ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБА Trichoderma asperellum Uz-A4

АННОТАЦИЯ

В ходе поиска новых и биоактивных молекул микробного происхождения для разработки лекарственных препаратов было обнаружено, что грибы Trichoderma asperellum Uz-A4 в целом являются источником новых и биоактивных вторичных метаболитов, имеющих большое значение. В свете вышесказанного изучение низкомолекулярных метаболитов Trichoderma asperellum Uz-A4 представляется актуальным.

ABSTRACT

In the search for new and bioactive molecules of microbial origin for drug development, it was found that Trichoderma asperellum Uz-A4 fungi in general are a source of new and bioactive secondary metabolites of great importance. In the light of the above, the study of low molecular weight metabolites of the Trichoderma asperellum Uz-A4 seems to be relevant.

Ключевые слова: Trichoderma, культуральная жидкость, вторичный метаболит, микроорганизм, антагонист.

Keywords: Trichoderma, culture liquid, secondary metabolite, microorganism, antagonist.

Введение (актуальность, постановка проблемы): ранее уже проводились научно-исследовательские работы по грибу-антагонисту Trichoderma в целях борьбы с патогенными грибами. Данный гриб широко распространен в различных почвах, корнях и лиственной среде. Гриб Trichoderma перспективен для получения промышленных ферментов, фитогормонов, ускоряющих рост растений, антибиотиков для биоконтроля болезней растений, он внес большой вклад в развитие промышленности, сельского хозяйства и производства лекарств [1-3]. Во всем мире грибок Trichoderma доказал свою эффективность в качестве эффективного средства биологической борьбы [4]. Многие виды Trichoderma, такие как T. harzianum, T. hamatum, T. asperellum, T. atroviride, T. koningii, T. virens и T. viride, используются во всем мире в качестве мощных агентов биологической борьбы [2]. Виды грибов Trichoderma демонстрируют отличные способности биоконтроля против патогенных микроорганизмов с помощью косвенных (поиск питательных веществ, изменение условий окружающей среды, стимуляция роста растений и защитных реакций) или прямых (микопаразитизм) механизмов [2]. Кроме того, помимо средового воздействия известно, что гриб Trichoderma может продуцировать вторичные метаболиты, которые не только участвуют в передаче сигнала, но и связываются с различными организмами [4-5]. Кроме того, успех грибов Trichoderma в синтезе биопрепаратов зависит, по крайней мере частично, от их способности высвобождать множество вторичных метаболитов [5]. Грибы играли неотъемлемую роль в открытии лекарств на протяжении всей истории человечества.

В литературе Faul и др. [6] описывают методы разделения и количественного определения различных органических и неорганических компонентов, продуцируемых микроорганизмами, с использованием хроматографических методов. Более глубокое знание строения и количества веществ, присутствующих в микроорганизмах, позволяет объяснить биохимические процессы, используемые в различных биотехнологических процессах. В настоящее время методы хроматографического анализа ГЖХ-МС необходимы для определения органических соединений, продуцируемых грибами Trichoderma. Различные летучие метаболиты грибов Trichoderma были идентифицированы с помощью хроматогифа ГЖХ-МС [7].

Методы исследования: тонкослойную хроматографию (TCX) проводили на пластинках Silufol. Вещества обнаруживали на TCX опрыскиванием 25%-ным этанольным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты с последующим нагреванием в течение 5 мин при 100-110°С.

Для колоночной хроматографии использовали силикагели марки Silpearl и Л, размер частиц 50-100 мкм. Silpearl применяли для разделения метаболитов Trichoderma asperellum Uz-A4. Очистку и разделение продуктов химических превращений проводили на колонках с силикагелем марки Л. Применили следующие системы растворителей: 1) бензол-метанол (10:1); 2) хлороформ-метанол (100:1); 3) хлороформ-метанол (50:1); 4) хлороформ-метанол (20:1).

Масс-спектры и элементные составы ионов измеряли на приборе ГЖХ-МС при ионизирующем напряжении 50 эВ и температуре 100°С.

Экстракция. Trichoderma asperellum Uz-A4, выращенный в среда Чапека, экстрагировали двумя способами. При первом способе мицелий отделяли от водной фазы фильтрацией, сушили, измельчали и экстрактивные вещества извлекали метанолом и этанолом. Водную часть обрабатывали хлороформом, сгущали и остаток объединяли с метанольным экстрактом, т.к. они хроматографически однородны. При втором способе, отделенный от водной фазы мицелий без высушивания обрабатывали эфиром при нагревании с обратным холодильником, при этом способе выход экстрактивных веществ выше. Из водной части обработкой хлороформом получили дополнительно экстракт, который присоединили к эфирному экстракту. В качественном отношении эфирный экстракт, полученный при втором способе, чище, чем метанольный и лучше разделяется.

