ПОЛИМЕРНЫЕ ФОРМЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И ИЗДЕЛИЙ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ НАТУРАЛЬНОГО ШЁЛКА

АННОТАЦИЯ

Разработан способ разделения натурального шелка на серицин и фиброин посредством предварительной очистки волокон от жиро-восковых и минеральных примесей с последующим гидролизом в среде воды при высокой температуре и давлении. Определены аминокислотные составы чистого серицина и фиброина. Посредством повторного гидролиза чистого фиброина в водной среде при высокой температуре с использованием УЗ-диспергирования и СВЧ-облучения получены функционализированные пористые гемосорбенты с высокой сорбционной активностью. Сорбционная активность гемосорбента определена в модельных системах витамина В₁₂ и крови и сыворотки крови человека. Показана конкурентность полученных гемосорбентов с промышленным гемосорбентом «Симплекс ЕК» на основе активированного угля.

ABSTRACT

A method has been developed for separating natural silk into sericin and fibroin by pre-cleaning the fibers from fat-wax and mineral impurities, followed by hydrolysis in water at high temperature and pressure. The amino acid compositions of pure sericin and fibroin were determined. By repeated hydrolysis of pure fibroin in an aqueous medium at high temperature using ultrasonic dispersion and microwave irradiation, functionalized porous hemosorbents with high sorption activity were obtained. The sorption activity of the hemosorbent was determined in model systems of vitamin B₁₂ and human blood and serum. Competitiveness of the obtained hemosorbents with the industrial hemosorbent Simplex EK based on activated carbon is shown.

Ключевые слова: натуральный шёлк, серицин, фиброин, гидролиз, лекарственных средств, медицинская изделия, аминокислотный состав

Keywords: natural silk, sericin, fibroin, hydrolysis, drugs, medical products, amino acid composition

Введение

Известно, что натуральный шёлк за счёт органотропности, низкой токсичности и отсутствия отрицательных воздействий на организм фрагментов биоразложения применяется в практической медицине [1].

В частности, кручёные и плетённые нити на основе натурального шёлка без и с атравматическими иглами уже давно широко применяются в хирургической практике [2]. Так же известны жгуты, салфетки из натурального шёлка, применяемые в медицинской практике [3].

Наличие сырьевой базы и белковая природа натурального шёлка, возможности химической их модификации позволяют создать ряд новых полимерных форм лекарственных средств и изделий медицинского назначения на его основе [4,5].

В данном сообщении представлены результаты исследований, проводимых в Институте химии и физики полимеров Академии Наук Республики Узбекистан в направлении создания новых форм лекарственных средств и изделий медицинского назначения на основе производных натурального шелка [6-11].

Экспериментальная часть

Материалы и методы

В качестве объектов исследований были выбраны шелковые нити, некондиционные коконы шелкопряда Bombyx mori и волокнистые отходы переработки шелка фирмы OOO Inter Silk Pro. Основные используемые реактивы приобретены у фирмы Sigma-Aldrich: спирт этиловый (96.0%, кат. № 1.59010), HCl (37.0%, кат. № Н1758), бензол (99.9%, кат. № 270790), витамин B₁₂ (98.0%, кат. № V6629), LiCl (98.0%, кат. № 203637, диметилформамид (99.8%, кат. № 227056), CaCl₂ (99.99%, кат. № 499609), гель додецилсульфат–полиакриламид натрия (4–12%, 10 × 10 см, кат. № PCG2003); для получения дистиллированной воды использовали дистиллятор DZ-10L11 фирмы Huanghua Faithful Instrument Co., LTD. Очистку шелковых нитей и волокнистых отходов от жиро-восковых и неорганических примесей осуществляли посредством последовательной обработки бензолом и смесью этанол–дистиллированная вода при соотношении 70:30 (об%) трехкратно в течение 1 ч при температуре 50°С. Степень чистоты шелковых нитей и волокнистых отходов, определенная по методу ГОСТ 5556-81 составила 99.8% [12].

С целью удаления водорастворимого серицина из структуры шелковых нитей образцы выдерживали в течение 24 ч в воде при температуре 110°С и давлении 0.143 МПа. Аминокислотный состав серицина и фиброина шелка определяли на приборе Agilent 6400 Series Triple Quadrupole LC/MS Systems (Shimadzu) методом, представленным в сообщении A. Steven и D. Cohen [13].

