ГАЛОТОЛЕРАТНОСТЬ И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНДОФИТОВ ИЗ СЕМЯН СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ РАСТЕНИЙ

АННОТАЦИЯ

В работе изучена солеустойчивость и ферментативная активность 24 грибных и 33 бактериальных эндофитов, выделенных их семян 6 растений-галофитов, используемых для озеленения Аралкумов. Установлено, что все грибы и 30 бактерий выдерживали 10% NaCl в среде, что говорит о галотолерантности выделенных эндофитов. Все 24 гриба обладали амилазной активностью, 10 из них также обнаруживали целлюлазную активность. Некоторые бактерии проявляли амилазную (12 изолятов), протеазную (11 изолятов) и не обнаруживали целлюлазную активность. Отмечено, что активность изученных ферментов может способствовать прорастанию семян и колонизации растений, обуславливая положительный эффект симбиоза эндофитов с растением-хозяином.

ABSTRACT

The work studied the salt tolerance and enzymatic activity of 24 fungal and 33 bacterial endophytes, isolated from the seeds of 6 halophyte plants used for landscaping the Aralkum. It was found that all fungi and 30 bacteria could withstand 10% NaCl in the medium, which indicates the halotolerance of the isolated endophytes. All 24 fungi had amylase activity, 10 of them also exhibited cellulase activity. Some bacteria exhibited amylase (12 isolates), protease (11 isolates) and no cellulase activity. It was noted that the activity of the studied enzymes could promote seed germination, causing a positive effect of the symbiosis of endophytes with the host plant.

Ключевые слова: Приаралье, галотолерантность, эндофитные грибы и бактерии, ферментативная активность.

Keywords: Aral Sea region, halotolerance, endophytic fungi, bacteria, enzymatic activities.

Введение

Многие исследования показали, что микроорганизмы, ассоциированные с семенами, играют важную роль в повышении приспособленности растений к неблагоприятным условиям окружающей среды. Сообщалось, что семенные эндофитные бактерии влияют на прорастание семян [1, 2], их сохранность [3], приживаемость и развитие сеянцев [2], а также играют важную роль в повышении адаптации растений [4].

Нами в предыдущих исследованиях начато изучение микробных сообществ эндофитов из семян галофитных растений, произрастающих в Приаралье и успешно используемых для создания лесных и кустарниковых насаждений на высохшем дне Аральского моря [5]: саксаул черный (Haloxylon aphyllum (Minkw)), кандым (Calligonum caput-medusae), терескен серый (Ceratoides latens), черкез (Salsola Richteri), чогон (Aellenia subaphylla), изень (Kochia prostrata). Семена были предоставлены д.с.-х.н., акад. З.Б. Новицким. Учитывая, что эндофиты галофитных растений обладают потенциалом смягчения стресса для сельскохозяйственных культур, вызванного засолением и засухой, а также способны повышать продуктивность растений [6], всестороннее изучение данной группы микроорганизмов представляет фундаментальный и прикладной интерес.

Целью настоящего исследования явилось изучение солеустойчивости и проведение первичного скрининга биологической активности галотолерантных эндофитных грибов и бактерий с целью оценки их потенциала для дальнейших применений.

Экспериментальная часть

Объект исследования

Объектом данного исследования явились галотолерантные эндофиты, выделенные ранее из семян 6 растений-галофитов [7]. Всего, в ходе поэтапного выделения и наблюдения за ростовыми свойствами эндофитов, выделено 24 гриба и 33 бактерии, обладающие галотолерантностью (5% соли) и сохранившими способность к росту после многократных пересевов. Питательная среда для грибов -  картофельно-декстрозный агар (КДА), для бактерий – питательный агар (ПА).

Определение солеустойчивости эндофитов из растений-галофитов

Солеустойчивость изолятов определяли на соответствующих агаризованных питательных средах содержащим 0%, 5%, 10%, 15%, 20% NaCl.

Определение ферментативной активности грибов и бактерий

В питательные среды добавляли субстраты: растворимый крахмал (1%), казеин (2%), карбоксиметилцеллюлозу (1%), для определения амилазной активности, протеазной и целлюлазной активности соответственно. Способность эндофитов разлагать субстраты определяли по образованию гало зон вокруг колоний [8, 9, 10].

Результаты и обсуждения

Микроорганизмы, связанные с галофитами, могут стимулировать эти растения к восстановлению засоленных и загрязненных почв [11]. Кроме того, эндофитные микроорганизмы приносят пользу самим растениям, непосредственно стимулируя их рост или косвенно подавляя рост фитопатогенов [12].

В первую очередь нами был определен диапазон солевых концентраций, в которых могут расти выделенные эндофиты для оценки их галотолерантности. В результате эксперимента, показано, что все изоляты, как бактериальные, так и грибные, обладают определенной солеустойчивостью (рис.1.). Все грибы и 30 бактерий выдерживали присутствие NaCl в среде до 10%.  13 бактериальных культур и 19 грибов способны стабильно расти при концентрации 15% соли и лишь 3 бактериальных (выделены из кандыма, изеня и саксаула) и 11 грибных эндофитов (выделены из кандыма, терескена и чогона) выдерживали концентрацию натрия хлорида 20%.  При этом чем выше содержание соли в среде, тем слабее рост эндофитов и значительнее изменение морфологии, что говорит об их галотолерантности, а не о галофильных свойствах.