Выращенный на питательном растворе Манделя (3 л) в течение 14 суток мицелий гриба Trichoderma asperellum Uz-A4 отделили фильтрацией от водной части.

Обработка. Способ 1. К высушенному и измельченному мицелию (15,18 г) приливали 50 мл метанола и оставляли на сутки. Метанол сливали и операцию повторили трижды. Объединенные метанольные извлечения сгущали, остаток сушили под вакуумом. Выход 4,25 г.

Водную часть обрабатывали хлороформом, последний сгущали, сушили. Выход 0,106 г. По ТСХ обе суммы однородны, их объединили (4,25г).

Способ 2. 1) Отфильтрованный мицелий помещали в колбу с 50 мл эфира и нагревали на водяной бане при 40-45 °С . Эфир сливали, операцию повторили трижды. Объединенные эфирные извлечения сгущали, сушили под вакуумом. Остаток 5,65 г. Водную часть обрабатывали хлороформом, последний сгущали, сушили. Выход 1,20 г. Общий вес экстракта 6,58 г.

2) Выращенный на яблоневом шроте (5 кг) гриб Trichoderma asperellum Uz-A4 заливали метанолом (10 л) и оставляли на сутки. Операцию повторили трижды. Объединенные метанольные извлечения сгущали, остаток сушили. Получили 11,55 г сухого экстракта.

Извлечение экстрактивных веществ из выращенного на соломе (5 кг) гриба Trichoderma asperellum Uz-A4 проводили по аналогичной методике, как и в случае с яблоневым шротом. Получено 12,33 г экстракта.

Результаты: Штамм T. asperellum Uz-A4, выращенный в течение 14 дней в среде Манделя из фильтровальной бумаги.(Whatman #1) выделяли биомассу. Отделенную биомассу сушили при комнатной температуре (+40⁰С). Высушенную биомассу измельчали в стеклянной ступке и клетки биомассы раскалывали. Затем его смешивали с этиловым спиртом в соотношении 1:1 и оставляли на шейкере при 150 об/мин на 1 сутки. После фильтрации экстракт сушили в роторной сушилке 40⁰С. Процесс экстракции повторяли 4 раза. Общее количество высушенного экстракта составило 16,5 г. ТСХ в выделенном был размещен. Система 19:1 хлороформ-метанол (рис. 1).

Т. asperellum из биомассы штамма Uz-A4 полученная сумма извлечения с использованием ТСХ определяли показатель R_f. Следующее при определении R_f во всех экстрактах. Аналогичные вторичные метаболиты были выделены из экстрактов (рис. 1). метаболитов. При определении значений R_f было установлено, что R_f-0,53, R_f-0,71, R_f-0,84, R_f-0,92 являются действующими веществами.

Рисунок 1. Тонкослойная хроматограмма экстракционной суммы, полученной из биомассы штамма Т. asperellum Uz-A. (1,2,3,4-производные экстракты)

Для разделения экстракта на фракции использовали колоночную хроматографию. В качестве колонки использовали стеклянную колонку длиной 55 см и диаметром 10 см. Колонку сначала промывали гексаном и загружали в колонку 247 г 100/250 мкм силикагеля L (Chemapol Prana-Чехословакия). 16,18 г экстракта смешивали с 16 г силикагеля, сушили до порошкообразного состояния и помещали в колонку. Экстракт из колонны промывают гексаном, отделяют жирные органические кислоты и углеводороды. В полученных фракциях оставался ТСХ (рис. 2). В то время как гексановые фракции имели несколько точек R_f, также наблюдали образование одиночных точек R_f при дальнейшей промывке.

Рисунок 2. Тонкослойная и газожидкостная хроматография гексановой фракции

Из гексановых фракций ее продолжают промывать до тех пор, пока она не перестанет давать один пик при помещении ТСХ в разные системы. Известно, что гексан, органический растворитель, является относительно слабым растворителем. Целью первой промывки экстракта гексаном является удаление масла из экстракта. Валидационные исследования были выполнены на гексановой фракции в ГЖХ (рис. 2).

ГЖХ-МС колоночного экстракта из гексановой фракции выявил ряд веществ (табл. 1).

Таблица 1.

