ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ПРО-/АНТИОКСИДАНТНУЮ СИСТЕМУ ХЛОПЧАТНИКА

АННОТАЦИЯ

Устойчивость к окислительному стрессу, вызванную обработкой пероксидом водорода (Н₂О₂), оценивали по биохимическим параметрам в двух сортах хлопчатника Сурхан-103 и Порлок-1. С целью определения концентрации Н₂О₂ проводили обработку влияющих на активность антиоксидантных ферментов в следующих концентрациях : 10мМ; 30мМ; 50мМ; 80мМ; 100мМ. Устойчивость к окислительному стрессу оценивали по уровню малонового диальдегида и внутриклеточного пероксида водорода. С увеличением концентрации уровень Н₂О₂ в растительной клетке возрастал линейно в двух исследованных сортах, низкая доза (10мМ) не вызвала окислительный стресс. Результаты выявили, что из исследованных концентраций только 10мМ Н₂О₂ повышает активность каталазы у обоих сортов и линейное повышение активности пероксидазы с увеличением дозы  отмечалось у Порлок-1. Сорт Сурхан-103 имел стабильные показатели по содержанию МДА до 100мМ обработки, однако в сорте Порлорк-1 отмечалось накопление малонового диальдегида, начиная от 30мМ до 100мМ с одновременным уменьшением активности каталазы, этот сорт оказался более чувствительным к повышению пероксида водорода.

ABSTRACT

Resistance to the oxidative stress caused by the hydrogen peroxide ((Н₂О₂) used for treatment of two cotton species, Surkhan-103 and Porlok-1, was assessed by chemical parameters. To determine the hydrogen peroxide concentrations producing an impact on the activity of antioxidant enzymes, the species were treated with 10mM, 30mM, 50mM, 80mM and 100mM of hydrogen peroxide. Resistance to the oxidative stress was assessed by concentrations of malondialdehyde (MDA) and intracellular hydrogen peroxide. The Н₂О₂ concentrations increased, its levels in the plant cell were found to increase linearly in two species under study; the lowest concentration (10mM) was found not to cause oxidative stress. Our findings demonstrated increase in the catalase activity in both species only when treated with 10mM; while the linear increase of peroxidase activity was demonstrated in Porlok-1 with the increase of the dose. Stable parameters by MDA were found in the Surkhan-103 species upon treatment with concentration of up to 100mM, while in Porlok-1, MDA accumulation was found upon treatment with concentrations in the range from 30mM to100mM paralleling reduction in catalase activity. The latter species turned out to be more sensitive to the increase of the hydrogen peroxide concentrations.    

Ключевые слова: Окислительный стресс, пероксид водорода, каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза, малоновый диальдегид.

Keywords: Oxidative stress, hydrogen peroxide, catalase, superoxide dismutase, peroxidase, malondialdehyde.

Введение

Повышение содержания активных форм кислорода (АФК) является универсальной реакцией организма практически на любое стрессовое воздействие. Усиление генерации АФК до определенного уровня запускает синтез стрессовых белков, которые защищают клетку от гибели, а превышение этого уровня, наоборот, вызывает ее гибель [24; 3; 4]. Активные формы кислорода такие как супероксид (О^2-), гидроксил (OH), пероксил (ROO), а также перекись водорода (Н₂О₂), синглетный кислород (¹O₂) и озон (О₃) в нормальных условиях находятся в очень низких концентрациях [4]: концентрация О ^2•- составляет порядка 10^-11 М; H₂О₂ – 10^-8 М; HО^{• –} меньше 10 ^-11М. В нормально функционирующих клетках содержание АФК поддерживается на низком уровне, т.к. специальные антиоксидантные ферментные системы (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза) постоянно участвуют в их ликвидации [6] вместе с низкомолекульярными антиоксидантами (пролин, аскорбат, глутатион, каротиноиды и антоцианы) [33].

