ОЦЕНКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ПРИРОДНЫХ ОБРАЗЦОВ ПРИАРАЛЬЯ

АННОТАЦИЯ

В работе изучена ферментативная активность 44 галотолерантных гриба и 22 галотолерантной бактерии, выделенных их засоленных источников с территории Приаралья. Установлено, что 6 грибов характеризуются значимой амилолитической, 8 - целлюлазной и 1 – фосфатмобилизующей активностью. При этом 2 изолята (ASP14, Penicillium ASP16) представляют особый интерес для дальнейшего исследования, как активные продуценты гидролитических ферментов. Большинство (18 из 22) бактериальных культур обладали протеазной активностью, 14 – амилазной и 3 - уреазной активность, однако уровень активности всех ферментов невысокий. 9 культур были способны к фосфатмобилизации.

ABSTRACT

The work studied the enzymatic activity of 44 halotolerant fungi and 22 halotolerant bacteria isolated from saline sources from the territory of the Aral Sea region. It was established that six fungi are characterized by significant amylolytic, eight - cellulase and one - phosphate mobilizing activity. At the same time, two isolates (ASP14, Penicillium ASP16) are of particular interest for further research as active producers of hydrolytic enzymes. Most (18 out of 22) bacterial cultures had protease activity, 14 - amylase and three - urease activity, but the level of activity of all enzymes is low. Nine cultures were capable of phosphate mobilization.

Ключевые слова: Приаралье, галотолерантность, грибы, бактерии, ферментативная активность, фосфатмобилизующая активность.

Keywords: Aral Sea region, halotolerance, fungi, bacteria, enzymatic activity, phosphate solubilizing activity.

Введение

Промышленные ферменты, используемые в биопереработке, относятся к техническим ферментам. В 2010 году их стоимость превысила 1 миллиард долларов, и ожидалось, что к 2021 году она вырастет до 5,0 миллиардов долларов со скоростью 4,0% в год [1]. Однако, в 2018 году затраты на технические ферменты достигли 5,5 миллиардов долларов, а в настоящее время несколько исследовательских ассоциаций спрогнозировали, что к 2023 году они достигнут 7,0 миллиардов долларов [2]. Кроме того, в отчете отмечается, что мировой рынок специальных ферментов (включая экстремозимы) в 2018 году достиг 4,0 миллиарда долларов. Эти данные открывают перед исследователями новые возможности для удовлетворения постоянно растущего спроса ферментов на мировом рынке, и экстремозимы являются лучшими кандидатами для изучения [3].

Экстремозимы могут быть получены из экстремофильных микроорагнизмов, способных выдерживать самые разные условия среды обитания, включая высокие и низкие температуры и рН, повышенное засоление, радиацию, низкое содержание влаги и т.п. Галофильные микроорганизмы, распространенные в засоленных средах обитания, представляют перспективный объект исследований с целью дальнейшего использования их биотехнологического потенциала. Ферменты и ферментативные комплексы галофильных и галотолерантных микроорганизмов могут найти применение в различных отраслях народного хозяйства, включая программы переработки отходов и ремедиации земель для сельского хозяйства, кожевенное производство, текстильную промышленность и другие.

Экспериментальная часть

Объектом данного исследования явились галофильные и галотолерантные грибы и бактерии, выделенные ранее [4, 5] из воды Аральского моря, растений-галофитов, почв Приаралья, включая слабозасоленную ризосферу галофитов и сильнозасоленные участки без растений.

Определение амилолитической активности грибов и бактерий

В среду Питательный агар (для бактерий) и агар Чапека-Докса (для грибов) добавляли растворимый крахмал 1%. Далее наносили каждый исследуемый изолят на поверхность плотной среды в чашки Петри, инкубировали при 30-35°С в течение 48 ч и для визуализации эффекта покрывали поверхность раствором йода (йод – 5 г; йодида калия – 10 г; дистиллированной воды – 100 мл) [6]. При использовании разводили реактив дистиллированной водой в соотношении 1:10.

