ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ ЛЕКТИНА ЦИАНОБАКТЕРИЙ Nostoc calcicola 25

АННОТАЦИЯ

В настоящее время в области гликобиологии быстро развивается исследование различных свойств лектина. Лектины – это сложные белки, широко используемые в биомедицине для обнаружения гликанов, гликоконъюгатов или свободных сахаров, прикрепленных к поверхности клеток, биомаркеров, связанных с раковыми клетками и заболеваниями. В этом исследовании были проведены эксперименты по выделению, очистке и описанию некоторых свойств лектинового вещества местных штаммов цианобактерий Nostoc calcicola 25. В частности, было обнаружено присутствие в экстракте цианобактерий лектинового белка с помощью анализа на гемагглютинацию. Выявлено, что молекулярная масса лектина Nostoc calcicola 25 составляет 30 кДa. Установлено, что лектин цианобактерий Nostoc calcicola 25 является термолабильным, его активность полностью теряется в течение 30 мин при 70^оС.

ABSTRACT

Currently, in the field of glycobiology, research on the various properties of lectin is rapidly developing. Lectins are complex proteins widely used in biomedicine to detect glycans, glycoconjugates or free sugars attached to the surface of cells, biomarkers associated with cancer cells and diseases. In this study, experiments were carried out to isolate, purify and characterize some of the properties of the lectin substance of local strains of cyanobacteria Nostoc calcicola 25. In particular, the presence of a lectin protein in the extract of cyanobacteria was detected using a hemagglutination assay. It was revealed that the molecular weight of the Nostoc calcicola 25 lectin is 30 kDa. It has been established that the lectin of cyanobacteria Nostoc calcicola 25 is thermolabile, its activity is completely lost within 30 min at 70°C.

Ключевые слова: лектин, цианобактерии, Nostoc calcicola, гемаглютинация, температура, рН среды

Keywords: lectin, cyanobacteria, Nostoc calcicola, gemagglutinatsiya, temperature, medium pH

Введение

Лектины (гемагглютинины) представляют собой связывающие углеводы белки/гликопротеины неиммунного происхождения, которые агглютинируют клетки или осаждают гликоконъюгаты. Они распознают и обратимо взаимодействуют либо со свободными углеводами, либо с гликоконъюгатами, не изменяя своей структуры [15]. Различные нековалентные силы, такие как водородные связи, гидрофобные взаимодействия и силы Ван-дер-Ваальса, участвуют во взаимодействиях лектин-сахар. Белки считаются лектинами, если они отвечают следующим условиям: (а) должны связывать углеводы, (б) не должны модифицировать углеводы, с которыми они связываются, и (в) должны отличаться от иммуноглобулинов [16]. Кроме того, у лектинов «домен узнавания углеводов» находится в их полипептидной последовательности, которая лежит в основе способности большинства лектинов связывать углеводы, что было выявлено при анализе их аминокислотной последовательности. Лектины способны агглютинировать эритроциты, лимфоциты и микробные клетки на основании их углеводной специфичности [20].  Агглютинация приводит к поперечному сшиванию нескольких клеток крови, поскольку лектины специфически взаимодействуют с концевыми остатками сахара на поверхности эритроцитов [8]. Таким образом, агглютинация эритроцитов является характерной чертой лектинов, которая играет роль в определении активности лектинов на основе анализа гемагглютинации [3].

В последнее время возрос интерес к лектинам различных морских видов, таких как водоросли, губки, моллюски, рыбы и членистоногие, в связи с их потенциальной ценностью для различных медицинских применений [14, 5]. Морские водоросли являются отличным источником новых молекул лектина для исследований и имеют широкое применение в различных областях, таких как фармацевтика, медицина, пищевая наука, гликобиология и биохимия [12, 13]. Лектины водорослей представляют собой молекулы с низкой молекулярной массой и могут быть менее антигенными при использовании в биологических моделях, как показано в нескольких исследованиях биологического применения лектинов водорослей [20]. Водоросли относятся к числу самых разнообразных организмов в царстве растений. Это фотосинтезирующие, преимущественно водные организмы, лишенные сосудистых тканей, настоящих корней, стеблей, листьев и обладающие простыми репродуктивными структурами. Согласно новейшей системе классификации, основанной на ультраструктуре пластид, водоросли подразделяются на четыре группы, которые далее подразделяются на восемь отделов [9]: группа 1 – прокариотические водоросли, содержащие отдел (1) Cyanophyta; 2 группа – эукариотические водоросли, содержащие отделы (2) Glaucophyta, (3) Rhodophyta, (4) Chlorophyta; группа 3 – эукариотические водоросли, содержащие отделы (5) Euglenophyta и (6) Dinophyta; группа 4 – эукариотические водоросли, содержащие отделы (7) Heterokontophyta и (8) Pyrmnesiophyta.