Последнее годы в литературе все чаще накапливается информация что активные формы кислорода играют двойственную роль: могут выполнять функцию вторичных мессенджеров в передаче сигнала во время фазы индукции ПКГ (программируемая клеточная гибель) и считаются возбудителями окислительного взрыва в чрезмерно высоких концентрациях [2].

Например, пероксид водорода способен активировать каскадную систему, запускающую киназную реакцию [21]. Второй сигнальной молекулой может быть гидропероксильный радикал НО ^2•. Также показано, что АФК могут вступать как сигнальные молекулы и во время индуцированного растительным гормоном физиологического клеточного ответа [16]. С другой стороны, АФК, обладая высокой реакционной способностью, могут разрушать различные клеточные структуры [13; 9].

Существует много работ, указывающих на то, что повышение уровня АФК в растительной клетке при тепловом воздействии является одной из причин ее гибели. В работе Vacca R.A. и др.,[11] температурное воздействие 55 °С приводило к «отсроченной», или развивающейся во времени, гибели клетки с одновременной сверхпродукцией АФК. Концентрация пероксида водорода коррелирует с содержанием малонового диальдегида и эти показатели в последнее время считаются маркерами при оценке окислительного стресса растений находящиеся под воздействием неблагоприятных условий [8; 10].

Целью данной работы явилось изучение содержания (АФК и МДА) и основных ферментативных (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза) антиоксидантов у сортов хлопчатника при окислительном стрессе, вызванном обработкой экзогенной перекисью водорода.

Материалы и методы

В исследованиях были использованы 2 сорта хлопчатника, Сурхан-103 из семейств Gossypium barbadense, предоставлены НИИ селекции, семеноводства и агротехнологии выращивания хлопчатника при МСХ РУз. Семен ген-нокаутного сорта хлопчатника Порлок-1 предоставлены Центром геномики и биоинформатики АН РУз.

Выращивание проростков. Семена хлопчатника оголяли в концентрированной серной кислоте, затем промывали под струей холодной воды в течении 15 минут. Оголенные семена выдерживали в очищенной воде в течение 12 часов. Набухшие семена, завернутые в бумажные рулоны, проращивали в течение 7 суток климатической камере при 30 ⁰С [32].

Обработка с пероксидом водородом

После седьмого дня прорастания, листья проростков опрыскивали  различными концентрациями (10, 30, 50, 80, 100 мМ ) пероксида водорода и оставляли в климатической камере при 30 ⁰С еще на 24 час для полного впитывания раствора пероксида водорода согласно методом Muhammad Sarwar и др., [19]. Через 24 часа после обработки с различными концентрациями пероксида водорода, листья проростков собирали и замораживали в жидком азоте для последующих анализов [31]. Контрольный набор растений опрыскивали дистиллированной водой.

Для определения активности антиоксидантных ферментов листья проростков хлопчатника гомогенизировали в жидком азоте. Для получения ферментативного экстракта навеску ткани массой 500 мг растирали в холодной фарфоровой ступке с добавлением соответствующего экстракционного буфера в соотношении 1:10.

Определение активности супероксиддисмутазы. Общую активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразоля (NBT), согласно Giannopolitis, C. N., Ries, [12] с некоторыми модификациями, Polesskaya O. G., с соавторами [22].

Определение активности пероксидазы. Спектрофотометрический метод определения активности пероксидазы проводили по Бояркину [1]. В качестве субстрата использовали о-дианизидин (3,3-Диметоксибензидин) путем определения увеличения оптической плотности при 460 нм. Реакция была инициирована с добавлением 50 мкл H2O2. Активность пероксидазы выражали в ед/мг белка за одну минуту. Определение содержания белка проводили по методу Lowry O.H., [17].

Определение активность каталазы проводили с помощью некоторых модификаций по методу Sinha [30], который основан на восстановлении дихромата до ацетата хрома в присутствии уксусной кислоты при молярном соотношении 1:3. с некоторыми модификациями Mahmoud H. Hadwan [19].

