АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МЕДЬ-ПОЛИМЕРНО КОМПЛЕКСА

АННОТАЦИЯ

В этом исследовании ион металлической меди был адсорбирован на аионите (PVC&PEI), который был получен из местного сырья ПВХ. Методом химического восстановления был успешно синтезирован медно-полимерный комплекс с наночастицами металлов на поверхности. Полученный полимер-металлический комплекс затем был подвергнут исследованию с целью оценки его антибактериальной активности в отношении грамположительных штаммов S. aureus и грамотрицательных штаммов E. coli, которые являются представителями условно-патогенных микроорганизмов, обычно используемых для тестирования на биологическое загрязнение. Оценивая его антибактериальную эффективность против этих избранных микроорганизмов, можно получить ценную информацию о его применимости в борьбе с биологическим загрязнением.

ABSTRACT

In this study, a copper metal ion was adsorbed onto anionite (PVC&PEI), which was derived from locally sourced raw material PVC. Through a chemical reduction method, a copper-polymer complex with metal nanoparticles on its surface was successfully synthesized. The resulting polymer-metal complex was then subjected to investigation to assess its antibacterial activity against gram-positive S. aureus and gram-negative E. coli strains, which are representative of conditionally pathogenic microorganisms commonly utilized for biological contamination testing. By evaluating its antibacterial efficacy against these selected microorganisms, valuable insights can be gleaned regarding its applicability in addressing biological pollution.

Ключевые слова: ПВХ, полимер-металлический комплекс, анионит, антибактериальная активность, E. coli, S. aureus.

Keywords: PVC, polymer-metal complex, anion exchanger materials, antibacterial activity, E. coli, S. aureus.

Введение

В последние годы, в связи с прогрессом в области супрамолекулярной химии и нанотехнологий, возрастает интерес к разработке полимерных систем, обогащенных наночастицами металлов, которые обладают уникальными физико-химическими свойствами. Сочетание полимерной матрицы с этими частицами придает нанокомпозиту новые свойства, в то время как стабильность наночастиц в полимерных системах сохраняется на протяжении длительного времени. Благодаря своей биологической и антибактериальной активности, наночастицы меди привлекают все больший интерес. Они широко применяются в медицине, сельском хозяйстве, катализе и охране окружающей среды. Особенно ценны они в борьбе с бактериями и грибками, которые способны приводить к биообрастанию в сточных водах [1-2]. Для очистки ионов тяжелых металлов и загрязняющих веществ в прошлом использовались физические, химические и биологические методы. Однако, при химической и биологической очистке эти методы оказываются неэффективными. С целью очистки воды от загрязнений, поликомплексоны, полученные на основе хитозана, полиметакрилата, полианилина и поливинилхлорида, были использованы в качестве сорбентов. Однако, следует отметить, что такие фильтраты обладают меньшей склонностью к биообрастанию. Кроме того, комбинация двух или более материалов может представлять собой более эффективное решение данных проблем [3]. Неорганические наночастицы металлов обладают термостойкостью и химической стабильностью, а также проявляют высокую антибактериальную активность. Однако, при их синтезе возникает проблема агломерации, что приводит к снижению их свойств [4]. С целью преодоления данной проблемы, применяют полимерные стабилизаторы, обладающие адсорбционными свойствами. В процессе производства металлополимерных наночастиц в качестве стабилизаторов полимеров широко применяются такие вещества, как поливинилпролидон, полиэтиленгликоль, полианилин, полиакриламид, поливинилхлорид, хитозан, крахмал, целлюлоза и другие. Металлические наночастицы Ag, Au, Zn, Cu широко применяются для эффективного удаления биологических загрязнений, таких как бактерии и грибки. Особенно наноразмерные наночастицы Cu проявляют высокое качество при химической и биологической переработке отходов, благодаря своей высокой реакционной способности [5]. Полиуретаны, включающие наночастицы Cu и Ag, обладают бактерицидными свойствами, которые проявляются в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжеподобных грибов [6-10]. В исследовании Б. Маноджа и его коллег была подчеркнута значимость металлической меди в области электрокатализа, фотокатализа и газофазного катализа для наночастиц на ее основе [11]. Антибактериальные свойства наночастиц меди главным образом обусловлены сцеплением их зарядов с противоположными зарядами бактерий. Этот процесс приводит к окислению наночастиц металлов внутри клеточной стенки бактерий. Благодаря своей высокой площади поверхности, наночастицы обеспечивают высокую эффективность в антибактериальной активности [12]. Медь была включена в список металлов с антимикробными свойствами агентством по охране окружающей среды США, а металлическая медь проявляет более высокую эффективность против бактериальных штаммов E. Coli и B. sublitis по сравнению с серебром [13].

