ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА КОЛЛАГЕНА ИЗ КОЖИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

АННОТАЦИЯ

Получен коллагениз крупного рогатого скота. Коллаген исследованы хроматографическим, а также УФ- и ИК-Фурье методами. Проведен качественный анализ и количественный расчёт концентрации исследуемых свободных аминокислот путем сравнения времени удерживания и площадей пиков стандартных и исследуемых фенилтиокарбаматных производных аминокислот. В результате в образцах коллагена было идентифицировано 20 аминокислот, 10 из которых являются незаменимыми. Преобладающими аминокислотами в коллагене являются цистеин, глутаминовая кислота, глицин и аргинин. Следовательно, полученные данные позволили характеризовать коллаген как источник протоионогенных аминокислот.

ABSTRACT

Received collagen from cattle. Collagen was studied by chromatographic, as well as UV and IR Fourier methods.Qualitative analysis and quantitative calculation of the concentration of the studied free amino acids were determined by comparing the retention time and peak areas of the standard and studied phenylthiocarbamate derivatives of amino acids.As a result of the research, 20 amino acids were identified in collagen, 10 of which are essential.The predominant amino acids in collagen are cysteine, glutamic acid, glycine and arginine.Therefore, the obtained data allowed to characterize collagen as a source of protoionogenic amino acids.

Ключевые слова: коллаген из кожи крупного рогатого скота, аминокислота, хроматограмма, высокоэффективная жидкостная хроматография.

Keywords: bovine skin collagen, amino acid, chromatogram, high performance liquid chromatography

Введение

В последние годы в биотехнологии, медицине и ветеринарной медицине наблюдается увеличение спроса к новым материалам на основе коллагена [17; 13]. К явным преимуществам целого направления коллагена-пластики можно отнести высокую биологическую совместимость таких материалов и способность к регулируемой деградации. Причем экзогенный коллаген является не только формообразователем и транспортной средой для лекарственных средств, но и сам обладает биологической активностью, стимулируя репаративные процессы [6; 5; 9].

Коллаген является основным белком внеклеточного матрикса и наиболее распространенным белком, обнаруженным у млекопитающих, составляющим 70–80 % кожи (сухой вес) и 25 % всего белка. Коллаген действует как структурный компонент каркаса, отвечающего за упругость и  прочность костей суставов, волос, ногтей, кожи [15].

Коллаген является доминирующим компонентом внеклеточного матрикса млекопитающих. Встречается практически во всех тканях животных [14].

Известно, что белки очень ценны благодаря своему аминокислотному составу, так как аминокислоты являются главными строительными элементами в живом организме. Более 70 различных аминокислот выявлены в природе, но лишь 20 из них играют важнейшую роль в жизни человека. По способности синтезироваться в организме человека, животных и растениях все аминокислоты делятся на заменимые, незаменимые и частично незаменимые [7].

Обычно, ИК – спектр образцов коллагена показывает моды колебаний 1650, 1560 и 1235 см^-1, характерные для полос амида I, II и III, соответственно. Поглощение амида I возникает за счет из-за валентных колебаний C=O амида белка, а амид II деформационных колебаний N-H амида и валентных колебаний C-N [12]. Полоса амида III является сложной и состоит из компонентов растяжения C–N и изгиба N–H в плоскости из амидных связей. Он также состоит из поглощений, возникающих в результате вибрации групп CH₂ из глициновой основной цепи и боковых цепей пролина [там же]. Также наблюдаются полосы при 3450, 2850 и 1450 см^–1, которые представляют растяжение колец –OH, –CH₃ и пирролидина, соответственно. Отсутствие полосы поглощения при 1706 см^-1 может свидетельствовать об отсутствии свободной уксусной кислоты в образце.

Целостность тройной спирали коллагена, являющейся основной вторичной структурой различных типов волокнистого коллагена можно оценить по соотношению между оптической плотностью при 1235 и 1450 см^-1 [11].  Значения соотношения для денатурированного коллагена составляют около 0,5, а для неповрежденных структур - около 1. Это важная особенность, поскольку считается, что эта структура отвечает за биологические и механические свойства коллагена [там же].

Целью настоящей работы является изучение физико-химических свойств коллагена, выделенного из местного кожсырья крупного рогатого скота.