Целлюлолитическая активность грибов

Активность целлюлазы изучали на среде, содержащей: КH₂PО₄ – 7.0 г/л, K₂HPO₄ - 2.0 г/л, МgSО₄ 7H₂O - 0,1 г/л, (NH4)2SO4 - 1.0 г/л, дрожжевой экстракт - 0.6 г/л, карбоксиметил целлюлозы (КМЦ) - 10 г/л и агар 15-20 г/л) [7]. В конце инкубационного периода культуры выдерживали при 50 °C в течение 16 ч для ускорения действия фермента [8]. Затем культуры заливали 5 мл раствора йода и промывали дистиллированной водой для визуализации зоны гидролиза.

Изучение протеолитической активности бактериальных изолятов

Состав среды в г/л: желатина − 30,0; агар – 15,0; панкреатический гидролизат казеина – 10,0; NaCl – 10,0. В чашки Петри с готовой средой делали высевы по одной петле каждого изолята по поверхности желатиново-агаровой среды. Инкубировали чашки при 30-35°С в течение 4-7 сут, после инкубации заливали поверхность агара раствором (NH₄)₂SO₄ и выдерживали в течение 5-10 мин.

Изучение способности бактериальных изолятов гидролизовать мочевину

Способность к биосинтезу уреазы исследовали на среде следующего состава, г/л: мочевина − 20,0; дрожжевой экстракт – 0,1; Na₂HPO₄ – 9,5; K₂HPO₄ – 9,1; феноловый красный – 0,01. Готовую среду разделяли на порции по 1,5 – 3 мл в стерильные тест пробирки и инокулировали исследуемыми микроорганизмами. После инкубации пробирок до 48 ч при 30-35°C анализировали изменение цвета среды. Красное или вишнёвое окрашивание указывают на наличие, а желтое − на отсутствие у культуры уреазной активности.

Фосфатмобилизующая активность грибов и бактерий

Фосфатмобилизующую активность измеряли путем посева штаммов на среду Пиковской с последующей инкубацией при 30°C в течение 5 дней (для бактерий) и 7-10 дней (для грибов) [9]. Состав среды Пиковской: 0,5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л глюкозы, 5 г/л Ca3(PO4)2, 0,5 г/л (NH4)2SO4, 0,2 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 0,1 г/л MgSO4•7H2O, 0,025 г/л бромфенолового синего, 0,002 г/л FeSO4•7H2O, 20 г/л агара, рН среды 7,0. Наличие прозрачной зоны вокруг колонии означает, что изолят растворяет фосфаты.

Результаты и обсуждения

Исследование физиологической активности микроорганизмов в экстремальных состояниях может дать импульс к созданию новых биопрепаратов и совершенствованию технологий получения широкого спектра ценных биологически активных соединений. В этой связи особенно интересны экотопы с экстремальными условиями, формирующие уникальные биоценозы микроорганизмов-экстремофилов, прежде всего – галофильные сообщества. Однако, биотехнологический потенциал галофилов не раскрыт достаточно полно [10].

В этой связи нами был проведен скрининг ферментативной и фосфатмобилизующей активности местных галофильных и галотолерантных микроорганизмов, выделенных ранее из природных образцов Приаралья и Аральского моря. Работа выполнена в рамках фундамен-тального проекта А-ФА-2021-428. Исследования проводили, добавляя в соответствующие питательные среды специфические субстраты и оценивая зоны просветления или изменения цвета.

В ходе работы изучены некоторые биологические свойства 44 галотолерантных грибов и 22 галотолерантных бактерий. Первичную оценку активности ферментов галотолерантных микроорганизмов производили, оценивая диаметр зоны просветления среды с субстратом относительно диаметра колонии культуры (1- слабая, 2 – умеренная, 3- значимая активность).

