СКРИНИНГ ЭНДОФИТОВ СОИ ПО СПОСОБНОСТИ СТИМУЛИРОВАТЬ РОСТ РАСТЕНИЙ И ПОДАВЛЯТЬ ФИТОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ

АННОТАЦИЯ

В результате скрининга эндофитных бактерий сои нами были отобраны 5 изолятов (SOEN-5, SOEN-6, SOEN-8, SOEN-12 и SOEN-17), стимулирующих рост растений благодаря выделению ИУК, АЦК-дезаминазы, фиксации азота и фосфатмобилизации. Также отобраны 5 изолятов (SOEN-2, SOEN-9, SOEN-11, SOEN-15, SOEN-20), подавляющих рост фиторапатогенных грибов Fusarium solani и Fusarium oxysporum, при помощи литических ферментов, сидерофоров и цианистого водорода. Дальнейшее изучение выбранных бактерий, позволит применять их в составе бактериальных препаратов для улучшения роста растений и борьбы с грибными заболеваниями растений.

ABSTRACT

As a result of screening of endophytic soy bacteria, we selected 5 isolates (SOEN-5, SOEN-6, SOEN-8, SOEN-12 and SOEN-17) that stimulate plant growth through the release of IAA, ACC-deaminase, nitrogen fixation and phosphate solubilization. 5 isolates (SOEN-2, SOEN-9, SOEN-11, SOEN-15, SOEN-20) suppressing the growth of Fusarium solani and Fusarium oxysporum using lytic enzymes, siderophores and hydrogen cyanide were also selected. Further study of the selected bacteria will allow them to be used in the composition of bacterial preparations to improve plant growth and combat fungal plant diseases.

Ключевые слова: эндофиты, соя, свойства стимулирующие рост растений, биоконтроль, Fusarium.

Keywords: endophytes, soybean, plant growth-stimulating properties, biocontrol, Fusarium.

Соя — самая распространенная среди зернобобовых и масличных культур. Она широко используется как пищевая, кормовая и техническая культура. Из неё изготовляют масло, заменители молока и молочнокислых продуктов, муку. Соевое масло составляет около 30 % от производимых в мире растительных масел. Соевая мука используется как белковая добавка [19].

Внутренние ткани растений, включая сою, населяют различные виды эндофитных бактерий, многие из которых приносят пользу растениям, как за счёт прямой стимуляции роста, так и благодаря защите растения от фитопатогенных грибов, вызывающих болезни растений. Соединения, продуцируемые бактериями, напрямую влияют на физиологическую активность растения-хозяина и могут привести к увеличению биомассы растений и урожая. Бактериогенные вещества, стимулирующие рост растений, включают фитогормоны, АЦК-дезаминазу, а также эндофиты осуществляют полезные для растений процессы, такие как растворение фосфатов и фиксация атмосферного азота [5, 6, 7, 10]. К антифунгальным свойствам бактерий можно отнести продуцирование сидерофоров, цианистого водорода и ферментов, разрушающих клетки грибов [9, 11].

Бактерии имеющие повышенную активность в стимуляции роста растений и подавляющие рост грибов широко применяются в сельском хозяйстве в виде биологических препаратов, однако применение эндофитов в составе биопрепаратов до сих пор не изучено, поэтому этот вопрос имеет новизну и актуальность [12].

Целью данных исследований являлся скрининг эндофитных бактерий сои, по способности стимулировать рост сои и подавлять рост фитопатогенных грибов, а также изучение ростостимулирующих и антифунгальных свойств бактерий.

Материалы и методы

Выделение чистых культур эндофитных бактерий из корней и стеблей сои

Для выделения эндофитных бактерий использовали взрослое растение сою, взятое с одного из сельскохозяйственных полей, на которых выращивается соя.