Установлена эффективность адсорбентов на основе полимерно-металлических комплексов для удаления химических и биологических загрязнений из воды. Цель данного исследования заключается в синтезе медно-полимерного комплекса путем сорбции ионов металлической меди ПВХ и ПЭИ-анионитом, основанным на поливинилхлориде, а также в изучении антибактериальной активности полученного медно-полимерного комплекса в отношении условно-патогенных бактерий E.coli и S.aureus.

Материалы и методы

Материалы и химические вещества

Хлорид меди(II) (CuCl₂*2H₂O) был приобретен у компании Zibo Rongzhi Chemical Corporation (Китай). Анионит PVC&PEI был синтезирован путем модификации ПВХ с использованием полиэтиленимина. Для исследования были получены бактериальные возбудители Staphylococcus aureus (S.aureus) и Escherichia coli (E.coli), а также использовался агар Миллера-Хинтона от компании TM Media (Индия). Все другие химические вещества, примененные в данном исследовании, были аналитически чистыми.

Подготовка и свойства используемых материалов

Синтез PVC&PEI

Анионообменный сорбент PVC&PEI был синтезирован путем химической модификации поливинилхлорида (ПВХ) полиэтиленимином (ПЭИ) по методикам, изложенным в предыдущих работах [14-15]. В качестве исходного материала для синтеза анионообменной смолы использовали гранулированный полимер ПВХ промышленного производства.

Для начала синтеза 3 г гранулированный ПВХ отмеряли с помощью аналитических весов и добавляли в круглодонную колбу вместе с 70%-ным раствором ПЭИ. Затем смесь нагревалась на водяной бане при температуре 80°С в течение 2 часов для облегчения процесса модификации.

Для более полной модификации образец из колбы переносился в гидротермальный автоклав-реактор объемом 50 мл с тефлоновой прокладкой. Автоклав помещался в муфельную печь, и процесс более глубокой модификации PVC&PEI проводился при температуре 423 К в течение 5 часов. Оптимальные условия синтеза PVC&PEI были определены при температуре 423 К в течение 5 часов.

После проведения синтеза было установлено, что статическая обменная емкость синтезированного ионита с соляной кислотой (HCl) составляет 5,8 мг-экв/г. Химическая реакция ионита PVC&PEI приведена ниже:

Рисунок 1. Синтез PVC&PEI

Синтез PMC-Cu⁰

Синтез ПМК-Cu⁰ включает несколько этапов, начиная с приготовления 0,025; 0,05; 0,075; и 0,1 M раствора соли CuCl₂∙2H₂O. Ионы Cu²⁺ из раствора сорбируются на ранее синтезированном ионите PVC&PEI в статических условиях.

Далее синтезируется ПМК-Cu²⁺ ионно-матричным методом, при котором ионы Cu²⁺ образуют ионно-координационную связь с аминными группами, присутствующими в ионите. В результате образуется ПМК-Cu²⁺ , состоящий из металлической меди, связанной с ионитом.

Для получения ПМК-Cu⁰ необходимо восстановить ионы меди, входящие в состав ПМК -Cu²⁺. Для этого используется 1 М раствор NaOH, в процессе восстановления которого в материале образуются наночастицы металлической меди. В результате образуется ПМК-Cu⁰, который преимущественно содержит восстановленные наночастицы металлической меди в порах ионита.

Антибактериальная активность

Антибактериальные свойства синтезированного полимер-металлического комплекса были изучены in vitro в отношении различных микроорганизмов. Антимикробную активность образцов оценивали с использованием диско-диффузионного метода на бактерий E. Coli и S. аureus, включая клинические изоляты. Для этого патогенные микроорганизмы были предварительно инкубированы в пептонной бульонной среде в течение 24 часов при температуре 37°С. Затем, взвесь патогенных и условно-патогенных тест-бактерий была равномерно распределена на чашках Петри с помощью стерилизованных ватных тампонов на агаре Миллера-Хинтона (TM Media, Индия). Исследуемые образцы, отмеренные весом 0,01 г гранулированного полимер-металлического комплекса, были увлажнены дистиллированной водой и помещены на агаризованную питательную среду с использованием пинцета. Чашки, засеянные патогенными и условно-патогенными культурами, были слегка подсушены перед этим. Для того чтобы активные ингредиенты впитались в питательную среду, образцы были выдержаны в холодильнике при температуре +4°C в течение 2 часов. Далее бактерии были инкубированы в термостате при температуре 37°C в течение 16-18 часов. Антимикробную активность исследуемых веществ оценивали на основе размера зон, в которых наблюдалось снижение или полное прекращение роста тест-штаммов. Каждый эксперимент проводился в трех повторениях, и полученные значения были усреднены.

