнетали рост P. аeruginosa, а корней - S. аureus. У большинства изолятов цветков обнаружена невысокая антибактериальная активность, кроме АV4F, проявившего активность одновременно против P. аeruginosa и S. аureus.

Наиболее высокой активностью против P.aeruginosa при внесении экстракта растения-хозяина отозвались 3 изолята листьев - АV4L, АV6L, АV7L, подавив рост тест-культуры на 42-47 мм. Отдельно хочется отметить следующие изоляты: АV3L, изначально обладающей высокой активностью против P.aeruginosa; АV1L, подавляющий S. аureus в 2 раза лучше при внесении экстракта Aloe vera; АV1R, увеличивший активность против E. coli, и C. albicans в 2 раза при внесении экстракта растения – хозяина.

Рисунок 4. Зоны подавления роста тест-культур экстрактами вторичных метаболитов изолятов эндофитных грибов Aloe vera, выделенными из листьев (А), корней (Б) и цветов (В)

Таким образом, эндофитные грибные изоляты ассоциированные с листьями Aloe vera, обладают сравнительно высокой антибактериальной активностью и хорошо отзываются ее увеличением при внесении экстракта растения – хозяина.

Вторичные метаболиты эндофитных грибов имеют широкий спектр разнообразия, и обычно группируют по фитохимической принадлежности, включающей алкалоиды, фенолы, танины, стероиды, терпеноиды, лактоны, изокумарины, хиноны, фенилпропаноиды и др [20]. С целью установления класса антибактериальных соединений, продуцируемых изолятами Aloe vera, нами проведен предварительный анализ состава этилацетатных экстрактов выделенных эндофитных грибов.

В результате проведения ряда качественных реакций уставновлено, что танины и фенолы присутсвуют в изолятах всех органов растения – корнях, листьях, цветках. При этом в изолятах корней также обнаружены флавоноиды, цветков – терпеноиды, листьев сапонины и алкалоиды. Так, например, изоляты АV1L и АV6R, обладающие активностью против S. аureus, образуют танины и фенолы. Изолят АV4L, имеющий активность против P.aeruginosa, дополнительно синтезирует алкалоиды, а изоляты АV1R и АV7R обладающие активностью против E. coli, и C. albicans - накапливают флавоноиды. Необходимо также отметить, что у изолятов АV6L, АV7L с активностью против P.aeruginosa и АV2R - против S. аureus определение классов активных метаболитов используемыми методами не представилось возможным, что, вероятно, свидетельствует о наличии новых биоактивных антибактериальных соединений, ситезируемых данными культурами.

Таким образом, исследование антибактериальных свойств эндофитных грибов, ассоциированных с Aloe vera, показало их высокую активность против тест-культур S. аureus и P. аeruginosa. При этом внесение в среду культивирования экстракта растения-хозяина способствовало увеличению активности на 30-40%, что говорит о возможности оптимизации и регуляции синтеза антибактериальных соединений выделенных культур. Предварительный качественный анализ суммарных экстрактов эндофитов показал наличие танинов и фенолов в изолятах всех органов растения, а также флавоноидов – в корнях, терпеноидов – в цветках, сапонинов и алкалоидов в листьях. Наиболее активные штаммы отобраны для идентификации и дальнейших исследований в качестве перспективных продуцентов антибиотических соединений против условно-патогенных культур.

Список литературы:

1. Ludden Catherine, Cormican Martin, Vellinga Akke, R Johnson James, Austin Bernie, Morris Dearbháile. Colonisation with ESBL-producing and carbapenemase - producing Enterobacteriaceae, vancomycin-resistant enterococci, and meticillin-resistant Staphylococcus aureus in a long-term care facility over one year. // BMC Infect Dis. 2015. - 1; 15:168.
2. Eun Ju Choo1 and Henry F. Chambers. Treatment of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.//Bacteremia. Infect Chemother. 2016. - 48(4): 267–273.
3. Жукова Э.В. Современное состояние проблемы антибиотикорезистентности и эпидемиологический надзор за устойчивостью микроорганизмов к антибактериальным препаратам.// «Инфекционные болезни», 2015. - № 1, С.44-47.
4. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (‎GLASS)‎ report: 2022. World Health Organization, ISBN: 9789240062702.
5. S. Kusari, S. P. Pandey, M. Spiteller. “Untapped mutualistic paradigms linking host plant and endophytic fungal production of similar bioactive secondary metabolites,” Phytochemistry, 2013, vol. 91, pp. 81–87.
6. Priti V., Ramesha B.T., Singh S., Ravikanth G., Ganeshaiah K.N., Suryanarayanan T.S. How promising are endophytic fungi as altenative sources of plant secondary metabolites? // Curr. Sci., 2009. – 97, 477-478.
7. Ludwig-Muller Jutta. Plants and endophytes: equal partners in secondary metabolite production? // Biotechnol Lett. 2015. - 37:1325–1334.
8. Firáková Silvia Hercegová, Sturdikova Maria, Múčková Marta. Bioactive secondary metabolites produced by microorganisms associated with plants. // Biologia, 2007. - 62(3):251-257
9. Anamika S., Joshi. M., Sahgal S., Sahu A., Prakash. Fungal Endophytes and Their Secondary Metabolites: Role in Sustainable Agriculture. // in book: Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives, 2018. - pp. 121-146.
10. Steenkamp V.1 and Stewart M.J.2. Medicinal Applications and Toxicological Activities of Aloe Products. Pharmaceutical Biology, 2007, Vol. 45, No. 5, pp. 411–420.
11. Jalal Bayati Zadeh, Nasroallah Moradi Kor. Component and Application Aloe Vera Plant in medicine International journal of Advanced Biological and Biomedical Research. Volume 2, Issue 5, 2014: 1876-1882.
12. Prasanna Srinivas, Amrita Nigam, ArunaJampani. Isolation of Fungal Endophytes from Aloe Vera and the Study of Metabolites for Antibacterial Activity and Effect of Growth Hormones on the Plant Growth of Ocimum Sanctum and with Aniasomnifera. Annals of R.S.C.B., 2021, Vol. 25, Issue 6, p. 18318-18327.
13. Hazalin N.A., Ramasamy K., Lim S.M., Wahab I.A., Cole A.Lj, Majeed A.A. Cytotoxic and antibacterial activities of endophytic fungi isolated from plants at the National Park, Pahang, Malaysia. // BMC Complementary and alternative medicine, 2009. - 9:46.
14. Lang G., Blunt J.W., Cummings N.J., Cole A.Lj., Munro M.H.G. Hirsutide a cyclic tetrapeptide from a spider-derived entomopathogenic fungus, Hirsutella sp. // J. Nat. Prod., 2005. - 68:1303-1305.
15. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания, М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - c.- 1 92.
16. Prabhavathi R. M., Prasad M. P., Jayaramu M. Studies on Qualitative and Quantitative Phytochemical Analysis of Cissus quadrangularis. // Applied Science Research, 2016. - 7(4):11-17.
17. Heba A. El-Bialy, Hanan S. El-Bastawisy. Elicitors stimulate paclitaxel production by endophytic fungi isolated from ecologically altered Taxus baccata. // Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 2020. - 13:1, рр.79-87.
18. Li J.Y., Sidhu R.S., Ford E., Hess W.M., Strobel G.A. The induction of taxol production in the endophytic fungus Periconia sp. from Torreya grandifolia. // Journal of industrial Microbiology, 1998. - 20, 259–264.
19. Shaohua Shu, Xinmei Zhao, Wenjuan Wang, Guowei Zhang, Andreea Cosoveanu, Youngjoon Ahn, Mo Wang. Identification of a novel endophytic fungus from Huperzia serrata which produces huperzine A. World J Microbiol Biotechnol. 2014 Dec;30(12):3101-9.
20. Köberl Martina, Ruth Schmidt, Ramadan Elshahat M., Bauer Rudolf, Berg Gabriele. The microbiome of medicinal plants: diversity and importance for plant growth, quality, and health. Front Microbiol. in rhizosphere microbial ecology and soil bacteriology research. // Plant Soil, 2013. - 312, pp. 7–14.