Стебли и корень растений сои отрезали друг от друга и разрезали на кусочки массой 15 г, стерилизовали, помещая в стаканы с 99,9%-ным этанолом на 2 минуты и 10%-ным гипохлоритом натрия на 1 мин [14]. После этого их помещали в стаканы со стерильной водой на 2 минуты. Кусочки побегов и корней разрезали продольно на тонкие ломтики. По 5 г каждого образца переносили в пробирки с 9 мл стерильной водопроводной воды для серийного разведения (10¹–10⁵). По 100 мкл суспензии из каждого разведения переносили и наносили на триптонно-соевый агар (TSA). Чашки инкубировали в термостате при 29°С. Через четыре дня колонии, меняющие цвет и форму, переносили и высевали штрихами на чашки с триптонно-соевым агаром для очистки. Чистые культуры использовали для выделения ДНК. Мы также проверяли наружную поверхность кусочков корня и побега на стерильность, помещая их на среду TSA и инкубируя в течение четырех суток при 29°С. После инкубации колоний на питательной среде не было, что говорит о том что снаружи растения были стерильны.

Проведение скрининга эндофитных бактерий по способности стимулировать рост растений

Выделенные бактериальные эндофиты культивировали отдельно в питательной среде в течение 96 ч при 29°С и доводили концентрацию клеток до 10⁸ КОЕ/мл. Семена сои инокулировали бактериями путем замачивания в бактериальной суспензии и переносили в горшки со стерильной (автоклавированной) почвой. Почву автоклавировали заранее при 2 атм в течение 1 часа. В качестве контроля использовали стерильную питательную среду TSA. Длину побегов и корней проверяли на 10-й день. Выявляли лучшие ростостимулирующие бактериальные изоляты.

Проведение скрининга эндофитных бактерий по способности подавлять рост фитопатогенных грибов

Бактериальные штаммы проверены in vitro на наличие антагонистической активности против фитопатогенных грибов F.oxysporum и F. solani. Грибы выращивали на агаризованной среде Чапека. Штаммы грибов выращивали на чашках с агаром при 28°С в течение 5-7 суток. Диски агара с выросшей культурой гриба резали на квадратики (со стороной 7-8 мм) и помещали в центр чашки Петри (9 см в диаметре). Бактерии, выращенные на твёрдой среде триптонно-соевый агар (TSA), пересевали на тестовые чашки с той же средой перпендикулярно грибу. Чашки инкубировали при 28°С в течение 7 суток пока грибы не покрывали контрольные чашки без бактерий. Антифунгальную активность фиксировали и измеряли по ширине зоны ингибирования между грибом и исследуемыми бактериями.

Изучение ростостимулирующих свойств эндофитных бактерий

Продуцирование индол-3-уксусной кислоты (ИУК). Продуцирование ИУК было проверено согласно методу Sarwar и Kremer [16]. Бактериальную суспензию доводили до концентрации 1 х 10⁸ КОЕ/мл и добавляли в колбы с 10% TSA, дополненной 5 ммоль/л-1 L-триптофана, и культивировали при 29°С в течение 24 ч в темноте. Выращенные бактерии центрифугировали при 8000×g в течение 15 мин и сливали надосадочную жидкость в свежие пробирки. Реактив Сальковского (смесь FeCl₃ - 0,5 моль/л и H₂SO₄ - 7,9 моль/л) добавляли в соотношении 1:1 (об/об) к надосадочной жидкости и оставляли при комнатной температуре на 30 мин в темноте. Появление розовой окраски свидетельствует о продукции индол-3-уксусной кислоты. Для измерения ИУК использовали спектрофотометр при 530 нм. Для построения стандартной кривой использовали различные концентрации растворов ИУК.