С целью повышения сорбционной активности фиброина и получения гемосорбента проведен его повторный гидролиз в воде при температуре 130–230°С и давлении 0.145–0.60 МПа с последующим ультразвуковым диспергированием на приборе УЗДН-1, У-4,2 (ООО НПП «Укрросприбор») в течение 1–15 мин с последующим сверхвысокочастотным облучением на СВЧ-установке УОМО-Т150 (ООО «Специнтех»).

Рентгеноструктурный анализ гемосорбента проводили на приборе Miniflex600 (Rigalku) при 40 кВ и силе тока 15 мА в интервале 2θ, равном 5–44°. Расчет степени кристалличности (СК) проводили по оценке интенсивности максимального пика и по формуле:

где  I_к и I_a — интенсивности кристаллического рефлекса и аморфного рассеяния соответственно, K — поправочный коэффициент. Размер кристаллитов определяли по формуле Шеррера:

где L — эффективный размер кристаллита (Å); λ = 1.5418 Å — длина волны; 2θ — брэгговский угол (град); k — коэффициент, зависящий от формы кристаллита, k = 0.9; β — ширина полувысоты пика (град). Характеристическую вязкость фиброина и гемосорбента на его основе определяли вискозиметрическим методом в 2.5 М растворе LiCl, в диметилформамиде при 25°С. Молекулярная масса фиброина рассчитана по уравнению Марка–Куна–Хаувинка с использованием параметров K = 1.23·10–3, α = 0.91, величины которых зависят от природы полимера, растворителя и температуры [14]. Также молекулярную массу фиброина определяли электрофоретическим методом [15]; при этом водный раствор фиброина был разделен по методике [16] на 6 фракций, различающихся молекулярной массой. Для определения молекулярной массы 130 мг фиброина в растворителе, содержащем 389 мг CaCl2, 388 мкл этилового спирта и 544 мкл дистиллированной воды, перемешивали 5 ч до полного растворения фиброина. Раствор центрифугировали на центрифуге Cenlee 20K (Hunan) в течение 20 мин при 8000 об·мин–1. Центрифугат диализовали через полупроницаемую целлюлозную мембрану (8–14 кДа) [5]. Молекулярную массу раствора фиброина измеряли электрофорезом на многоцелевой системе электрофореза EW-28571-02 (Cole-Parmer) в геле додецилсульфат–полиакриламид натрия. Степень чистоты фиброина, определяли УФ-спектроскопическим методом. Оптические спектры поглощения растворов были зарегистрированы на приборе Specord М210 (Analytic Jena) в диапазоне длин волн 200–900 нм, где длина оптической пути составляла 2 мм. Сорбционные свойства гемосорбента по отношению к витамину В₁₂ изучали в статических условиях при комнатной температуре [17]. К навеске образца чистого фиброина и гемосорбента на его основе (1.0000 ± 0.0002 г) добавляли 25 мл водного раствора витамина В12 концентрацией 0.50 ± 0.02 мг·мл–1. Концентрацию сорбата в растворе определяли через 60 мин методом УФ-спектроскопии до и после проведения сорбции при длине волны 360 нм в кювете толщиной 10 мм. Содержание в гидролизованном фиброине карбоксильных и аминогрупп определяли потенциометрически по методике [18], объем пор —методом ГОСТ 17219–71 [19].

Результаты и обсуждения

Исследования начаты в направлении разработки новых способов и технологий разделения натурального шёлка на её составные компоненты серицин и фиброин.

В настоящее время известны способы разделения натурального шёлка на серицин и фиброин, посредством его гидролиза в щелочных и кислых средах [20]. Известные методы позволяют получить чистый фиброин и серицин с последующей их очистки от сопутствующих их примесей по многостадийной и энергозатратной технологии.

Сущность разработанного способа и технологии производства чистого фиброина и серицина заключалось в предварительной последовательной промывке шёлковых нитей от жиро-восковых и неорганических примесей полярными и неполярными растворителями, с последующим гидролизом, очищенных шёлковых нитей в среде дистиллированной воды в замкнутой системе при высокой температуре 110°С и давлении 0.145 МПа.

Полученный чистый гидролизат серицина концентрировали посредством вакуум-выпарки и осаждали в ацетоне. Выход чистого серицина составил 29,8%. Отфильтрованный из гидролизата чистый фиброина промывали водой, сушили при температуре 80±3°С, который использовали для дальнейших исследований.