Результаты и их обсуждение

Рамановский спектроскопический анализ полимерно-металлического комплекса

Основная цель состоит в определении состава данного комплекса полимер-металл. Рамановская спектроскопия проводилась с использованием спектрометра Bruker BRAVO (примечание к продукту R35), который регистрировал широкий спектральный диапазон от 300 см^-1 до 3200 см^-1. Значимость этого исследования заключается в важности понимания текстуры и морфологии поверхности полимерных материалов, а также химических элементов, присутствующих в материале. Анализ спектра комбинационного рассеяния представлен на рисунке 2.

Рисунок 2. Рамановский спектр полимер-металлического комплекса

На рис. 2 в рамановском спектре комплекса полимер-Cu появилась новая колебательная область при 440 и 380 см^-1, которая отсутствует в анионообменнике PVC&PEI. Наличие деформационного колебания в области 1562 см^-1 свидетельствует о присутствии в синтезированном комплексе полимер-Cu групп C=O. В котором сдвиг колебательных полей аминной группы обусловлен связыванием с ионом металла. А также поля колебаний 380 см^-1 и 440 см^-1 принадлежат связи Cu-O соответственно. Из смещения валентных и деформационных колебаний, связанных с первичными и вторичными аминогруппами в анионите PVC&PEI при образовании полимер-металлического комплекса, можно сделать вывод, что ионы металлов связаны с аминогруппами через ионно-координационную связь.

АСМ, СЭМ и ЭДС анализ полимерно-металлического комплекса

В целях изучения морфологии внешней структуры полимер-металлических комплексов были получены микрофотографии с использованием сканирующего электронного микроскопа. Результаты микрофотографий представлены на последующих 3 и 4-рисунках.

Рисунок 3. АСМ-изображения наночастиц металлов на поверхности полимер комплексных материал PVC&PEI-Cu⁰

Рисунок 4. ЭДС-спектр и количественный анализ элементного состава PVC&PEI-Cu⁰

Из гистограммы медно-полимерного комплекса AСM можно сделать  вывод, что максимальный размер частицы металлической меди составляет 21 нм. Гистограмма AСM Позволяет анализировать размеры и распределять частицы на поверхности образца с помощью атомно-силового микроскопа.

Из результатов энергодисперсионного спектрометрического анализа и анализа массовой доли элементов видно, что массовая доля меди составляет 40%. Частицы металла присутствуют на поверхности материала в атомарном и ионном состоянии, в форме солей. Ионы меди связаны с аминогруппой в анионите через ионно-координационную связь по механизму донор-акцептор. В результате синтеза был получен комплекс PVC&PEI-Cu⁰.

Антибактериальная активность

Для определения антибактериальных свойств комплекса полимер-металл был проведен тест дисковой диффузии с использованием метода Кирби-Бауэра. Для этого были выбраны два типа патогенных бактерий: грамотрицательные штаммы (E.coli) и грамположительные штаммы (S.aureus). После 24-часовой инкубации образцов проводилось измерение зоны ингибирования вокруг антимикробного диска. Для сравнительного анализа были исследованы контрольные образцы, включая PVC&PEI и медь-полимерно-металлический комплекс. Антимикробная активность Cu-ПМК в отношении бактериальных штаммов E. coli и S. aureus представлена на рисунке 3. Вокруг полимер-металлического комплекса наблюдается явная зона ингибирования. Размер антибактериальной зоны для Cu- ПМК составляет  26±0,5 мм для E. coli и 15,6±0,8 мм для S. aureus. В анионите PVC&PEI антибактериальная зона не образовалась.

Рисунок 5. Антибактериальная активность комплекса медь-полимер-металл в отношении а) E. coli и б) S. aureus была оценена с помощью метода дисковой диффузии

Рисунок 6. Иллюстрирует зависимость диаметра антибактериальной зоны от концентрации комплекса Cu-ПМК

Рисунок 6 наглядно демонстрирует антибактериальную активность образцов в отношении патогенных микроорганизмов, а также зависимость диаметра зоны от концентрации меди в синтезированном Cu-ПМК. Интересно отметить, что антибактериальная эффективность Cu-ПМК при концентрации
200 мг/г выше у E. coli по сравнению с бактериальным штаммом S. aureus.

Выводы

Ионы меди адсорбировались на анионообменнике PVC&PEI на основе поливинилхлорида и полиэтиленимина, а комплекс полимер-металл получался методом химического восстановления. Для определения структуры и состава синтезированного полимерного металлокомплекса использовались такие современные методы, как комбинационное рассеяние света, АСМ, СЭМ и ЭДС. Испытуемые образцы проявили высокую антибактериальную активность в отношении грамотрицательных E.coli и S. аureus являющихся патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Диаметр антимикробной зоны комплекса PVC&PEI-Cu⁰ больше, чем у комплекса PVC&PEI-Cu⁺², что объясняется зависимостью от размера наночастиц меди на поверхности полимера и концентрации металла на поверхности полимера. Исследована зависимость диаметра антибактериальной зоны от концентрации сорбированной меди в Cu-ПМК. Cu-ПМК обладает способностью адсорбировать токсичные ионы тяжелых металлов из сточных вод и промышленных сточных вод, а также эффективно очищает воду от биологически загрязняющих микроорганизмов. Анионит PVC&PEI, в свою очередь, лишен противомикробной активности и используется исключительно для очистки сточных вод путем сорбирования ионов тяжелых металлов.

