РАСТЕНИЯ УЗБЕКИСТАНА – ИСТОЧНИКИ МЕЛАНИЗИРОВАННЫХ ЭНДОФИТНЫХ ГРИБОВ

АННОТАЦИЯ

Выделено 30 штаммов темносептированных эндофитных грибов, в том числе 8 редких видов, из растений, произрастающих в различных территориальных округах республики. Изучены морфолого-культуральные свойства выделенных изолятов, определены их родовая принадлежность и способность синтезировать пигменты – меланины, природа которых подтверждена качественными реакциями и способностью растворяться в различных растворителях.

ABSTRACT

30 strains of dark-septed endophytic fungi were isolated, including 8 rare species from plants growing in various territorial districts of the republic. The morphological and cultural properties of the isolated isolates were studied, their generic affiliation and the ability to synthesize pigments - melanins, the nature of which was confirmed by qualitative reactions and the ability to dissolve in various solvents, were determined.

Ключевые слова: эндофитные грибы, глубинная и поверхностная ферментация, пигмент меланин, качественные реакции.

Keywords: endophytic fungi, deep and surface fermentation, pigment melanin, qualitative reactions.

Введение. Пигмент меланин образуется при окислительной полимеразации фенольных/индольных веществ, гидрофобен, отрицательно заряжен, обладает высоким молекулярным весом. Установлено, что меланин наряду с фото- и радиопротекторными свойствами обладает способностью хелатировать металлы и взаимодействовать с лекарственными препаратами, улучшает состояние иммунной системы, оказывает гепатопротекторное действие, проявляет антиканцерогенные и противовоспалительные свойства [10; 8].

Благодаря меланину микроорганизмы способны выживать в экстремальных условиях обитания. Именно такими условиями характеризуются некоторые округа Узбекистана с резко континентальным климатом. Ландшафт республики представлен высокогорьями с разряженным воздухом, равнинами, пустынями с высоким засолением почв и разнообразными заповедниками. Это обуславливает уникальные природные характеристики, что непосредственно влияет на распространение и разнообразие микрофлоры, в том числе и эндофитной [2; 6].

Эндофиты – микроорганизмы, бессимптомно обитающие в межклеточном и внутриклеточном пространстве растений. В симбиотической ассоциации растение – хозяин защищает и питает эндофит, который в ответ продуцирует биоактивные метаболиты, в том числе и меланиновые пигменты. При этом именно меланизированные грибы более устойчивы к УФ-индуцированному и окислительному стрессу, экстремальным температурам, гидролитическим ферментам, токсичным тяжелым металлам и антимикробным средствам по сравнению с немеланизированными грибами [9].

В этой связи целью исследования явилось изучение меланинсинтезирующего потенциала эндофитных грибов некоторых лекарственных растений республики.

Материалы и методы исследования

В различных округах республики, различающихся климатом, высотой над уровнем моря и относящихся к различным географическим поясам, был произведен сбор 14 лекарственных растений.

Выделение темносептированных эндофитных грибов проводили по Hazalin с сотр. с модификациями [5]. Поверхностной стерилизации подвергали части собранных растений с применением этанола и гипохлорита натрия, с различной длительностью экспозиции частей растений. После обработки дезинфектантами в течение 1–3 минут и промывки стерильной водой, каждый сегмент растения асептически измельчали на кусочки размером не более 0,5 см и помещали на чашки Петри с картофельно-декстрозным агаром, содержащие цефтриаксон в концентрации 200 мкг/мл для подавления роста бактериальной микрофлоры. Чашки инкубировали в течение 7–14 дней при температуре 28 °С. Последние промывные воды также засевали из расчета 100 мкл на чашку для контроля поверхностной стерилизации. Выросшие грибные изоляты пересевали на среду, не содержащую антибиотики.

Родовую и видовую принадлежность выделенных изолятов грибов проводили классическими методами [1].