Рисунок 1. Рост эндофитов на среде с различными концентрациями соли
(А – бактерии, В – грибы)

В результате первичного скрининга ферментативной активности эндофитных грибов и бактерий, выделенных из растений-галофитов Аралкумов, показано, что только 19 бактерий из 33 обладают ферментативной активностью, тогда как все 24 грибных изолята обнаруживали ту или иную активность. Всего 12 бактерий способны к разложению крахмала, 11 изолятов разлагали казеин и ни одна из выделенных бактерий не способна гидролизовать КМЦ. Все грибные изоляты в разной степени разлагали крахмал и 10 - КМЦ. При этом относительно высокая ферментативная активность наблюдалась лишь в отношении крахмала, так значимую амилазную активность продемонстрировали 7 бактериальных и 3 грибных эндофита (рис.2). Отметим, что 100% грибов обладали одним или двумя видами ферментативной активностью, тогда как лишь 58% бактерий были способны к гидролизу исследуемых субстратов. 

А. 

В. 

Рисунок 2. Ферментативная активность галотолерантных эндофитов (А – бактерии, В – грибы)

Наличие амилолитических ферментов у эндофитов, обитающих в семенах растений позволяет переводить находящийся в эндоспермии запасной крахмал в доступные вещества, что способствует лучшему прорастанию семени. Эндофиты, продуцирующие целлюлазы и некоторые другие гидролитические ферменты обычно рассматриваются как агенты биоконтроля, однако эти ферменты также связаны с способами проникновения эндофитов в растения. Протеазы грибов и бактерий играют важную роль в рециркуляции углерода и азота белков, включая сигналы питания, которые каскадно регулируют другие процессы. У ряда бактерий также показана способность продуцировать протеазы, которые способны взаимодействовать с продуктами генов устойчивости растений [12].

Таким образом, данные, полученные в ходе эксперимента, характеризуют выделенные эндофиты как важные составляющие симбиоза растений и микроорганизмов, а присущая им ферментативная активность может играть роль в колонизации растений и прорастании семян. 

Заключение

В результате эксперимента показано, что все эндофиты, выделенные из галофитов Приаралья являются галотолерантными, большинство из них обладает некоторыми видами ферментативной активности, изученной в работе. Гидролитические ферменты, обуславливающие активность грибов и бактерий, несомненно полезны как для самих микроорганизмов, так и для растений-хозяев и могут способствовать адаптации растений к условиям обитания.

Список литературы:

1. Holland MA, Polacco JC. PPFMs and other covert contaminants: is there more to plant physiology than just plant? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1994; 45(1): 197–209.  https://doi.org/10.1146/annurev.pp.45.060194.001213
2. Walitang DI, Kim K, Madhaiyan M, Kim Y, Kang YY, Sa TM. Characterizing endophytic competence and plant growth promotion of bacterial endophytes inhabiting the seed endosphere of rice. BMC Microbiol. 2017; 17(1):209. https://doi.org/10.1186/s12866-017-1117-0
3. Chee-Sanford JC, Williams MM, Davis AS, Sims GK. Do microorganisms influence seed-bank dynamics? Weed Sci. 2006;54(3):575–587. https://doi.org/10.1614/WS-05-055R
4. Ferreira A, Quecine MC, Lacava PT, Oda S, Azevedo JL, Araujo WL. Diversity of endophytic bacteria from Eucalyptus species seeds and colonization of seedling by Pantoea afflomerans. FEMS Microbiol. 2008;287(1):8–14. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2008.01258.x
5. Бакиров Н.Ж., Новицкий З.Б., Хамзаев А.Х. Методы создания лесных насаждений на высохшем дне Аральского моря. Лесоведение, 2022, № 3, с. 312–320
6. Hosseyni Moghaddam MS, Safaie N, Rahimlou S, Hagh-Doust N. Inducing tolerance to abiotic stress in Hordeum vulgare L.by halotolerant endophytic fungi associated with salt lake plants. Front. Microbiol. 2022, 13:906365. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.906365
7. Кондрашева К.В., Суярова Р.А., Новицкий З.Б., Гулямова Т.Г. Семена солеустойчивых растений Аралкумов как источник выделения эндофитных грибов. Материалы международной научно-практической конференции: «Сохраним почву нашим потомкам», 5 декабря 2022 г, Астана, с. 80-84
8. Hankin L., Anagnostakis S.L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia. 1975. V. 67. p. 597–607.
9. Abe C.A., Faria C.B., De Castro F.F., et al. Fungi isolated from maize (Zea mays L.) grains and production of associated enzyme activities. Int J Mol Sci. 2015, V. 16. p. 15328–15346.
10. Montenecourt B.S., Eveleigh D.E. Semi quantitative plate assay for determination of cellulose production by Trichodermaviride. Appl. Environ. Microb. – 1977. – V. 33. – p. 178–183.
11. Bassam T Yasseen, Roda F Al-Thani. Endophytes and Halophytes to Remediate the Industrial Wastewater and Saline Soils: Perspectives from Qatar. In: Prime Archives in Plant Sciences: 2nd Edition. Hyderabad, India: Vide Leaf. 2022.
12. Carro, L., & Menéndez, E. Knock, knock-let the bacteria in: enzymatic potential of plant associated bacteria. Molecular Aspects of Plant Beneficial Microbes in Agriculture, 2020, 169–178. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-818469-1.00014-6