Список литературы:

1. Sánchez-López E, Gomes D, Esteruelas G, Bonilla L, Lopez-Machado AL, Galindo R, Cano A, Espina M, Ettcheto M, Camins A, et al. Metal-Based Nanoparticles as Antimicrobial Agents: An Overview. Nanomaterials. 2020; 10(2):292. https://doi.org/10.3390/nano10020292
2. Cao R, Zhai X, Li X, Zhao X. Antibacterial properties of a novel nano-silver loaded poly(styrene-co-acrylic) composites. Polymers and Polymer Composites. 2021. –Vol. 29(9).- pp. 1017-1022.
3. Chauhan, D., Afreen, S., Mishra, S. & Sankararamakrishnan, N. Synthesis, characterization and application of zinc augmented aminated PAN nanofibers towards decontamination of chemical and biological contaminants. // Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 2017. –Vol. 55. -pp. 50–64.
4. Liu, Y. et al. Effective antibacterial activity of degradable copper-doped phosphate-based glass nanozymes. ACS Applied Materials & Interfaces. 2021.-Vol. 13. –pp. 11631-11645.
5. Dorian A. H. Hanaor, Maliheh Ghadiri, Wojciech Chrzanowski and Yixiang Gan. Scalable Surface Area Characterization by Electrokinetic Analysis of Complex Anion Adsorption // American Chemical Society. 2014. -Vol. 30. -pp 15143−15152.delivery applications. // Biochem. Eng. J. 2014. –Vol. 90. –pp. 79–89.
6. A Zambare, T. Nerpagar N. Chaudhari P. Manchalwad S. Harke. Synthesis of silver nanoparticles and their antibacterial activity. // Int. J. Nano Dimens. 2014. –Vol.5. -pp. 569-573.
7. Y. Savelyeva, A. Gonchara, B. Movchanb, A. Gornostayb, S.Vozianovc, A. Rudenkoc, R. Rozhnovaa, T. Travinskayaa. Antibacterial polyurethane materials with silver and copper nanoparticles //Materials Today: Proceedings. 2017. –Vol. 4. -pp. 87–94.
8. Díez-Pascual AM. Recent Progress in Antimicrobial Nanomaterials. Nanomaterials (Basel). 2020 Nov 23;10(11):2315. doi: 10.3390/nano10112315. PMID: 33238368; PMCID: PMC7700142.
9. Croisier, F. & Jérôme, C. Chitosan-based biomaterials for tissue engineering //Eur. Polymer J. 2013. –Vol.49. –pp. 780–792.
10. Ashfaq M., Verma N., Khan S. Highly effective Highly effective Cu/Zn-carbon micro/nanofiber-polymer nanocomposite-based wound dressing biomaterial against the P. aeruginosa multi- and extensively drug-resistant strains. //Mater. Sci. Eng. C. 2017. –Vol. 77.-pp. 630–641.
11. Manoj B. Gawande, Anandarup Goswami, Francois-Xavier Felpin, Tewodros Asefa, Xiaoxi Huang, Rafael Silva, Xiaoxin Zou, Radek Zboril, and Rajender S. Varma Cu and Cu-Based Nanoparticles: Synthesis and Applications in Catalysis/ Chem. Rev. 2016. –Vol. 116.-pp. 3722−3811.
12. Carlos A.P. Bastos, Nuno Faria, John Wills, Per Malmberg, Nathalie Scheers, Paul Rees, Jonathan J. Powell, Copper nanoparticles have negligible direct antibacterial impact, NanoImpact, Volume 17, 2020, 100192, ISSN 2452-0748, https://doi.org/10.1016/j.impact.2019.100192.
13. Prado JV, Vidal AR, Duran TC, Application of copper bactericidal properties in medical practice. Rev Med Chil. 2012. –Vol. 140. –pp. 1325-1332.
14. M. Mukhamediev, D. Bekchanov, New Anion Exchanger Based on Polyvinyl Chloride and Its Application in Industrial Water Treatment. Russian Journal of Applied Chemistry. 2019.-Vol. 92.-pp.  1499-1505.
15. Lieberzeit, P., Bekchanov, D. & Mukhamediev, M. Polyvinyl chloride modifications, properties, and applications. Polymers for Advanced Technologies 2022.- Vol. 33.- pp. 1809-1820.