Метаболиты, идентифицированные из гексановой фракции

При изучении биологических свойств метаболитов, структура которых установлена, основную часть веществ составляют вещества, характерные для эфирной и терпиноидной группа противомикробный, было обнаружено, что они обладают антиоксидантным и противовоспалительным действием [8]. Соединения, принадлежащие к группе октадекановой кислоты противовоспалительное, гипохолестеринемическое, противораковое, гепатопротекторное, нематоцидное, противоэкземное действие, ингибитор 5-альфаредуктазы описаны в ряде публикаций [9]. Установлено, что большинство из 25 метаболитов, выделенных из гексановой фракции, представляют собой низкомолекулярные жирнокислотные вещества. В дополнение к наличию метаболитов жирных кислот присутствуют противогрибковые насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, а противогрибковая эффективность объясняется увеличением длины цепи. Некоторые из выявленных метаболитов используются в качестве перспективных веществ в медицине и косметике.

Фракционирование экстрактов на хроматографической колонке продолжили в хлороформе в качестве элюента после гексана. В хлороформные фракции по разделению веществ добавляли ТСХ. Для LUQX использовали систему хлороформ-метанол 19:1. Собирали фракцию, которая давала один пик на хроматографической пластине, и определяли точки R_f. Точка R_f оказалась равной 0,77 (рис. 3). Вторичные метаболиты во фракции хлороформа были идентифицированы в ГЖХ (рис. 3).

Рисунок 3. Тонкослойная (ТСХ) и газожидкостная (ГЖX) хроматография хлороформной фракции

Летучие метаболиты, обнаруженные на хроматограмме ГЖX в ходе эксперимента, были идентифицированы в базе данных МС (табл. 2).

Таблица 2.

Метаболиты, идентифицированные из фракции хлороформа

Среди летучих метаболитов, идентифицированных в базе данных ГЖХ-MС, ундециленовая кислота, метаболит пентадекановой кислоты Myrothecium verrucaria, Saccharomyces cerevisiae [10], метаболит гептадекановой кислоты Botrytis cinerea, Cladosporium cucumerinum, Fusarium oxysporum, Phytophthora infestans, Pythium aphanidermatum, Sphaerotheca fuliginea [1], летучий метаболит олеиновой кислоты Crinipellis pernicosa, по сравнению с Pythium ultimum [12], из литературных источников известно, что он обладает высокими антимикробными свойствами. Тетрадекановая кислота, метиловый эфир 9-октадециновая кислота, (Z,Z)-9,12-октадекадиеноилхлорид, октадекановой кислоты метаболиты обладают противовоспалительным, гипохолестеринемическим, противораковым, гепатопротекторным, нематоцидным, противоэкземным действием, ингибитором 5-альфа-редуктазы [13].

В хлороформной фракции установлено, что основными метаболитами являются вещества, относящиеся к группе фенолов и терпиноидов, а эти метаболиты являются вторичными метаболитами, обладающими противомикробными, противовоспалительными, нематоцидными и противоэкземными свойствами.

В процессе фракционирования в качестве элюента после хлороформа использовали систему хлороформ:метанол 19:1. В этой фракции экстрагировали фракцию хлороформ:метанол 19:1 с использованием метода ТСХ. Для LUQX была выбрана система хлороформ:метанол 9:1, и значение R_f оказалось равным 0,51 (рис. 4).

Рисунок 4. Тонкослойная и газожидкостная хроматография фракции хлороформ:метанол 19:1

Была выделена фракция со значением R_f 0,51, и в ГЖХ были идентифицированы летучие метаболиты (рис. 4).

Т. Asperellum при колоночной (адсорбционной) хроматографии экстракта биомассы штамма Уз-А4 в системе хлороформ:метанол 19:1 отмечено наличие ряда активных соединений при определении содержания метаболитов методом ГЖХ-MС.

Таблица 3.

Метаболиты, идентифицированные из фракции хлороформ:метанол 19:1

При сравнении идентифицированных веществ с литературными данными, бензолэтанол, 4-гидроксибрикум нематоцид, антибактериальный [14], 9,12-октадекадиеновая кислота (Z,Z), метиловый эфир, октадекан, 3-этил-5-(2-этилбутилбутил), октадекановая кислота, 11-октадеценовая кислота, метиловый эфир, 9,12-октадекадиеновая кислота (Z,Z)-, соединения оказались соединениями с противораковым, гепатопротекторным, нематоцидным действием. Это исследование показывает наличие различных метаболитов во фракции системы хлороформ:метанол 19:1 экстракта T. asperellum Uz-A4. Изучение этой фракции служит ориентиром для последующих процессов. Наличие соединений, отсутствовавших в предыдущих фракциях, служит основанием для дальнейших исследований. Кроме того, это позволяет интерпретировать метаболиты штамма T. asperellum Uz-A4 как немоцидные, биофунгицидные и антибактериальные.