Определение содержания пероксида водорода проводили по методу Sanders Junglee [29], основанному на окислении йодида калия (KI) с помощью пероксида водорода в кислой среде. Поглощение определяли методом спектрофотометрии при длине волны 390 нм.

Определение концентрации малонового диальдегида проводили по методу Rogozhin V.V., [26], основанному на образовании окрашенного комплекса – продукта малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой при нагревании.

Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы анализа данных Atte Stat V.10.9.6, работающей как надстройка программы “Microsoft Excel-2007”.

Полученные результаты

В наших исследованиях обработка пероксидом водорода вызвала постепенное снижение СОД при 10мМ и 30мМ в сортах хлопчатника Сурхан-103 и Порлок-1 по сравнению с контролем (рис.1). Более высокие величины ингибирующего эффекта отмечались при обработке 100мМ раствором пероксида водорода, особенно у Сурхан-103 приводило к резкому снижению активности СОД (9,73±0,3 Ед/мг белка) и составило 55,8% от контрольного уровня (17,41±0,5 Ед/мг белка), что свидетельствуют об фитотоксичном действии применения экзогенного пероксида водорода при 100мМ.

Подобное снижение активности супероксиддисмутазы в генотипах пщеницы, обработанных пероксидом водорода Sairam и Srivastava [29] объясняют тем, что H₂O₂ сам по себе не оказывает стимулирующего действия  на SOD. Авторы предполагают, что снижение активности SOD, наблюдаемое после обработки H₂O₂, может быть связано с ингибированием перекисью водорода CuZn-SOD и Fe-SOD.

В то время как в работе Muhammad Sarwar и Muhammad Farrukh [19], применение экзогенного пероксида водорода при концентрации 30мМ вызвало увеличение активности СОД в листьях хлопчатника проведенных в полевых условиях.

Рисунок 1. Активность супероксиддисмутазы в листьях проростков хлопчатника, обработанных  различными концентрациями пероксида водорода (n=3; M±m) Р≤0,05

Несмотря на постоянное снижение активности фермента СОД была значительно выше у Сурхан-103, особенно при обработке с 80 мМ перекисью водорода, где показана высокая активность 15,2±0,3 Ед/мг белка (на 36,3% выше) по сравнении с сортом Порлок-1 (9,68±0,34 Ед/мг белка).

Рисунок 2. Активность каталазы в листьях проростков хлопчатника обработанных различными концентрациями пероксида водорода
(n=3; M±m) Р≤0,05

Антиоксидантные ферменты КАТ и ПО являются ключевыми ферментами, смягчающими окислительное повреждение в растительных клетках [34]. Результаты показали, что активность каталазы в сорте Сурхан-103 увеличивалась при обработке 10мМ и 80мМ перекисью водорода на 11,6 % и 55 %, тогда как при 100мМ наблюдалось подавление на 34,8 % в ответ на окислительный стресс.

В сорте Порлок-1, в отличие от Сурхан-103, отмечалось повышение на 14,6 % активности КАТ только при обработке 10мМ Н2О2, в то же время активность фермента резко понизилась с повышением конценрации пероксида водорода. Одновременно достаточно стабильные показатели при концентрациях (30мМ, 50мМ) наблюдались у Сурхан-103 по отношению к контролю (рисунок 2).

Как видно из рис. 2, при обработке 30мМ перекисью водорода активность каталазы у сорта Сурхан-103 показала контрольный уровень (113,1±3,7 мг/белка мин -1). Тогда как в сорте Порлок-1 обработка 30мМ и 50мМ Н2О2 подавляла активность КАТ на 54 % (47,94± 1,1мг/белка мин-1), и 68 % (33,3±1,1мг/белка мин-1) по сравнению с контрольными образцами (105,1±3,1 мг/белка мин-1) напоминают реакцию гиперчувствительности, как описано [20].