Аминокислотный состав чистого серицина определяли на аминокислотном анализаторе MembraPure ARACUS advanced (Германия), результаты, которых представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Аминокислотный состав серицина

Примечание: ^*гидрофилные аминокислоты, ^**гидрофобные аминокислоты, ^***ароматические аминокислоты

Наличие в структуре водорастворимого чистого серицина заменимых и незаменимых аминокислот, позволяет их использовать в медицинской практике в качестве энтеросорбента для детоксикации организма.

С целью исследования возможности получения гемосорбента для детоксикации крови и сыворотки крови чистый фиброин, подвергали повторному гидролизу в среде чистой воды в замкнутой системе при температуре 130-230 °С и давлении 2-6 МПа. Продукт гидролиза фильтровали, промывали водой и сушили при температуре 82±3°С. В образцах повторно гидролизованного фиброина определён аминокислотный состав, который представлен в таблице 2.

Таблица 2.

Аминокислотный состав фиброина

Примечание: ^*гидрофилные аминокислоты, ^**гидрофобные аминокислоты, ^***ароматические аминокислоты

Как видно из таблицы 2 аминокислотный состав гидролизованного фиброина, определенный на приборе ВЭЖХ Agilent 6400 Series Triple Quadrupole LC/MS Systems (Shimadzu) близка к теоретическим значениям аминокислотного состава фиброина.

Далее молекулярная масса фиброина определена вискозиметрическим методом. Определение характерической вязкости растворов фиброина проводили в вискозиметре Уббелоде со временем истечения растворителя t₀=120 сек в 2,5 М растворе LiCl*диметилформамид (ДМФА). Экспериментально характерическую вязкость определяли методом двойной графической экстраполяции величин η_уд/с и ln(η_отн/с) к нулевой концентрации. При этом получались линейные зависимости приведенной вязкости η_уд/с и логарифмической вязкости ln(ɳ_отн/с) от концентрации, которые описываются уравнениями Хаггинса и Кремера. Расчитана среднемолекулярная масса фиброина, полученного разработанным методом, [η]=K_*M^α для раствора фиброина в 2,5 М растворителе LiCl*ДМФА K=1,23_*10^-3 α=0,91 [21]. Молекулярная масса фиброина равна M_η≈340 КДа.

Сорбирующая активность полученных гидролизованных образцов фиброина оценивали, используя в качестве модели витамин В₁₂. Количество сорбированного витамина В₁₂ определяли фотометрическим способом [17]. Использование В₁₂ позволяет предварительно оценить сорбционную активность гидролизованного фиброина вместо сложного дорогостоящего медико-биологического способа. Фиброин, очищенный от серицина, подвергался гидротермической деструкции в среде воды при высокой температуре и давлении. В процессе гидролиза в результате разрыва пептидных связей образуются свободные аминокислоты, фракции олиго фиброина с различной молекулярной массой. Механизм гидротермической деструкции фиброина показан на рисунке 1 [22].

Рисунок 1 Гидротермическая деструкция фиброина

Как видно из рисунка 1, в результате разрыва пептидных связей в процессе гидролиза образуются свободные карбоксильные и аминогруппы.

С целью повышения сорбционной активности гидролизованный фиброин подвергали модификации под воздействием физических факторов, как ультразвуковое (УЗ) диспергирование и сверхвысокочастотное облучение (СВЧ).

Для увеличения сорбционной активности волокнистых гемосорбентов проведены исследования возможности увеличения содержания карбоксильных и аминогрупп в структуре сорбентов с одновременным увеличением объёма их пор методом УЗ-диспергирования и СВЧ-облучения в процессе их гидролиза в водной среде.

Нами проведены исследования влияния УЗ-диспергирования гидролизованного фиброина при 40 Гц, результаты которых представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Влияние времени УЗ-диспергирования на выход, размер частиц, и сорбцию витамина В₁₂

Примечание: исходная концентрация витамина В₁₂ 180 мг/мл

Как видно из таблицы 3, в зависимости времени УЗ диспергирования гидролизованного фиброина меняется размер частиц и выход продукта. С увеличением времени процесса УЗ-диспергирования показатели сорбции гидролизованного фиброина снижаются. Это объясняется тем, что полости, образующиеся в результате вымывания аморфных частей фиброина при гидролизе, закрываются за счет равномерного расположения кристаллических частей фиброина.

Далее гидролизованный фиброин после УЗ-диспергирования подвергали СВЧ-облучению. В результате СВЧ-облучения был получен волокнистый гемосорбент с высокими сорбционными свойствами. Полученные данные представлены на таблице 4.