Культивирование выделенных эндофитов проводили методом жидкофазной ферментации в условиях поверхностного (стационарно в термостате) или глубинного выращивания (на качалке при 180 об/мин) на средах Чапека – Докса, Сабуро и картофельно-декстрозном бульоне, при температуре 28 °С в течение 7–10 суток в колбах Эрленмейера объемом 1дм³. Питательную среду засевали мицелиальным инокулюмом. Для получения мицелиального инокулюма колбы с 50 мл среды Чапека – Докса инокулировали суспензией 1×10⁷ спор/мл и культивировали на качалке при 180 об/мин, температуре 28 °С в течение 3 суток. Посев мицелиальным инокулюмом осуществляли из расчета 5% инокулюма от объема среды культивирования. Выросшую биомассу культур отделяли центрифугированием при 6 тыс. об/мин и хранили при –40 °С.

Выделение меланинов проводили методом щелочной экстракции с последующим кислотным осаждением. Для этого 1 г биомассы промывали в дистиллированной воде, ресуспензировали в 0,5 Н NaOH и подвергали автоклавированию при 1 атм. 15 минут. Образец после автоклавирования центрифугировали, отбирая супернатант, который подкисляли концентрированной HCl до выпадения хлопьевидного осадка от темно-бурого до черного цвета. Полученный осадок собирали центрифугированием, промывали в дистиллированной воде и ацетоне. Для определения сухого веса полученный осадок высушивали до постоянного веса при температуре 105 °С.

Для проверки принадлежности выделенных пигментов к меланинам проводили три качественных теста на присутствие в их молекуле хиноидных и фенольных структур. Для проведения качественных реакций готовили 0,1%-ный раствор пигмента (15 мг пигмента растворяли в 15 мл 0,1 Н раствора NaOH).

Затем проводили следующие процедуры:

• 5 мл раствора пигмента переливали в пробирку вместимостью 10 мл и приливали 0,5 мл 10%-ной перекиси водорода. Положительная реакция – обесцвечивание раствора;

• 5 мл раствора пигмента переливали в пробирку вместимостью 10 мл и приливали 0,1 мл 0,1 М раствора KMnO₄. Положительная реакция – раствор зеленеет;
• 5 мл раствора пигмента переливали в пробирку вместимостью 10 мл и приливали 0,1 мл 5%-ного раствора FeCl₃. Положительная реакция – образуются крупные коричневые хлопья, в растворе с избытком хлорида железа осадок растворяется.

Для определения растворимости сухой пигмент растворяли в органических и неорганических арстворителях, таких как вода, ацетон, гексан, серная кислота [3; 11].

Результаты и обсуждение

Из различных частей растений (корень, стебель, лист, клубень, луковица) было выделено 30 грибных изолятов, обладающих темноокрашенным мицелием (табл. 1). В результате анализа распространения отобранных изолятов установлено, что большинство культур выделены из растений, произрастающих в местах с сильной солнечной инсоляцией.

Морфолого-культуральные свойства отобранных изолятов позволили отнести их к родам Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Sclerotium, Ulocladium. Среди выделенных эндофитов встречаются также редкие виды темносептированных грибов, такие как: Cladosporium coremioides – VE92L, Alternaria grisea – FF61S, Alternaria geophila – HP133L, Alternaria tenuis – VE98L, Dorotomyces purpureofuscus – HT191R, Ulocladium consortiae – FF155L, Alternaria malvae – TS55S, Cladosporium tenuissimum – AF183.

Таблица 1.

Темносептированные эндофитные изоляты растений

Производство пигментов из микроорганизмов, в том числе грибов, весьма перспективно вследствие короткого времени размножения, высокого уровня продукции биомассы, скорости роста и удобства для выращивания в биореакторах по сравнению с растительными источниками, что делает процесс экономически выгодным и жизнеспособным в промышленном масштабе. При этом подбор питательных сред и условий культивирования является первостепенной задачей при масштабировании процесса ферментации [7].