Способность эндофитов растворять неорганический фосфат (фосфатмобилизация). Способность эндофитов к растворению неорганических фосфатов была определена согласно методу, описанному Mehta и Nautiyal [13]. Бактерии культивировали на плотной среде NBRIP (%): глюкоза - 1, Ca₃(PO₄)₂ - 0,5, MgCl₂ - 0,5, (NH₄)₂SO₄ - 0,01, MgSO₄,7H₂O - 0,025, KCl - 0,02, агар - 1,5). Планшеты с бактериями инкубировали при 28°С в течение 96 часов. Образование колоний свидетельствовало о способности использовать неорганический фосфат в виде Ca₃(PO₄)₂ в качестве единственного источника фосфата.

Для проверки штаммов на азотфиксацию, колонии каждого эндофита высевали штрихом на твердую азотодефицитную малатную среду (г/л): CaCl₂ - 0,02, NaCl - 0,1, FeCl₃ - 0,01, KH₂PO₄ - 0,4, K₂HPO₄ - 0,5, MgSO₄• 7H₂O - 0,2, Na₂MoO₄•2H₂O - 0,002, малат натрия - 5, агар - 15, pH 7,2-7,4) с добавлением дрожжевого экстракта 50 мг/л. Чашки Петри инкубировали при 29°С в течение 96 ч, появление роста свидетельствовало о способности фиксировать N₂. Новые выращенные одиночные колонии высевали штрихом на чашки с той же средой для подтверждения способности фиксировать азот [1].

Продуцирование 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата (AЦК) дезаминазы бактериями тестировали на основе использования ACC в качестве единственного источника азота. Эндофиты культивировали на среде Пептонный агар с добавлением 3,0 мМ 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата. Мы использовали (NH₄)₂SO₄ в качестве положительного контроля и без добавления источника азота в качестве отрицательного. Если бактерии росли, то это указывало, что они продуцируют АЦК-деаминазу [4].

Изучение антифунгальных свойств эндофитных бактерий

Продуцирование сидерофоров определяли с использованием хромазурол S (CAS) агара. Изоляты высевали штрихами на агар CAS, инкубировали при 29°C в течение 96 часов. Появление оранжевого круга вокруг бактериальной колонии свидетельствовало о продукции сидерофоров [17].

Определение способности штаммов продуцировать HCN (цианистый водород). Для проверки продуцирования HCN штаммы выращивали на среде триптонно-соевый агар. Стерильную фильтровальную бумагу, насыщенную раствором 1% пикриновой кислоты и 2% карбоната натрия помещали (приклеивали) на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри, которую заклеивали парафильмом и инкубировали при 29°С в течение 3 суток. Изменение цвета бумаги с жёлтого на тёмно-синий являлось показателем выделения HCN [3].

Для определения хитинолитической активности (хитиназа) штаммы выращивали на среде с 1,5% агара следующего состава, г/л дистиллированной воды: дрожжевой экстракт - 0,5; (NH₄)₂SO₄ – 1; MgSO₄х7H₂O - 0,3; КН₂PO₄ - 1,36. В качестве источника углерода в среду вносили коллоидный хитин. Хитин добавляли в среду в количестве 0,5%. Культивировали штамм на чашках Петри при 29°С. Эффективность гидролиза хитина определяли по величине отношения диаметра зоны просветления мутной среды вокруг колонии к диаметру колонии [15].

Наличие липазной активности (липаза) у бактериальных штаммов проверяли методом теста на индикаторе липазы Твин (Tween). Бактериальные штаммы выращивали на пептонном агаре, содержащем 2% Твин 80, при 29°С. Через 5 суток, разрушение Твина обнаруживалось в виде чистого кольца вокруг бактериальной колонии, что свидетельствовало о наличии липазной активности у штамма [8].

Продуцирование протеазы обнаруживали при выращивании штаммов на ТСА/20 (одна двадцатая часть трипсинового соевого бульона с 1,5% агара) с добавлением снятого молока до конечной концентрации 5%. Кольцо, появляющееся вокруг колоний на первый-второй день выращивания указывало на присутствие внеклеточной протеазы [2].

Глюканазную активность (глюканаза) обнаруживали при использовании лишайникового глуканового субстрата в чашках Петри, и образование чистых зон при росте бактерий, указывало на разрушение субстрата [18].