Таблица 4.

Зависимость сорбции витамина В₁₂ от времена СВЧ-облучения

Примечание: сверхвысокочастотному облучение 2450 Мгц и мощность 800 Вт, исходная концентрация витамина В₁₂ 180 мг/мл.

Установлено, что СВЧ-облучение гемосорбентов способствует увеличению объёма их пор за счёт взрывного механизма удаления воды из структуры элементарных волокон фиброина. Установлено, что сорбционная активность фиброина, модифицированного под воздействием физических факторов (УЗ-диспергирование и СВЧ-облучение) составляет 95% по отношению к витамину В₁₂.

Схема модификации гидролизованного фиброина с использованием УЗ-диспергирования и СВЧ-облучения представлены на рисунок 2 [22].

Рисунок 2. Схема модификации гидролизованного фиброина с использованием УЗ-диспергирования и СВЧ-облучения

Как видно из рисунка 2, при УЗ-диспергировании степень набухания волокна фиброина в водной среде повышается. В этом процессе вода проникает во внутренние слои волокна. Затем с помощью СВЧ-облучения, УЗ-диспергированного фиброина, при напряжении 800 Вт и частоте 2450 МГц осуществлена повторная модификация при СВЧ-облучении набухающих образцов фиброина молекулы воды, переходят в пар, и за счет разрыва волокон образуют поры. В образованных порах также формируется функциональные карбоксильные и амино группы в свободном состоянии. Путем модификации гидролизованного фиброина под воздействием УЗ-диспергировании и СВЧ-облучения были получены полифункциональные волокнистые гемосорбенты с высокими сорбционными свойствами.

При определении содержания свободных карбоксильных и амино групп, образующихся в результате разрыва пептидных и водородных связей при модификации гидролизованного фиброина физическими факторами, по вышеуказанной методике, установлено, что гемосорбент, полученный путем воздействием физических факторов имел объем пор в 3-4 раза выше, чем при термическом гидролизе фиброина в водной среде. Установлено, что содержание свободных карбоксильных и аминогрупп в гемосорбенте, полученных действием УЗ-диспергировании и СВЧ-облучения соответственно составил 14,2 и 12,82 %.

Молекулярная масса гемосорбента на основе гидролизованного и модифицированного фиброина была определена вискозиметрическим методом [21]. По результатам было установлено, что в процессе модификации молекулярная масса гемосорбента уменьшается. Вискозиметрическим методом установлено, что средняя молекулярная масса гидролизованного фиброина составляет М_η≈230000. Далее, для определения молекулярной массы 0,1% водный раствор волокнистого полифункционального гемосорбента исследовали методом электрофореза. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Результаты ММ, гемосорбента определенные электрофорезом

Как видно из таблица 5, гемосорбент, на основе гидролизованного фиброина, полученный под воздействием физических факторов, состоит из фрагментов фиброина с различной молекулярной массой. Это происходит за счет разрыва связей, в макромолекулах в процессе модификации.

Структуры чистого фиброина шелка и гемосорбента полученного на его основе были исследованы методом рентгеноструктурного анализа. Полученные результаты представлены на рисунке 3 [22].

Рисунок 3. Рентгеновские спектры: 1 – чистого фиброина, 2 – гемосорбента на его основе

Степень кристалличности чистого фиброина составляет 46,1 %. Высокая кристалличность фиброина является результатом вымывания из аморфных частей из межплоскостных участков кристаллических слоев.В процессе получения гемосорбента на основе чистого фиброина степень кристалличности снижается до 38,1 %, что объясняется амморфизацией структуры гемосорбента.

Таблица 6.

Показатели дифракции рентгеновских лучей фиброина
и гемосорбента на его основе

Как видно из экспериментальных данных (таб. 6 и рис. 3), при выделении фиброина из шелка происходит увеличение степени кристалличности, которое может быть связано с переходом α-спирали в β-структуру под действием высокой температуры и давления. Степень кристалличности гемосорбента еще в больщей степени снижалось при его УЗ-диспергировании и СВЧ-облучении.

Для определения развернутых показателей крови аликвоты цельной крови человека были изучены, как до сорбции, так и после проведения гемосорбции в анализаторе ВС-3000 (Mindray, P.R.China).

Результаты проведенных исследований показали, образцы гемосорбента, в той или иной степени, абсорбируют клеточные элементы цельной крови человека (табл. 7) и белки, липиды, билирубин крови, глюкозу и мочевину (табл. 8).