Эндофитные грибы как источники меланина практически не изучены. Одной из проблем в ферментации эндофитов является то, что в процессе культивирования они могут расти плохо или не расти вовсе, а также терять свои свойства продуцировать те или иные искомые соединения. Поскольку темноокрашенная биомасса является показателем уровня содержащихся в ней меланинов, то поиск путей повышения роста мицелиальной массы является главным условием в определении перспективности штамма как источника пигмента [4].

Способность отобранных эндофитных грибов накапливать темноокрашенную биомассу на питательных средах – Сабуро, Чапека – Докса, картофельно-декстрозном бульоне – нами изучена при поверхностной и глубинной ферментации. Однако при культивировании некоторые культуры теряли пигментацию мицелия при росте на жидкой среде. В результате для работы было отобрано 12 (40%) темносептированных культур.

При сравнительном анализе трех сред было установлено, что высокое накопление биомассы при глубинной ферментации происходит у всех 12 отобранных культур на картофельно-декстрозном бульоне. В среднем выход биомассы на КДБ был гораздо выше по сравнению со средой Чапека – Докса. Уровень прироста биомассы на среде Сабуро был несколько выше, чем на среде Чапека – Докса, и более низким, чем на КДБ (рис. 1).

Рисунок 1. Выход биомассы ТСЭ на различных питательных средах при глубинной (А) и поверхностной (Б) ферментации на 7-е сутки роста

Однако в разных штаммах зависимость от типа среды выражалась по-разному. Так, в отдельных штаммах, например Cladosporium coremioides – VE92L, выделенном из Vinca erecta и Penicillium sp. – HT192R из Helianthus tuberosus, уровень биомассы имел близкие значения на всех трех средах, в штаммах Cladosporium sp. – HT207 из Helianthus tuberosus и Cladosporium sp. – CC213 из Celosia cristata достаточно высокий уровень накопления наблюдался и на среде КДБ, и на среде Сабуро. В то же время в Aspergillus niger – FF152S, выделенном из Ferula foetida, и в Alternaria sp. – SO144L из Scorzonera ovata выход биомассы на КДБ составлял величину, более чем в 3–7 раз выше по сравнению со средой Чапека – Докса.

Среда КДБ также способствовала более высокому выходу биомассы и при поверхностной ферментации. Однако по сравнению с глубинной ферментацией ее количество в целом ниже у всех отобранных культур.

Уровень прироста биомассы исследованных эндофитных грибов при глубинном культивировании на КДБ составляет 12–39 г/л, на среде Сабуро – 8–31 г/л и на среде Чапека – Докса – 5–18 г/л. При поверхностном культивировании прирост биомассы был заметно ниже и составлял 10–22 г/л на среде КДБ, 5–15 г/л – на среде Сабуро и 3–8 г/л – на среде Чапека – Докса.

Выделение меланиновых пигментов проводили из 8 эндофитов, накапливающих наиболее высокое количество темноокрашенной биомассы на разных средах. Количественный выход полученных пигментов, однократно экстрагированных из культур, выросших при глубинной и поверхностной ферментации на разных средах, представлен на рис. 2.

Высокий выход меланина на уровне 250–300 мг/г биомассы наблюдается при глубинной ферментации – на КДБ у штаммов Alternaria sp. – SO78L, выделенного из Scorzonera ovata, и S. minorum – VM83R, выделенного из V. minor, при поверхностной ферментации – на КДБ у A. niger – FF152S, выделенного из F. foetida, а также на уровне 100 мг/г у Cladosporium sp. – HT207 из H. tuberosus вне зависимости от способа ферментации.

Рисунок 2. Выход меланиновых пигментов из культур, выросших при глубинной (А) и поверхностной (Б) ферментации на разных средах

Следует отметить, что вполне логично было ожидать, что из штаммов, проявляющих хороший рост меланизированной биомассы, будет выделено большее количество пигмента. Однако, как оказалось, степень экстрагируемости меланина в разных штаммах различается. Так, например, из биомассы штаммов Alternaria sp. – SO144L и A. niger – FF152S с высоким приростом биомассы выход меланина был относительно невелик по сравнению со штаммами Alternaria sp. – SO78L и S. minorum – VM83R, проявляющих умеренную скорость роста. Уровень меланина в этих штаммах составил 250–300 мг/г на среде КДБ и 200–250 мг/г – на среде Сабуро. В целом экстрагируемость меланина из культур при глубинном выращивании была выше.