Материалы и методы

Коллаген выделен [8] из кожи крупного рогатого скота и предварительно очищен от низкомолекулярных солей методом мембранного диализа [2]. Степень очистки составляет 83,75%.

Хроматографическое обнаружение аминокислот проводили методом восходящей одномерной бумажной хроматографии (БХ) на бумаге марки FN-3 Mittelschnelllaufend в системе растворителей н-бутанол-кислота уксусная ледяная-вода (4:1:2) с использованием приема двойного разгона растворителей. Проявляли раствором нингидрина в ацетоне 2% [1].

Определение качественного и количественного содержания аминокислот коллагена проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе AgilentTechnologies 1200 со спектрофотометрическим детектором. Хроматографическая колонка 75х4,6 мм DiscoveryHSC₁₈. Хроматографический анализ проводили в режиме градиентного элюирования.

УФ–спектроскопические исследования проведены в спектрофотометре SPECORD 210 в интервале 190–1000 nm. Точность фотометрии UV с дихромат калием в соответствии с Ph.Eur.±0.01.

ИК-спектры снимали  с использованием инфракрасного Фурье-спектрометра «IRTracer-100» (SHIMADZU, Япония) в комплекте с приставкой нарушенного полного внутренного отражения (НПВО) MIRacle-10с призмой diamond/ZnSe (спектральный диапазон по шкале волновых чисел-4000÷400см^-1; разрешение - 4см^-1, чувствительность соотношение сигнал/шум-60,000:1; скорость сканирования-20 спектров в секунду).

Результаты и их обсуждение

Разделение и очистка белков методом диализа

Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большой молекулярной массой, не способны проникать через полупроницаемые перегородки (искусственные и естественные мембраны). При этом низкомолекулярные частицы (органические и неорганические) легко проходят через поры полупроницаемых мембран.

Диализ широко используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей (соли, сахара и других), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Прибор в котором проводят диализ, называется диализатором. Целлофановый или коллодиевый мешочек, опущенный в сосуд с водой, представляет простейший  диализатор. Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а низкомолекулярные вещества диффундируют через мембрану в воду.

Методом диализа можно разделить альбумины и глобулины. При переходе солей из белкового раствора в окружающую среду глобулины будут выпадать в осадок, т.к. они не растворимы в водной среде, а альбумины будут оставаться в растворе. Простейшим диализатором может служить целлофановый мешочек, опущенный в стакан с водой. Солевой раствор белка помещают в мешочек, при этом молекулы низкомолекулярных веществ (ионы соли) диффундируют через стенку мешочка, а крупные молекулы белка остаются внутри мешочка [2].

Определение свободных аминокислот

Для определения аминокислотного состава [10] необходимо привести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 М HCI и концентрированной трихлоруксусной кислоты (ТХУК) (1:3) при температуре около 160 ^оС в течение 1 ч.

Использовали стандартные образцы следующих аминокислот (SigmaAldrich): аспарагин (асп), глутамин (глу), гидроксипролин (о-про), серин (сер), глицин (гли), гистидин (гис), аргинин (арг), треонин (тре), аланин (ала), пролин (про), тирозин (тир), валин (вал), лизин (лиз), изолейцин (илей), лейцин (лей), фенилаланин (фен), метионин (мет), цистин (цис), цистеин (цис-цис), триптофан (три), а также фенилизотиоцианат (Fluka), изопропиловый спирт (о.с.ч.), ацетат натрия (х.ч.), ацетонитрило.с.ч. (SigmaAldrich, Германия), соляная кислота (х.ч.), гидроксид натрия (о.с.ч.), метилцианид о.с.ч.

На рисунке 1 представлена типичная хроматограмма аминокислотного состава полученного коллагена.

Выделение свободных аминокислот

Осаждение белков и пептидов водного экстракта образцов проводили в центрифужных стаканах. Для этого к 1 мл исследуемому образцу добавляли по 1 мл (точный объем) 20% трихлоруксусной кислоты, через 10 мин осадок отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 минут. Далее отобранную (0,1 мл) надосадочную жидкость лиофильно высушивали.

Качественный анализ и количественный расчет концентрации исследуемых свободных аминокислот проводили сравнением времени удерживания и площадей пиков стандартных и исследуемых фенилтиокарбомаилные (ФТК) – производных аминокислот [16].