Известно, что в растениях помимо каталазаы присутствуют гваякол пероксидаза, глютатион пероксидаза, аскорбат пероксидаза – ферменты из класса оксидаз, которые также используют в качестве субстрата H₂O₂ или перокси-связь (R-O-O-H), восстанавливая пероксид водорода до воды с параллельным окислением аскорбата, глютатиона, либо ароматических восстановителей (например, гваякола или пирогаллола)[7; 5].

В наших исследованиях мы наблюдали, что активность пероксидазы (рис. 3) в сорте Сурхан-103 повышалась при обработке только 30мМ H₂O₂ на 49,6% и 50мМ на 21,4% по отношению к контрольным образцам. Тогда как в сорте Порлок-1, активность пероксидазы линейно возрастала и более высокие величины отмечались в ответ на обработку 80мМ (69,4%,) и 100мМ на 141% по сравнению с контролем.

Рисунок 3. Активность пероксидазы в листьях проростков хлопчатника, обработанных различными концентрациями пероксида водорода (n=3; M±m) Р≤0,05

Следует отметить, что активность пероксидазы в сорте Порлок-1 повышается, начиная от концентрации 30мМ до 100мМ, очевидно это происходит за счет уменьшения активности каталазы при этих же концентрациях (рис.2). Несмотря на высокие показатели пероксидазы в сорте Порлок-1, фермент не смягчал уровень окислительного стресса вызванного пероксидом водорода (рис. 4).

Рисунок 4. Содержание пероксида водорода в листьях проростков хлопчатника обработанных различными концентрациями пероксида водорода (n=3; M±m) Р≤0,05

Содержание эндогенного пероксида водорода возрастало в двух сортах хлопчатника с повышением концентрации экзогенной Н₂О_2. аналогично результатами Gechev T [31], и Rodrigo M [25]. В сорте хлопчатника Поролок-1 под воздействием различных концентраций перокисда водорода (10мМ-100мМ) его эндогенное содержание линейно повышалось. Тогда как сорт Сурхан-103 проявлял накопление пероксида водорода, начиная от 50мМ до 100мМ по отношению к контролю (рис.4).

Рисунок 5. Содержание малонового диальдегида в листьях проростков хлопчатника обработанных различными концентрациями пероксида водорода (n=3; M±m) Р≤0,05

У сорта Сурхан-103 несмотря на повышенный уровень эндогенного пероксида водорода при обработке в концентрациях от 50мМ до 80мМ отмечалось незначительное накопление МДА. При обработке у Порлок-1 содержание МДА увеличивалось линейно с повышением концентрации, начиная от 30мМ (15 %) до 100мМ (56,2 %), что коррелирует с повышением эндогенного пероксида водорода (рис 4). Применение высокой концентрации пероксида водорода позволило выявить, что только доза 100мМ подавляет активность супероксиддисмутазы и каталазы в обоих сортах хлопчатника Сурхан-103 и Порлок-1, коррелирует с одновременным повышением концентрации конечного продукта малонового диальдегида. Эти результаты предполагают, что повышение концентраций экзогенного пероксида водорода приводит к понижению активности вышеуказанных ферментов, вследствие чего приводит к повышению уровня МДА. Этот вывод согласуется с двойной ролью пероксида водорода в растениях: при более высоких концентрациях приводят к окислительному стрессу и даже вызывает гибель клеток [15; 27] и на низких уровнях действует как сигнальная молекула [28].

Таким образом, только 10мМ обработка с пероксидом водорода проростков не привела к окислительному стрессу сорта Порлок-1, также индуцировал активность КАТ и ПО, тогда как более высокие концентрации (начиная от 30мМ до 100мМ) вызвали повышение МДА. Сорт Сурхан-103 имел невысокую активность фермента каталазы за исключением повышения при 80мМ пероксида водорода, для этого сорта отмечается также нестабильная активность пероксидазы. Из исследованных концентраций только 10мМ Н2О2 повышает активность каталазы у обоих сортов. Линейное повышение активности пероксидазы с увеличением дозы у Порлок-1 объясняется тем, что каждый исследуемый генотип хлопчатника имеет свои специфические биохимические особенности к влиянию экзогенного пероксида водорода.