Таблица 7.

Показатели крови человека до и после проведения сорбции через гемосорбента (n = 3, M ± m)

Примечание: по сравнению с показателями крови в норме без использования гемосорбента: *Р≤0,002, **Р≤0,0001

Таблица 8.

Показатели белковых, липидных и биллирубиновых фракций крови человека до и после проведения сорбции через различные объемы гемосорбента (n = 3, M ± m)

Примечание: по сравнению с показателями сыворотки крови в норме без использования гемосорбента: *Р>0,05, **Р≤0,05

Показатели, приведенные в табл. 7 демонстрируют, что объём гемосорбента 0,2-0,6 мл³ статистически значимо (Р≤0,0001) абсорбирует тромбоциты, лейкоциты, лимфоциты, смесь моноцитов, базофилов и эозонофилов. Абсорбция эритроцитов относительно низкая. На количество гемоглобина и гематокрит воздействие гемосорбента незначителен. Следует отметить, что гемосорбент объемом 0,2-0,3 мл³ абсорбирует белковые и липидные фракции в районе статистической погрешности. Кроме того, при пропускании цельной крови через объёмы гемосорбента выше 300 мл³ приходилось задействовать поршни шприцов с целью продавливания крови через объемы гемосорбента, в то время как через гемосорбент объёмом 0,1-0,3 мл³, цельная кровь проходила самотёком. В этой связи сыворотка крови, пропущенная через объём гемосорбента более 0,3 мл³, имел гемолиз в той или иной степени, а потому показатели по фракциям билирубина в этих сыворотках нельзя учитывать. Статистически значимая адсорбция мочевины и глюкозы наблюдалось при использовании гемосорбента объемом 0,3 мл³.

Таким образом, гемосорбент, как сорбент наиболее активен в объёмах 0,2-0,3 мл³ с плотностью 0,09-0,1 г/мл³.

Сорбционные свойства гемосорбента «Гемосорб» на основе фиброина, полученного УЗ-диспергированием с последующим СВЧ-облучением, сравнивали с известным угольным гемосорбентом “Симплекс-ЕК” (Россия). Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9.

Сравнительные показатели гемосорбента «Гемосорб» полученного из фиброина шелка и промышленного угольного гемосорбента “Симплекс-ЕК”

Как видно из таблицы, разработанный гемосорбент, полученный в оптимальных условиях на основе гидролизованного в водной среде фиброина шелка, имеет большую сорбционную активность по сравнению с промышленным угольным сорбентом.

Выводы

1. Разработан способ получения натуральных шелковых волокон, не содержащих жиро-восковые примеси и неорганические соединения, путем обработки волокнистых отходов предприятий по переработке натурального шелка и коконов полярными и неполярными органическими растворителями.
2. Путем гидролиза очищенных из примесей образцов натурального шелка в водной среде при высокой температуре и давлении были получены образцы серицина и фиброина высокой степени чистоты и определены их аминокислотные составы. Химическими и физико - химическими методами доказано образование пор в результате гидролиза чистого фиброина в водной среде при температуре 210 °С и давлении 2,02 МПа, с последующим их ультразвуковым диспергированием при 40 Гц и сверхвысокочастотным облучением при 2450 МГц, что привело к образованию дополнительных реакционно активных карбоксильных и аминных функциональных групп в порах;
3. По результатам проведенных исследований получен гемосорбент “Гемосорб” с высокой сорбционной активностью, определены его состав, структура, сорбционная способность.
4. На основании результатов исследований установлено увеличение сорбционной активности продуктов реакции в ряду фиброин-гидролизованный фиброин-модифицированный фиброин, что объясняется изменением их физической структуры и содержанием реакционно активных функциональных групп;
5. На основании сорбционных исследований доказано, что полученный гемосорбент имеет высокие сорбционные показатели и значения пористости, показано, что 1 г гемосорбента способен сорбировать 7,6 мг витамина В₁₂;
6. Медико-биологические свойства гемосорбента были апробированы в модельных системах, в крови и сыворотках крови человека. По результатам исследований показана их конкурентоспособность с импортными сорбентами на основе активированного угля.