Таким образом, лектины представляют собой наиболее универсальную группу белков, используемых в биологических и биомедицинских исследованиях. Они обладают огромным потенциалом, так как играют важную роль в межклеточном распознавании [18] и широко используются для доставки лекарств. Лектины водорослей обладают различными биомедицинскими свойствами, такими как противоопухолевые, анти-ВИЧ, противовоспалительные, противогрибковые, противомикробные и т.д. [10, 21].

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы является  выделение и изучение некоторых свойств лектинов местных штаммов цианобактерий  Nostoc calcicola 25.

Материалы и методы исследования

Объект исследования

Объектом исследований являлись местные штаммы азотфиксирующих и солеустойчивых цианобактерий N. calcicola 25 выделенные из засоленных и загрязненных пестицидами сероземных почв Кашкадарьинской области Узбекистана [1, 7].

Культивирование цианобактерий

Цианобактерии культивировали на минеральной питательной среде ВG -11₀. Жидкую среду ВG -11₀ наливали в стеклянные колбы (300 – 500 мл) таким образом, чтобы занимаемый объем был не более 1/3 – 1/4 объема колбы. Сосуды с засеянным материалом помещали на свет с люминесцентными лампами, при 2500 -3000 лк, температуре 28^оС и концентрации СО₂ – 2%.

Определение сухого веса (влажности) биомассы клеток цианобактерий и выделение белкового экстракта культуры

Определение сухого веса биомассы клеток проводилось согласно методике [2]. Стеклянные бюксы помещались в сушильный шкаф и сушились в течение 2 ч при температуре 110°С. Затем бюксы вынимали пинцетом из сушильного шкафа и переносили в эксикатор с безводным CaCl₂. Через 1 ч бюксы взвешивали с точностью до 0,1 мг. Высушивание и взвешивание повторяли с соблюдением указанной последовательности операций, пока масса не достигала постоянного значения, то есть колебания в ее определениях не превышали ± 0,1 мг. Полученную таким образом сухую биомассу цианобактерий хорошо измельчали в ступке с добавлением стеклянной крошки в соотношении 1:3. После механического измельчения сухой биомассы водорослей, для получения белкового экстракта в порошок цианобактерий добавляли Трис-HCl буфер (рН-7,6) содержащий  0,15 М NaCl и 0,01 М фенилметан сульфонил фторида (ФМСФ) в объеме 1: 3 (V/V) и непрерывно экстрагировали в течение 4 часов.

Анализ активности гемагглютинации

Анализ активности гемагглютинации проводили путем последовательного разбавления белкового образца 0,1 М Трис-HCl буфером (pH-7,6), содержащим 0,15 М NaCl, с последующим добавлением ферментативно обработанных эритроцитов. Результат определяли как соотношение наибольшего разбавления, способное агглютинировать эритроциты. В исследовании на гемагглютинины экстракта цианобактерий использовались эритроциты кролика, обработанные трипсином, поскольку по литературным данным цианобактерии чувствительны к ферменту лектин-трипсину [19].

Помимо визуального наблюдения, мы также наблюдали процесс гемагглютинации с помощью микроскопа (рис. 2). Тот факт, что эритроциты со временем слипаются и оседают, указывает на то, что происходит процесс гемагглютинации.

Для учета серологических реакций использовали микроскоп OLYMPUS BX 41 (Япония).

Очистка лектинов

Первичное выделение лектинов осуществляли путем высаливания белков кристаллическим (NH₄)₂SO₄ [22] из водной фазы гомогенатов цианобактерий в фосфатно-солевом буфере (PBS).

Для очистки препарата лектина использовали гель-фильтрацию на сефадексе G-100 [17] и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).

В полученных фракциях измеряли концентрацию белков спектрофотометрическим методом в полосах 206 и 280 нм и концентрацию лектинов с помощью реакции гемагглютинации.

Влияние показателей pH и температуры на активность лектина

Влияние показателей pH на активность лектина путем инкубации очищенного лектина при 25° C в течение 30 минут в 0,1 M буферах с различными показателями pH определялась реакцией гемагглютинации. Для этого использовали буферы цитратфосфата с pH=4,0-7,5 и Трис-HCl с pH=7,0-9,0. Для определения pH стабильности, очищенный лектин (50 мкл) инкубировали с буферами (50 мкл) при 25 °C при различных pH, затем образцы нейтрализовали, а активность проверяли через 30, 60 и 90 мин. Остаточная активность определяли в стандартных условиях анализа. Активность гемагглютинации измеряли также в интервале температур от 20 до 100°C. Термическая стабильность проверяли предварительной инкубацией очищенного лектина при заданных температурах через 10, 30, 40 и 60 минут инкубации и анализировали на гемагглютинацию в стандартных условиях анализа [4].