Список литературы:

1. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы // Биохимия. – 1951. – Т. 16. – N 4. С. – 352-355.
2. Корсукова А.В., Грабельных О.И. Роль активных форм кислорода и участие митохондрий в развитии программируемой клеточной гибели в колеоптилях озимой пшеницы // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». – 2013. – Т. 6. – № 2. – С. 14–26.
3. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В., Ястреб Т.О. Ферментативные источники активных форм кислорода в растительных клетках: регуляция активности и участие в стрессовых реакциях // Вісник Харківського Національного Аграрного Університету. Серія Біологія. – 2012.– № 1. – С. 6–22.
4. Креславский В.Д., Лось Д.А., Аллахвердиев С.И., Кузнецов В.В.  Сигнальная роль активных форм кислорода при стрессе у растений // Физиология растений. – 2012. – Т. 59, № 2. – С. 163–178.
5. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пероксидазного окисления: субстратсубстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена // Известия АН. Серия химическая. – 1996. – С. 25–32.  
6. Прадедова Е.В., Ишеева О.Д., Саляев Р.К. Классификация системы антиоксидантной защиты как основа рациональной организации экспериментального исследования окислительного стресса у растений // Физиология растений. – 2011. – Т. 58. – № 2. – С. 177-185
7. Фердман Д. Биохимия. – М.: Изд. Высшая школа, 1966. – 616 с.
8. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K. V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivative stress: a review // Annals of Botany. 2003. Vol. 91. N. 2. P. 179–194.
9. Breusegem F.V., Dat J.F. Reactive oxygen species in plant cell death // Plant Physiology. – 2006. – Vol. 141. – Р. 384-390.
10. Сheeseman J. M. Hydrogen peroxide and plant stress: a challenging relationship // Plant Stress. – 2007. – Vol. 1. – N. 1. – P. 4–15.
11. Vacca R.A. Cytochrome c is released in a reactive oxygen species-dependent manner and is degraded via caspase-like proteases in tobacco Bright-Yellow 2 cellsen route to heat shock-induced cell death // Plant Physiol. – 2006. – Vol. 141. – N 1. – P. 208–219.
12. Giannopolitis C. N., Ries S. K. Superoxide Dismutases: I. Occurrence in Higher Plants // Plant Physiology. – 1977. – Vol. 59. – P. 309-314.
13. Halliwell B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life // Plant Physiology. – 2006. – Vol. 141. – Р. 312– 322.
14. Iqbal M., Nafees Khan. Reactive oxygen species and antioxidant systems in plants: role and regulation under abiotic stress. Springer -2017. – P. 328
15. Dat J., Vandenbeele S., Vranova E., Van Montagu M., Inze D., Van Breusegm F. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses // Cellular and Molecular Life Sciences– Vol. 57. – 2000. – P. 779–795.
16. Jung M., Park Ky Young Plant hormone-induced biphasic accumulation of ethylene and reactive oxygen species (ROS) // Abstract Book. FESPB Congress, Valencia, 4-9 July 2010. – Valencia, 2010. – Pp. 66.
17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // Journal of Biological Chemistry. – 1951. – Vol. 193. – No.1. – P. 265–275.
18. Mahmoud H. Hadwan. New Method for Assessment of Serum Catalase Activity. Indian Journal of Science and Technology. – 2016. – Vol. 9 (4). – P.2-5.
19. Muhammad Sarwar1, Muhammad Farrukh Saleem, Najeeb Ullah, Muhammad Rizwan. et al., Exogenously applied growth regulators protect the cotton crop from heat-induced injury by modulating plant defense mechanism // Scientific Reports. – 2018. – 8:17086. DOI:10.1038/s41598-018-35420-5