Список литературы:

1. Е.С. Сашина, А.Ю. Голубихин, А.И. Сусанин Перспективы получения новых биоматериалов на основе фиброина // Химические волокна. - 2015. - № 4. - С. 34-39.
2. Морозов А.М. и др. Возможности разработки нового биологически активного шовного материала в хирургии (обзор литературы). // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. – 2019. Т. 12, №3. –С. 193-198.
3. Агапова О.И., Агапов И.И. Биодеградируемые изделия на основе фиброина шелка для тканевой инженерии и регенеративной медицины // Москва «Техносфера» -2018. -125 c.
4. Hai­Yan W., Yu­Qing Zh., Zheng­Guo W. Dissolution and processing of silk fibroin for materials science // Crit. Rev. Biotechnol. 2021. V. 41. N 3. P. 406–424.
5. Сафонова Л. А., Боброва М. М., Агапова О. И., Архипова А. Ю., Гончаренко А. В., Агапов И. И. Пленки на основе фиброина шелка для заживления полнослойной раны кожи у крыс // Вестн. трансплантологии и искусств. органов. 2016. Т. 18. № 3. С. 74–84.
6. Сарымсаков А.А., Ярматов С.С., Эшчанов Х.О. Полифункциональные гемосорбенты на основе волокнистых отходов натурального шелка// Узбекский химический журнал. 2019. -№ 3. - С. 67-75.
7. Ярматов С.С., Сарымсаков А.А., Рашидова С.Ш. Комплексная переработка некондиционных коконов и волокнистых отходов шелка при получении оригинальных полифункциональных гемосорбентов// Журнал Доклады академии наук Республики Узбекистан. 2019. -№4, - С. 36-42.
8. Ярматов С.С., Сарымсаков А.А. Полифункциональный гемосорбент на основе фиброина шелка// Фармацевтический журнал. 2020. -№1. - С. 43-48.
9. Sarimsakov A.A., Yarmatov S.S., Khegay L.N. Sericin and polyfunctional hemosorbent from natural silk fibers// Scientific journal of Samarkand state university. 2020. – V. 5(123). - pp. 88-95.
10. Ярматов С.С., Сарымсаков А.А. Получение полифункционального гемосорбента из волокнистых отходов натурального шелка, и его сорбционная активность по отношению к витамину B₁₂// Universum: химия и биология: электрон. научн. журн. 2021. -№ 9 (87). - С. 39-46.
11. Yarmatov S., Sarimsakov A., Khegay L., Shadmanov A. and Ergasheva Z. Adsorption properties of hemosorbent based on hydrolyzed natural silk fibroin// Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology. 2021. -V. 22 (71&72). -pp. 201-207.
12. ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
13. Steven A., Cohen Daviel J. Amino acid analysis utilizing phenylisothiocyanata derivatives // Jour. Analytical Biochemistry – 1988. – V.17.-№1.-P.1-16.
14. Pawcenis D., Syrek M., Koperska M. A., Łojewski T., Łojewska J. Mark-Houwink-Sakurada coefficients determination for molar mass of silk fibroin from viscometric results // RSC Adv. 2016. V. 6. P. 38071–38078.
15. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. С. 56–59.
16. Aoki M., Masuda Y., Ishikawa. K., Tamada Y. Fractionation of regenerated silk fibroin and characterization of the fractions // Molecules. 2021. V. 26. P. 6317–6343.
17. Veprikova E. V., Ivanov I. P., Chesnokov N. V., Kuznetsov B. N. Study of enterosorption activity of carbon sorbents based on organosolvent lignin of fir wood // J. Sib. Fed. Univ. Chem. 2018. V. 11. N 2. P. 249–261.
18. Аввакумова Н. И., Бударина Л. А., Дивгун С. М., Заикин А. Е., Кузнецов Е. В., Куренков В. Ф. Практикум по химии и физике полимеров. М.: Химия, 1990. С. 57–58.
19. ГОСТ 17219-71. Угли активные. Метод определения суммарного объема пор в воде
20. Патент RU 2385649. Очилова Р.Х. Способ получения серицина и фиброина. 2010. Бюл. № 107.
21. Холмуминов А.А. Ориентационное структуробразование фиброина шелка с анизотропными свойствами в растворах: Дисс... физ.-мат. наук. –Т. ИХФП АН РУз. 2008. -258 с.
22. Sarymsakov A.A., Yarmatov S.S., and Yunusov Kh.E. Preparation and Physicochemical Properties of a Hemosorbent Derived from Bombyx mori Cocoon Fibroin // Russian Journal of Applied Chemistry, 2022, Vol. 95, No. 7, pp. 988–995.