Идентификация бактерий, стимулирующих рост растений, методом MALDI-TOF MS - анализа.

Для идентификации выделенных штаммов использовали масс-спектрометрию с лазерной десорбцией/ионизацией с использованием цельноклеточного матрикса (MALDI)–(TOF). Подготовку образцов проводили в соответствии с протоколом экстракции этанолом/муравьиной кислотой, рекомендованным Bruker Daltonics (Бремен, Германия). Изоляты выращивали на трипсиново-соевом агаре (TSA, Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США) в течение 24 ч, и примерно 10 мг клеточной массы смешивали с 300 мкл воды, а затем встряхивали для образования гомогенной суспензии. К суспензии добавляли 900 мкл этанола и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в 50 мкл 70%-ной муравьиной кислоты и осторожно смешивали с 50 мкл ацетонитрила. После центрифугирования 1 мкл жидкой части супернатанта сразу же наносили на пятна MALDI-TOF MS. Каждую сушили и покрывали 1 мл матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота в 50% водном ацетонитриле, содержащем 2,5% трифторуксусной кислоты). Масс-спектры получали с использованием спектрометра MALDI-TOF MS в линейном положительном режиме (MicroflexTMLT, Bruker Daltonics, Бермен, Германия) в диапазоне масс 2–20 кДа. Стандарт бактериального теста (BTS, Bruker Daltonics, Бремен, Германия) использовали для калибровки прибора. Спектры импортировали в программное обеспечение MALDI BiotyperTM (Bruker Daltonics, Германия), а затем обрабатывали и анализировали с использованием стандартного сравнения с соответствующими спектрами данных в выходной базе данных MALDI BiotyperTM (версия 3.0, Bruker Daltonics, Германия).

Результаты

Выделение и скрининг эндофитных бактерий из сои по способности стимулировать рост растений

В общей сложности из корней и стеблей сои нами было выделено 20 изолятов эндофитных бактерий: SOEN-1 – SOEN-20. Выденные бактерии были проверены по способности стимулировать рост растений сои, путём предпосевной инокуляции семян в бактериальной суспензии. Результаты показаны на рисунке 1.

Рисунок 1. Скрининг эндофитных бактерий по способности стимулировать рост растений сои (рост в горшках, 10 суток)

Из результатов, представленных на рисунке 1, видно, что практически все выделенные бактерии были способны улучшать рост сои в той или иной степени. Например, изоляты SOEN-3, SOEN-9 и SOEN-15 практически никак не повлияли на рост растений. Самыми эффективными ростостимуляторами оказались изоляты SOEN-5, SOEN-6, SOEN-8, SOEN-12 и SOEN-17. Например, изолят SOEN-5 способствовал увеличению стебля на 81%, а корня – на 94% по сравнению с контрольными растениями, семена которых не были ничем обработаны.

Таким образом, на основе отбора – скрининга, для дальнейших экспериментов были выбраны изоляты SOEN-5, SOEN-6, SOEN-8, SOEN-12 и SOEN-17, как лучшие стимуляторы роста сои.

Cкрининг эндофитных бактерий из сои по способности подавлять рост фитопатогенных грибов

Кроме ростостимулирующей активности, выделенные 20 изолятов бактерий были проверены и по способности подавлять рост фитопатогенных грибов (рис. 2).

Рисунок 2. Ингибирование роста фитопатогенных грибов эндофитными бактериями из сои (на чашках Петри)

Исследования показывают, что 13 из 20 изолятов были способны ингибировать рост одного или двух проверенных грибов Fusarium oxysporum и Fusarium solani. Изоляты SOEN-5, SOEN-14, SOEN-16 и SOEN-19 подавляли рост только одного из двух видов грибов.