Результаты и их обсуждение

Как известно, лектины обладают свойством связываться с сахарами на клеточных мембранах, тем самым реформируя физиологию мембран, что приводит к агглютинации и другим биохимическим изменениям в клетках [11].

Лектины цианобактерий были обнаружены с использованием эритроцитов животных. Восприимчивость эритроцитов к некоторым лектинам повышается при мягкой обработке протеолитическими ферментами, что приводит к обнажению криптических остатков, находящихся на поверхности эритроцитов. Известно, что эритроциты животных, особенно овец и кроликов, более подходят для обнаружения лектинов в водорослях, чем эритроциты человека [6]. Следовательно, было показано, что лектин из Nostoc calcicolа 25 агглютинирует обработанные ферментом эритроциты кролика.

В наших исследованиях лектины из цианобактерий выделяли, используя метод извлечения гликопротеинов. Присутствие в экстракте цианобактерий лектинового белка было обнаружено с помощью анализа на гемагглютинацию (рис.1, 2).

Рисунок 1. Исследование гемагглютинации лектинового белка Nostoc calcicolа 25 1-неразведенные эритроциты; 2-8-разведение эритроцитов до 10⁷  в 0,1 М Трис-HCl буфере

А                                                  Б

Рисунок 2. Гемагглютинация эритроцитов крови кролика под воздействием лектина, где:  А – начальное состояние; Б – через 30 мин после добавления лектинового образца   Nostoc calcicolа 25 (Увеличение: 40х10)

Далее, молекулярную массу очищенного лектина оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Было обнаружено, что молекулярная масса лектина Nostoc calcicola 25 составляет 30 кДa (рис.3).

Влияние температуры, pH среды на активность лектина изучали
методом гемагглютинации. Показано, что лектин цианобактерий сохраняет свою активность диапазоне pH среды от 5 до 7,8, при этом оптимальный рН составляет 7,0 и 7,5. Установлено, что лектин цианобактерий Nostoc calcicola 25 является  термолабильным,  его активность полностью теряется в течение 30 мин при 70^оС  (рис. 4, 5).

Рисунок 3. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) лектина  Nostoc calcicola 25:  М-маркер с молекулярной массой (ColorBurst Electrophoresis Marker); 1-3 - варианты чистого лектина цианобактерий

Рисунок 4. Влияние pH среды на активность лектина, выделенного из Nostoc calcicola 25 (время инкубации = 90 мин.)

Рисунок 5. Влияние температуры на активность лектина цианобактерий Nostoc calcicola 25

Следует отметить, что лектин цианобактерий проявлял термостабильность до 50^оС и сохранял 100%-ную активность при 45°С. Следовательно, активность лектина выделенного из цианобактерий Nostoc calcicola 25 сохраняется в диапазоне температуры от 20^оС до 50^оС (рис.5).

Заключение

Водоросли - являются перспективным объектом для выделения биологически активных соединений. Лектины водорослей представляют собой молекулы с низкой молекулярной массой и могут быть менее антигенными при использовании в биологических моделях, как показано в нескольких исследованиях биологического применения лектинов водорослей. Лектины способны агглютинировать эритроциты, лимфоциты и микробные клетки на основании их углеводной специфичности. Известно, что на поверхности эритроцитов присутствует большое количество сиалогликопротеинов. Агглютинация приводит к поперечному сшиванию нескольких клеток крови, поскольку лектины специфически взаимодействуют с концевыми остатками сахара на поверхности эритроцитов. Таким образом, агглютинация эритроцитов является характерной чертой лектинов, которая играет роль в определении активности лектинов на основе анализа гемагглютинации. Также было обнаружено присутствие в экстракте цианобактерий лектинового белка  с помощью анализа на гемагглютинацию. Выявлено, что молекулярная масса лектина Nostoc calcicola 25 составляет 30 кДa. Большинство лектинов, выделенных из водорослей и цианобактерий представляют собой низкомолекулярные белки со значениями от 3,5 до 57 кДа. Установлено, что лектин цианобактерий Nostoc calcicola 25 является термолабильным, его активность полностью теряется в течение 30 мин при 70^оС. Показано, что лектин цианобактерий сохраняет свою активность диапазоне pH среды от 5 до 7,8. Экстремальные значения pH могут изменить нативную структуру лектина за счет изменения состояния ионизации аминокислотных остатков, что может привести к денатурации лектина. Таким образом, в данной работе сообщается об очистке и характеристике нового типа лектина, выделенного из цианобактерий Nostoc calcicola 25, которая легко культивируется в лабораторных условиях, что упрощает в будущем, получение полезного лектина.