Как видно из данных, представленных на рисунке 1 большинство грибных культуры способны к разложению крахмала и микрокристаллической целлюлозы (33 и 34 изолята или 75% и 77% соответственно), 35 изолятов (ок. 80%) были способны к растворению фосфатов, при этом 21 культура (ок. 48%) обладала всеми тремя видами активности в разной степени. Значимая амилолитическая активность отмечена для 6 грибов, целлюлазная для 8 и фофсатмобилизующая для 1 культуры. При этом следует обратить внимание на изоляты Alternaria ASS7, Aspergillus ASS16, Aspergillus ASS19, ASS18, ASP14, Penicillium ASP16, активность которых определена как умеренная и значимая. Наиболее интересными для продолжения исследований являются культуры ASP14, Penicillium ASP16: ASP14 способны к значительному разложению крахмала и КМЦ, а Penicillium ASP16 обладает умеренной амилазной и целлюлазной активностью и единственный среди изученных грибов способен к растворению фосфатов в значительной степени.

Рисунок 1. Некоторые биоактивные свойства галотолерантных грибов

Бактериальные изоляты обладали меньшей ферментативной и фосфатмобилизующей активностью по сравнению с грибами. Как видно из данных, представленных на рисунке 2 большинство бактерий разжижали желатину (18 изолятов или ок. 82%), многие гидролизовали крахмал (14 изолятов или ок. 64%), и лишь три изолята (14%) - Halomonas AS020, AS006 и Ochrobactrum AS011- были способны к разложению мочевины.  9 культур (43%) обладали фосфатмобилизующей активностью. При этом следует отметить, что активность ферментов всех изученных бактерий характеризовалась как слабая, а 2 изолята Halomonas AS017 и Oceanobacillus AS024 не обладали ни одной из изучаемых активностей. 9 изолятов были способны к продукции трех ферментов, 4 из них отнесены к роду Bacillus, а 2 не идентифицированы.

Рисунок 2. Некоторые биоактивные свойства галотолерантных бактерий

Перспектива изучения гидролитических комплексов галотолерантных микроорганизмов оценена в ряде работ [11, 12, 13], авторы которых отмечают важность микробных ферментов с точки зрения адаптации к засоленным и часто высокотемпературным условиям окружающей среды, а также возможность применения гидролитических ферментов для биотехнологии. Так, Яковлева с соавт. [11] отмечает, что ферменты галофильных микроорганизмов имеют преимущество, т.к. некоторые такие культуры можно культивировать в присутствии посторонней микрофлоры, что приводит к снижению затрат на культивирование.

Ruginescu с соавт. отмечают, что среди таксономически идентифицированных изолятов наилучшая гидролитическая активность наблюдалась у галотолерантных бактерий, принадлежащих к роду Bacillus [14].

Chamekh с соавт. [13], изучая внеклеточную продукцию липазы, амилазы, протеазы и целлюлазы галотолерантных грибов, обнаружили, что все штаммы были способны продуцировать по крайней мере один из четырех ферментов, при этом 94% грибов обнаруживали целлюлазную активность.

Таким образом, полученные нами данные, сопоставимы с проведенными раннее исследованиями ферментативной активности галотолерантных микроорганизмов и подтверждают перспективность продолжения исследований в данном направлении для поиска продуцентов гидролаз, устойчивых к стрессовым факторам для биотехнологического применения. 

Заключение

В результате эксперимента показано, что галотолерантные микроорганизмы, выделенные из природных источников Аральского моря и Приаралья, обладают способностью к синтезу внеклеточных гидролитических ферментов. Комплексы энзимов могут играть роль в адаптации микробных клеток к суровым условиям обитания, а также могут иметь важное значение для применения в биотехнологии с целью получения натуральных и экологичных препаратов для сельскохозяйственного и промышленного назначения.