Изоляты SOEN-2, SOEN-9, SOEN-11, SOEN-15, SOEN-20 ингибировали фитопатогенные грибы более эффективно чем, другие изоляты бактерий и поэтому были выбраны для дальнейшего изучения. Так, например, зона подавления роста гриба F.oxysporum изолятом SOEN-2 была 9 мм, а гриба F.solani – 7 мм.

Ростостимулирующие свойства эндофитных бактерий

Выбранные нами ростостимулирующие изоляты бактерий SOEN-5, SOEN-6, SOEN-8, SOEN-12 и SOEN-17 были проверенны на продуцирование фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), АЦК-дезаминазы, азотфиксацию и фосфатмобилизацию (Таблица 1). Все эти свойства позволяют бактериям стимулировать и улучшат рост растений.

Таблица 1.

Ростостимулирующие свойства эндофитных бактерий

Примечание: “+” – положительно, “-“ – отрицательно

Выявлено, что все 5 изолятов продуцировали ИУК, однако наиболее активным продуцентом ИУК был SOEN-5 (198,5 мкг/мл). Чуть менее эффективными оказались SOEN-6 и SOEN-17. Кроме того, изолят SOEN-5 был единственным, который фиксировал атмосферный азот. Фосфатмобилизацию, то есть растворение нерастворимых фосфатов могли осуществлять 4 из 5 изолятов, за исключением SOEN-12. АЦК-дезаминазу продуцировали все изоляты, кроме SOEN-8. Изолят SOEN-5 обладал всеми из проверенных ростостимулирующих свойств и, благодаря этим свойствам, он проявлял наибольшую эффективность с стимуляции роста растений.

Антифунгальные свойства эндофитных бактерий

Выбранные в результате скрининга изоляты SOEN-2, SOEN-9, SOEN-11, SOEN-15 и SOEN-20, подавляющие рост фитопатогенных грибов, были проверены на наличие у них противогрибковых свойств: продуцирование ферментов, расщепляющих их клеточные стенки (липаза, протеаза, глюканаза и хитиназа), сидерофоров (связывающих железо и делающих его недоступным для грибов) и цианистой кислоты (являющейся токсичной для грибов). Выявлено что все 5 изолятов обладали теми или иными антифунгальными свойствами (Таблица 2).

Таблица 2.

Антифунгальные свойства выделенных изолятов эндофитных бактерий

Примечание: “+” – положительно, “-“ – отрицательно

Изолят SOEN-2, показавший ранее наибольшую антифунгальную активность, был способен продуцировать липазу, протеазу, глюканазу, хитиназу и HCN. Изоляты SOEN-9 и SOEN-15 оладали 4 из 6 проверенных свойств. Так, SOEN-9 продуцировал липазу, протеазу, хитиназу и сидерофоры, а SOEN-15 продуцировал протеазу, глюканазу, хитиназу и HCN. Изоляты SOEN-11 и SOEN-20 обладали лишь 3 из 6 исследованных антифунгальных свойств.

В результате скрининга эндофитных бактерий сои нами были отобраны 5 изолятов (SOEN-5, SOEN-6, SOEN-8, SOEN-12 и SOEN-17), стимулирующих рост растений благодаря выделению ИУК, АЦК-дезаминазы, фиксации азота и фосфатмобилизации. Также отобраны 5 изолятов (SOEN-2, SOEN-9, SOEN-11, SOEN-15, SOEN-20), подавляющих рост фитопатогенных грибов Fusarium solani и Fusarium oxysporum, при помощи литических ферментов, сидерофоров и цианистого водорода. Отобранные наиболее активные штаммы идентифицированы с помощью MALDI-TOF MS анализа. В соответствии с этим исследуемые активные штаммы идентифицированы до родовой принадлежности: Bradyrhizobium (SEON-2, SEON-9), Rhizobium (SEON-11, SEON-20) и Pseudomonas (SEON-15).

Таким образом, дальнейшее изучение отобранных бактерий, позволит применять их в составе бактериальных препаратов для улучшения роста растений и борьбы с грибными заболеваниями растений.