Результаты исследования по изучению качественного и количественного содержания аминокислот методом ВЭЖХ представлены в таблице 1 и рис. 1.

Рисунок 1. Хроматограмма аминокислот коллагена

Таблица 1.

Содержание аминокислот в коллагене, определенных методом ВЭЖХ

* - незаменимые аминокислоты

Как видно из таблицы 1 и рис 1. образец коллагена содержат 20 аминокислот, 10 из которых являются незаменимыми (треонин, аргинин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, триптофан) [4]. По результатам ВЭЖХ  обнаруженные аминокислоты имеют следующее расположение:

Cys>Glu>Gly>Arg>Asn>Val>Trp>Phe>His>Asp>

>Lys>Thr>Ala>Pro>Leu>Ser>Ile>Gln>Met>Tyr

Следует отметить, что моноаминодикарбоновые кислоты исследуемого сырья представлены аспарагиновой и глутаминовой кислотами. Преобладающей аминокислотой в коллагене является составной частью фолиевой кислоты, она участвует в важных процессах обмена веществ, в переаминировании (наряду с аспарагиновой кислотой), в окислительном дезаминировании с образованием 2-кетоглутаровой кислоты, вовлекаемой в цикл трикарбоновых кислот, в декарбоксилировании, приводящем к образованию важного нейтропного агента γ-аминомясляной кислоты, и тем самым оказывает существенное влияние на физиологическое состояние организма.

В исследуемом сырье было идентифицировано 20 аминокислот, 10 из которых являются незаменимыми. Полученные данные позволили характеризовать коллагена как источник протоионогенных аминокислот.

Определение количества общего белка

Суть метода заключается в определении содержания общего азота по Кьельдалю с последующим пересчетом на белок.

Для анализа взвешивали в пробирке точную навеску, с погрешностью не более 0,1%. Навеску количественно переносили в колбу Кьельдаля. Далее эксперименты проводили по методическому указанию [3].

Обработка результатов: Массовую долю азота (Х) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака в серную кислоту вычисляли по формуле:

где: V_о– объем 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование 0,05 моль/л серной кислоты в контрольном опыте, мл. V₁– объем 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование серной кислоты в испытуемом растворе, мл; К– поправка к титру 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия;

0,0014 – количество азота, эквивалентное 1 мл 0,05 моль/л раствору серной кислоты;

М – масса навески, г.За окончательный результат испытания принимали среднее арифметическое результатов пяти параллельных испытаний.

Массовую долю азота в пересчете на сухое вещество продукта (коллаген), в процентах, вычисляли по формуле:

где: Х₁– массовая доля азота в испытуемой пробе, %;W– влажность испытуемой пробы, %.

Массовую долю белка (Y) в процентах вычисляли по формуле:Y=KЧX,гдеК– коэффициент пересчета азота на белок:с умеренным содержанием липидов – 6,38;

УФ-спектроскопические исследования коллагена

Проведены УФ-спектроскопические исследования растворов коллагена (рис.2).

Рисунок 2. УФ-спектр коллагена

В УФ-спектре коллагена наблюдаются полосы поглощения, связанные с амино- и карбоксильными группами в интервале 200-400 нм (рис. 2 линия).

ИК Фурье-спектроскопические исследования коллагена

Проведены ИК-Фурье спектроскопические исследования растворов коллагена.

Рисунок 3. ИК Фурье-спектр коллагена

В ИК-спектре коллагена наблюдается полоса 3288 см^-1,которая соответствует колебанию амидной группы (ν=(NH), 2935 см^-1 (ν=(С-H)) в структуре молекул коллагена (рис.3). Полоса поглощения при 1635см^-1 интерпретируется как полоса валентного колебания карбонильной группы(ν=(С=О) -амидI), 1521 см^-1 (ν=(С=О, С-N и δ=(N-H) - амидII)).Обнаружено, что в области 1448 см^-1 проявляются сигналы амид-III группы (ν=(N-С-O)).