Список литературы:

1. Kuila A., Sharma V. (2017). Lignocellulosic Biomass Production and Industrial Applications. Hoboken, NJ: John Wiley and Sons. doi: 10.1002/9781119323686
2. Global Markets for Enzymes in Industrial Applications. Research Biotechnology. 2018. – Available online at: https: .www.bccresearch.com/market-research/biotechnology/global-markets-for-enzymes-in-industrial-applications-bio030k.html
3. Dumorné K., Camacho Córdova D., Astorga-Eló M., Renganathan P. Extremozymes: a potential source for industrial applications. J. Microbiol. Biotechnol. – 2017. – V. 27. – 649–659. doi: 10.4014/jmb.1611.11006
4. Давранов К.Д., Кондрашева К. В., Эгамбердиев Ф. Б., Кулонов А. И., Гулямова Т.Г. Микромицеты экстремальных зон территории Приаралья, Узбекистан // Universum: химия и биология: электрон. научн. журн. 2022. 8(98). URL: https://7universum.com/ru/nature/archive/item/14131 DOI: 10.32743/UniChem.2022.98.8.14131
5. Кондрашева К. В., Эгамбердиев Ф. Б., Кулонов А. И., Лобанова П. С. Химическая и микробиологическая характеристика образцов воды Аральского моря и почвы Приаралья. Материалы V международной научно-практической конференции «Научные Дискуссии В Условиях Мирового Кризиса: Новые Вызовы, Взгляд В Будущее», г. Ростов-на-Дону, 29 июля 2022 г, с. 262-265.
6. Hankin L., Anagnostakis S.L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia. – 1975. – V. 67. – p. 597–607
7. Abe C.A., Faria C.B., De Castro F.F., et al. Fungi isolated from maize (Zea mays L.) grains and production of associated enzyme activities. Int J Mol Sci. – 2015. – V. 16. – p. 15328–15346
8. Montenecourt B.S., Eveleigh D.E. Semi quantitative plate assay for determination of cellulose production by Trichodermaviride. Appl. Environ. Microb. – 1977. – V. 33. – p. 178–183
9. Simarmata R., Widowati T., Dewi T.K. et al. Isolation, screening and identification of plant growth-promoting endophytic bacteria from Theobroma cacao. Journal of Biology & Biology Education. 2020. – V. 12(2). – p. 155–156
10. Калёнов С.В. Биотехнология и применение микроорганизмов, выделенных из гиперсоленых сред // Диссертацияа на соискание ученой степени доктора технических наук, 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии). – Москва. – 2020. – 588 с.
11. Яковлева А.К., Канарская З.А., Канарский А.В. Перспективы использования галофильных и галотолерантных микроорганизмов в биотехнологии // Вестник Казанского технологического университета. 2017. №8. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/perspektivy-ispolzovaniya-galofilnyh-i-galotolerantnyh-mikroorganizmov-v-biotehnologii (дата обращения: 22.06.2023)
12. Karray, F., Ben Abdallah, M., Kallel, N. et al. Extracellular hydrolytic enzymes produced by halophilic bacteria and archaea isolated from hypersaline lake. Mol Biol Rep 45, 1297–1309 (2018). https://doi.org/10.1007/s11033-018-4286-5
13. R. Chamekh, F. Deniel, Ch. Donot, J-L. Jany, P. Nodet, L. Belabid. Isolation, Identification and Enzymatic Activity of Halotolerant and Halophilic Fungi from the Great Sebkha of Oran in Northwestern of Algeria. Mycobiology, V 47, 2019 - Issue 2, р. 230-241
14. Ruginescu R, Gomoiu I, Popescu O, Cojoc R, Neagu S, Lucaci I, Batrinescu-Moteau C, Enache M. Bioprospecting for Novel Halophilic and Halotolerant Sources of Hydrolytic Enzymes in Brackish, Saline and Hypersaline Lakes of Romania. Microorganisms. 2020 Nov 30;8(12):1903. doi: 10.3390/microorganisms8121903