Список литературы:

1. Bashan Y., Holguin G., Lifshitz R. Isolation and characterization of plant growth-promoting rhizobacteria. In: Glick B.R., Thompson J.E., editors. Methods in plant molecular biology and biotechnology, USA, FL, Boca Raton: CRC Press, 1993, p. 331–345.
2. Brown M.R., Foster J.H. A simple diagnostic milk medium for Pseudomonas aeruginosa. Journal of Clinical Pathology, 1970, 23:172–177.
3. Castric P.A. Hydrogen cyanide, a secondary metabolite of Pseudomonas aeruginosa. Canadian Journal of Microbiology, 1975, 21:613–618.
4. Egamberdieva D., Kucharova Z., Davranov K., Berg G., Makarova N., Azarova T. Bacteria able to control foot and root rot and to promote growth of cucumber in salinated soils. Biology and Fertility of Soils, 2011, 47:197–205
5. Etesami H. Can interaction between silicon and plant growth promoting rhizobacteria benefit in alleviating abiotic and biotic stresses in crop plants? Agriculture, Ecosystems & Environment, 2018, 253:98–112.
6. Etesami H., Beattie G.A. Plant-microbe interactions in adaptation of agricultural crops to abiotic stress conditions. In: Probiotics and Plant Health, eds V. Kumar, M. Kumar, S. Sharma, and R. Prasad. Singapore: Springer, 2017, 163–200.
7. Gupta G., Panwar J., Jha P.N. Natural occurrence of Pseudomonas aeruginosa, a dominant cultivable diazotrophic endophytic bacterium colonizing Pennisetum glaucum (L) R. Br. Applied Soil Ecology, 2013, 64:252–261.
8. Howe T.G., Ward J.M. The utilization of tween 80 as carbon source by Pseudomonas. The Journal of General Microbiology, 1976, 92:234–235.
9. Husson E., Hadad C., Huet G., Laclef S., Lesur D., Lambertyn V. The effect of room temperature ionic liquids on the selective biocatalytic hydrolysis of chitin via sequential or simultaneous strategies. Green Chemistry, 2017, 19:4122–4131.
10. Ilangumaran G., Smith D.L. Plant growth promoting rhizobacteria in amelioration of salinity stress: a systems biology perspective. Frontiers in Plant Science, 2017, 8:1768.
11. Jasim B., Joseph A.A., John C.J., Mathew J., Radhakrishnan E.K. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic bacteria from the rhizome of Zingiber officinale. 3 Biotech, 2013, 4(2):197–204.
12. Mahmood A., Kataoka R. Potential of biopriming in enhancing crop productivity and stress tolerance. In: Advances in Seed Priming. Springer, Singapore, 2018, pp. 127–145.
13. Mehta S., Nautiyal C.S. An efficient method for qualitative screening of phosphate-solubilizing bacteria. Current Microbiology, 2001, 43(1):51–56.
14. Mora-Ruiz M.D.R, Font-Verdera F., Díaz-Gil C. Moderate halophilic bacteria colonizing the phylloplane of halophytes of the subfamily Salicornioideae (Amaranthaceae). Systematic and Applied Microbiology, 2015, 38(6):406–416.
15. Moreal J., Relse E.T. The chitinase of Serratia marcescens. Canadian Journal of Microbiology, 1969; 15:689–696.
16. Sarwar M., Kremer R.J. Determination of bacterially derived auxins using a microplate method. Letters in Applied Microbiology, 1995, 20:282-285.
17. Schwyn B., Neilands J.B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry, 1987, 160:45–46.
18. Walsh G.A., Murphy R.A., Killeen G.F., Headon D.R., Power R.F. Technical note: detection and quantification of supplemental fungal β-gluconase activity in animal feed. Journal of Animal Science, 1995, 73:1074-1076.
19. https://ru.wikipedia.org/wiki/Соя