Выводы: Исследования ТСХ и ГЖХ-МС проводились для изучения состава метаболитов, экстрагированных из фракции хлороформ:метанола. Впервые из штамм микромицет Trichoderma asperellum Uz-A4 выделены алкалоидов и терпеноидов сесквитерпеноидной структуры, установлена зависимость их количественного и качественного состава от питательной среды, типа содержащегося в них источника азота и углерода, а также подтверждены их таксономические характеристики.

Список литературы:

1. Cai F., Yu G., Wang P., Wei Z., Fu L., Shen Q. Harzianolide, новый регулятор роста растений и стимулятор системной устойчивости Trichoderma harzianum // Завод физиологической биохимии. 2013. 73. С.106–113.
2. Бхардвадж Н. и Кумар Дж. Характеристика летучих вторичных метаболитов Trichoderma asperellum // Дж. Заявл. Нац. наук, 2017. Вып. 9. С. 954–959.
3. Макмаллин Д.Р., Рено Дж.Б., Барасабай Т., Сумара М.В. и Миллер Дж.Д. Метаболиты видов Trichoderma, выделенные из влажных строительных материалов //  Международный журнал микробиологии. 2017. Вып. 63. С. 621–632.
4. Кесвани С., Мишра С., Сарма Б.К., Сингх С.П. и Сингх Х.Б. Распутывание эффективного применения вторичных метаболитов различных видов Trichoderma // Заявления микробиологии и биотехнологии. 2014. Т. 98. С. 533–544.
5. Цайлингер С., Грубер С., Бансал Р. и Мукерье П.К. Вторичный метаболизм в триходерме – химия встречается с геномикой // Грибковые биологоические открытия. 2016. Т. 30. С. 74–90.
6. Фолл, Дж. Л., Грэм-Кук, К. А., Пилкингтон, Б. Л. Производство изонитрильного антибиотика УФ-индуцированным мутантом Trichoderma harzianum // Фитохимия. 1994. Вып. 36. С. 1273–1276.
7. Сиддики, С., Чеонг, Б.Е., Таслима, К., Каусар, Х., и Хасан, М.М. Разделение и идентификация летучих соединений из жидких культур Trichoderma harzianum методом ГХ-МС с использованием трех разных капиллярных колонок // Журнал хроматографических наук. 2012. Т. 50 (4). С. 358–367. doi: 10.1093/chromsci/bms012.
8. Риклеа Р., Брок, Н.Л., Дикшат, Дж. С. Биосинтез акорановых сесквитерпенов Trichoderma // RSC Advances. 2011. Vol. 1(2). Pp. 290. doi:10.1039/c1ra00212k.
9. Дандекар Р., Фегаде Б., Бхаскар В.Х. ГХ-МС анализ фитокомпонентов в спиртовом экстракте листьев Epiphyllum oxypetalum // Журнал фармакогнозии и фитохимии. № 4(1). 2015. C. 149-154.
10. Гершон Х., Шанкс Л. Противогрибковая активность жирных кислот и производных: взаимосвязь структура-активность // Фармакологическое действие липидов. Шампейн, Иллинойс: Американское общество химиков-нефтяников, 1978. C. 51-62.
11. Беньягуб М., Виллемот С., Беланже Р.Р. Влияние субингибирующей дозы противогрибковых жирных кислот из Sporothrix flocculosa на клеточный липидный состав грибов // Липиды. 1996. 17:1077-1082.
12. Уолтерс Д., Рейнор Л., Митчелл А., Уокер Р., Уокер К. Противогрибковая активность четырех жирных кислот против патогенных грибков растений // Микопатология. 2004. Т. 157. C. 87-90.
13. Дандекар Р., Фегаде Б., Бхаскар В.Х. ГХ-МС анализ фитокомпонентов в спиртовом экстракте листьев Epiphyllum oxypetalum // Журнал фармакогнозии и фитохимии. № 4(1). 2015. С. 149-154.
14. Манилал, А., Цалла, Т., Зердо, З., Амея, Г., Мердекиос, Б., и Джон, СЭ. Оценка антибактериальной и антикандидозной активности мангровых деревьев Avicennia marina // Азиатско-Тихоокеанский журнал тропических болезней. 2016. № 6 (2). С. 136–140. doi: 10.1016/s2222-1808(15)60999-9.