Принадлежность выделенных пигментов, образуемых эндофитными культурами, проводили с помощью качественных реакций и по растворимости в различных растворителях (рис. 3).

Предварительная идентификация выделенных темных пигментов качественными реакциями и по растворимости в различных растворителях подтвердила меланиновую природу пигментов штаммов Alternaria sp. – SO78L, Alternaria sp. – SO144L, Aspergillus niger – FF152S и Cladosporium tenuissimum – AF183, выделенных из Scorzonera ovata, Ferula foetida и Allium filidens.

Рисунок 3. Растворимость (Б) щелочных экстрактов (А) выделенных пигментов и качественные реакции (В):

 1 – H₂O₂ (обесцвечивание); 2 – KMnO₄ (раствор зеленеет), 3 – FeCl₃ (выпадение хлопьевидного осадка), 4 – контроль (0,1 N NaOH)

Таким образом, растения Узбекистана, произрастающие в регионах с высокой солнечной инсоляцией, являются источниками темносептированных эндофитных грибов как перспективных продуцентов меланиновых пигментов – для получения субстанций пигмента для косметологии, дерматологии, фармацевтики.

Работа поддержана грантом Ф3-201912269 Агентства инновационного развития при Министерстве высшего образования, науки и инноваций Республики Узбекистан

Список литературы:

1. Литвинов М.А. Определитель микроскопических грибов. – Л. : Наука, 1967. – С. 312.
2. Соколова В.Е., Сыроечковский Е.Е. Заповедники Средней Азии и Казахстана. – М. : Мысль, 1990. – 399 с.
3. Characterization of melanin and optimal conditions for pigment production by an endophytic fungus Spissiomyces endophytica SDBR-CMU319 / N. Suwannarach, J. Kumla, B. Watanabe [et al.] // PLoS ONE. – 2019. – Vol. 14 (9). – 0222187.
4. Characterization of the melanin pigment of a cosmopolitan fungal endophyte / T.S. Suryanarayanan, J.P. Ravishankar, G. Venkatesan, T.S. Murali // Mycol Res. – 2004. – Vol. 108. – P. 974–978.
5. Cytotoxic and antibacterial activities of endophytic fungi isolated from plants at the National Park, Pahang, Malaysia / N.A. Hazalin, K. Ramasamy, S.M. Lim [et al.] // BMC Complementary and alternative medicine. – 2009. – № 9. – P. 46.
6. Gessler N., Egorova A., Belozerskaya T. Melanin pigments of fungi under extreme environmental conditions (review) // Appl Biochem Microbiol. – 2014. – Vol. 50. – P. 105–113.
7. Malik K., Tokkas J., Goyal S. Microbial pigments: a review // Int J Microbial Res Technol. – 2012. – Vol. 1. – P. 361−365.
8. Pharmacological properties of melanin and its function in health / A.S. El Obeid, A. Kamal-Eldin, MAK Abdelhalim, A.M. Haseeb // Basic Clin Phamacol Toxicol. – 2017. – Vol. 120. – P. 515–522.
9. Production of Melanin Pigment by Fungi and Its Biotechnological Applications / S.R. Pombeiro-Sponchiado, G.S. Sousa, J.C.R. Andrade [et al.] // 2017. – Chapter 4. – P. 47–75.
10. Recent advances and progress on melanin-like materials and their biomedical applications / L. Huang, M. Liu, H. Huang [et al.] // Biomacromolecules. – 2018. – Vol. 19. – P. 1858–1868.
11. Structure of melanins from the fungi Ochroconis lascauxensis and Ochroconis anomala contaminating rock art in the Lascaux Cave / J.M. De la Rosa, P.M. Martin-Sanchez, S. Sanchez-Cortes [et al.] // Sci Rep. – 2017. – Vol. 7. – P. 13441.