20. Mulpuri V. Rao, Gopinadhan Paliyath, Douglas P. Ormrod, Dennis P. Murr, and Chris B. Watkins. lnfluence of Salicylic Acid on H₂0₂ Production, Oxidative Stress, and H,O,-Metabolizing Enzymes // Plant Physiology. – 1997. Vol. 11 (5) – P.137-149
21. Plant plasma membrane water channels conduct the signaling molecule H2О2 / M. Dynowski [et al.] // Biochemical Journal. – 2008. – Vol. 414. – Р. 53-61.
22. Polesskaya O. G., Kashirina E. I., and Alekhina N. D. Changes in the activity of antioxidant enzymes in wheat leaves and roots as a function of nitrogen source and supply // Russian Journal of Plant Physiology. – 2004. – Vol. 51. P. 615–620.
23. Sairam R.K., Srivastava G.C. Induction of oxidative stress and antioxidant activity by hydrogen peroxide treatment in tolerant and susceptible wheat genotypes // Biologiya plantarum. – 2000 – Vol. 43 (3). – P. 381-386.
24. Rhoads D.M., Umbach A.L., Subbaiah C.C., Siedow J.N. Mitochondrial reactive oxygen species. Contribution to oxidative stress and interorganellar signaling // Plant Physiology. – 2006. – Vol. 141. – P. 357–366.
25. Rodrigo Miranda Moraes, Marília Carvalho, Fernanda Carlota Nery, Plinio Rodrigues Santos Filho, Marina Lima Nogueira, Sandro Barbosa. Effects Of Hydrogen Peroxide On Initial Growth And Enzymatic Antioxidant System Of Lactuca Sativa L (Asteraceae) // Pakistan Journal of Botany. –·2018 –Vol. 50(5). – P. 1769–1774.
26. Rogozhin V.V., Kurilyuk T.T., Kershengolts B.M. Method for determination of malondialdehyde concentration by thiobarbituric acid. Patent of Russian Federation. – No. 2112241. – 1998 (in Russian).
27. Choudhury S., Panda P., Sahoo L., Panda S.K. Reactive oxygen species signaling in plants under abiotic stress // Plant Signaling & Behavior. – Vol. 8. – 2013. – P. 23681–23686.
28. Neill S., Desikan R., Hancock J. Hydrogen peroxide signaling // Current Opinion in Plant Biology. – Vol. 5. – 2002. – P. 388–389.
29. Sanders Junglee, Laurent Urban, Huguette Sallanon, Félicie Lopez-Lauri. Optimized Assay for Hydrogen Peroxide Determination in Plant Tissue Using Potassium Iodide // American Journal of Analytical Chemistry. – 2014. –  Vol. 5. – P. 730-736.
30. Sinha, A.K. Colorimetric assay of catalase. Analytical Biochemistry. –  1972. –  Jun. 4(2). – P. 389-394.
31. Gechev T., Gadjev I., Van Breusegem D. Inzé F., Dukiandjiev S., Toneva  V. Minkov I. Hydrogen peroxide protects tobacco from oxidative stress by inducing a set of antioxidant enzymes // Cellular and Molecular Life Sciences. – Vol. 59. – 2002. P. 001–7.
32. Santhy V., Meshram M., Wakde P., Vijaya Kumari R. Hydrogen peroxide pre-treatment for seed enhancement in Cotton (Gossypim hirsutum L.) // African Journal of Agricultural Researchol. –19 June, 2014. – Vol. 9(25). – Pp. 1982-1989.
33. Xu S, Li J, Zhang X, Wei H, Cui L. Effects of heat acclimation pretreatment on changes of membranelipid peroxidation, antioxidant metabolites, and ultrastructure of chloroplasts in two cool-season turfgrass species under heat stress // Environmental and Experimental Botany. – Vol. – 2006. – Vol. 56. P. 274–285.
34. Yan Wang, Jie Zhang, Jian-Long Li, Xin-Rong Ma. Exogenous hydrogen peroxide enhanced the thermotolerance of Festuca arundinacea and Lolium perenne by increasing the antioxidative capacity // Acta Physiol Plant. – 2014.  – Vol. 36. P. 2915–2924.