Заключение

Методами ВЭЖХ, УФ- и ИК-спектроскопии изучены физико-химические свойства образов коллагена, выделенного из кожи крупного рогатого скота. Выделено и идентифицировано 20 аминокислот, 10 из которых являются незаменимыми. Преобладающими аминокислотами в коллагене являются цистеин, глутаминовая кислота, глицин и аргинин, что позволяет характеризовать коллаген как источник протоионогенных аминокислот. Полученный коллаген  представляет интерес для изготовления бактерицидных пленок для ветеринарии и медицины.

Список литературы:

1. Аминокислотный состав надземной части Geranium pratense L., Geranium sylvaticum L., Geranium palustre L. / К.Н. Разаренова, А.М. Захарова, И.Д. Протасова, Е.В. Жохова // Бутлеровские сообщения. – 2012. – Вып. 31, № 8. – С. 73–78.
2. Белки. Методические указания к лабораторному практикуму по дисциплине «Биохимия» для студентов специальностей 49 01 01 «Технология хранения и переработки растительного сырья», 49 01 02 «Технология хранения и переработки животного сырья», 91 01 01 «Производство продуктов и организация общественного питания». / Могилевский государственный университет продовольствия; сост.: О.Н. Макасеева, О.В. Дудинская, Л.М. Ткаченко. – Могилев : МГУП, 2003. – 37 с.
3. Методы контроля. Химические факторы. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672-03. – М. : Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
4. Нуруллаева Д.Х., Фарманова Н.Т. Изучение аминокислотного состава плодов овса посевного (Avena Sativa L.) // Химия и химическая технология. – Узбекистан, 2019. – № 3. – С. 64–67.
5. Парфенова Е.В., Икоева Т.М., Матийцо О.В. Направление использования коллагена в технологии косметических средств // Российских журнал кожных и венерических болезней. – 2000. – № 2. – С. 65–67.
6. Получение и исследования коллагена медицинского / О.И. Раджабов, Т. Гулямов, Н.М. Хусниддинова [и др.] // Узбекский химический журнал. Специальный выпуск. – 2011. – С. 94–97.
7. Скурихин И.М., Тутельян В.А. Таблицы химического состава и калорийности продуктов питания. Справочник. – М. : Deли Принт, 2007. – 320 c. 
8. Темирова М.И., Кодиров Т.Ж. Чарм ва мўйна технологияси. – Тошкент : Турон –  Иқбол, 2005. – 255 б.
9. Ширшакова М. Клей для стареющей кожи // Журнал по прикладной эстетике. – 2006. – № 2. – С. 96–99.
10. Akira Tsugita and Jean-Jacques Scheffler. A Rapid Method for Acid Hydrolysis of Protein with a Mixture of Trifluoroacetic Acid and Hydrochloric Acid // Eur. J. Biochem. – 1982. – № 124. – P. 585–588.
11. Cytocompatibility of Chitosan and Collagen-Chitosan Scaffoldsfor Tissuе Engineering / Ligia L. Fernandes, Cristiane X. Resende, Débora S. Tavares, Gloria A. // Brasil. Polímeros. – 2011. – Vol. 21, № 1. – P. 1–6.
12. Molecular interactions in collagen and chitosan blends / A. Sionkowska, M. Wisniewski, J. Skopinska [et al.] // Biomaterials. – 2004. – № 25. – P. 795.
13. Propolis Modifies Collagen Types I and III Accumulation in the Matrix of Burnt Tissue / P. Olczyk, G. Wisowski, K. Komosinska-Vassev [et al.] // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. – 2013. – P. 1–10.
14. Ricard-Blum S. The Collagen Family. Cold Spring Harbor Perspectives // Biology. – 2010. – № 3 (1).
15. Saurabh Tukaram Gondil, H B Janugade, Aakash Katkar. To Evaluate the Effect of Collagen Dressing in Diabetic Foot Ulcer Patients // Journal of Pharmaceutical Negative Results. – 2022. – № 13 (6). – P. 659–662.
16. Steven A., Cohen D.J. Amino Acid Analysis Utilizing Phenylisotiocyanata Derivatives // Analyt. Biochem. – 1988. – Vol. 17, № 1. – P. 1–16.
17. Xenogenic Tissues and Biomaterials for the Skeletal System / V. Graceffa, Z. Wu, D. Gaspar, K. Spanoudes [et al.] // Comprehensive Biomaterials II. – 2017. – P. 471–504.