Список литературы:

1. Кадырова Г.Х. Таксономия и некоторые свойства местных азотфиксирующих цианобактерий рода Nostoc // Доклады АН РУз.-Ташкент, 2012. - No1. -С.71-7.
2. Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н., Азова Л.Г., Нетрусов А.И., Семенова Е.В., Колотилова Н.Н., Захарчук Л.М., Зинченко В.В., Мыльникова С.И., Нефедова М.В., Ботвинко И.В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии [Текст] / Под ред. Егорова Н.С. – М.: Изд. МГУ. – 1995. – 224 с.
3. Ambrosi M, Cameron NR, Davis BG (2005) Lectins: tools for the molecular understanding of the glycocode. Org Biomol Chem 3:1593–1608.
4. Bennet H.J. and Roberts I.S. (2005) Identification of a new sialic acid-binding protein in Helicobacter pylori. FEMS Immunol Med Microbiol 44: 163-169.
5. Cheung RCF, Wong JH, Pan W, Chan YS, Yin C, Dan X, Ng TB (2015) Marine lectins and their medicinal applications. Appl Microbiol Biotechnol 99:3755–3773.
6. Freitas ALP, Teixeira DIA, Costa FHF, et al. (1997). A new survey of Brazilian marine algae for agglutinins. J Appl Phycol 9:495–501.
7. Kadirova G.Kh., Z.S.Shakirov Identification of nitrogen-fixing and salt-resistant cyanobacteria Nostoc calcicola isolated from the rhizosphere of cotton in Uzbekistan // Environmental Science An Indian Journal, 2012. – Vol. 7, Issue 8. - Р.305-309.
8. Khan F, Khan RH, Sherwani A, Mohmood S, Azfer MA (2002) Lectins as markers for blood grouping. Med Sci Monit 8:RA293–RA300.
9. Lee RB. (1999). Phycology. Cambridge, UK: Cambridge University Press.
10. Nascimento KS, Cunha AI, Nascimento KS, et al. (2012). An overview of lectins purification stratergies. J Mol Recognit 25:527–41.
11. Neves SA, Freitas ALP, Souza BWS, et al. (2007). Antinociceptive properties in mice of a lectin isolated from the marine alga Amansia multifida Lamouroux. Braz J Med Biol Res 40:127–34.
12. Praseptiangga D (2015) Algal lectins and their potential uses. Squalen Bull Mar Fish Postharvest Biotech 10:89–98.
13. Praseptiangga D (2017) Development of seaweed-based biopolymers for edible films and lectins. IOP Conf Ser: Mater Sci Eng 193:012003.
14. Rabelo L, Monteiro N, Serquiz R, Santos P, Oliveira R, Oliveira A, Rocha H, Morais AH, Uchoa A, Santos E (2012) A lactose-binding lectin from the marine sponge Cinachyrella apion (Cal) induces cell death in human cervical adenocarcinoma cells. Mar Drugs 10:727–743.
15. Ram Sarup Singh & Amandeep Kaur Walia Lectins from red algae and their biomedical potential J Appl Phycol (2018) 30:1833–1858.
16. Rudiger H, Gabius HJ (2001) Plant lectins: occurrence, biochemistry, functions and applications. Glycoconj J 18:589–613.
17. Sarangi I, Ghosh D, Bhutia SK, Mallick SK, Maiti TK. Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived. Int Immunopharmacol. 2006 Aug;6(8):1287-97.
18. Singh RS, Bhari R, Kaur HP. (2011b). Characteristics of yeast lectins and their role in cell-cell interaction. Biotechnol Adv 29:726–31.
19. Silva, A.J., Cavalcanti, V.L.R., Porto, A.L.F. Gama W. A., Brandão-Costa R. M. P. & Raquel Pedrosa Bezerra (2020) The green microalgae Tetradesmus obliquus (Scenedesmus acutus) as lectin source in the recognition of ABO blood type: purification and characterization. J Appl Phycol 32, 103–110.
20. Sharon N, Lis H (2004) History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules. Glycobiology 14:53R–62R. 19
21. Teixeira EH, Arruda FVS, da Silva BR, do Nascimento KS, Carneiro VA, Cavada BS, Nagano CS, Sampaio AH (2012) Biological applications of plants and algae lectins: An overview. In: Chang CF (ed) Carbohydrates—comprehensive studies on glycobiology and glycotechnology. In Tech, Croatia, pp 533–558.  20
22. Wang H. X. and Ng Tzi Bun (2004) Isolation of allicepin, a novel antifungal peptide from onion (Allium cepa) bulbs. Journal of Peptide Science. Mar;10(3):173-7. 21