НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ ГРИБОВ. 22-ДИМЕТИЛСТАХИБОТРИН ИЗ Stachybotrys chartarum

АННОТАЦИЯ

В ходе поиска новых и биоактивных молекул микробного происхождения для разработки лекарственных препаратов было обнаружено, что грибы Stachybotrys chartarum в целом являются источником новых и биоактивных вторичных метаболитов, имеющих большое значение. В свете вышесказанного изучение низкомолекулярных метаболитов токсического гриба Stachybotrys chartarum представляется актуальным.

ABSTRACT

In the search for new and bioactive molecules of microbial origin for drug development, it was found that Stachybotrys chartarum fungi in general are a source of new and bioactive secondary metabolites of great importance. In the light of the above, the study of low molecular weight metabolites of the toxic fungus Stachybotrys chartarum seems to be relevant.

Ключевые слова: Stachybotrys chartarum, хроматография, спектр, корреляция, взаимодействия, система, координата, микозы, гриба, низкомолекулярных, метаболитов.

Keywords: Stachybotrys chartarum, chromatography, spectrum, correlation, interactions, system, coordinate, mycosis, fungus, low molecular weight, metabolites

Многие грибы вредят здоровью людей и животных, вызывая заболевания микозы. Известны грибы возбудители накожных заболеваний, волосяных покровов, ногтей, являющиеся в ряде случаев причиной хронического гайморита, заболеваний глаз.

Особо вредоносны микотоксикозы заболевания человека и животных, связанные с отравлением пищевых продуктов и кормов токсинами (ядами) грибов. Известно явление «пьяного хлеба» заражение зерна грибами рода Fusarium. Токсические свойства гриба сохраняются даже при выпечке из них хлеба.

Использование в 30-х годах для кормления лошадей сена и соломы, пораженных грибом Stachybotrys chartarum, вызвало массовое заболевание и большую гибель лошадей (стахиботриотоксикоз). Новейший период развития медицинской микологии, начавшийся в 1951 г, характеризуется углубленными биохимическими исследованиями патогенных грибов, их ферментативных комплексов, а также поисками химически чистых продуктов жизнедеятельности патогенных грибов, полезных для целей специфической диагностики и терапии. В результате изыскания средств и методов химиотерапии грибковых заболеваний, широко проводимых во многих странах, открыт ряд активных препаратов нистатин, амфотерицин, кандицидин и др. грибковой природы [1].

Выращенный на питательном растворе Чапека (3л) в течение 14 суток мицелий гриба Stachybotrys chartarum отделили фильтрацией от водной части.

Обработка. 1) Отфильтрованный мицелий помещали в колбу с 50 мл эфира и нагревали на водяной бане при 40-45 ⁰С. Эфир сливали, операцию повторили трижды. Объединенные эфирные извлечения сгущали, сушили под вакуумом. Остаток 4,60 г Водную часть обрабатывали хлороформом, последний слушали, сушили. Выход 0,98 г. Общий вес экстракта (5,58 г).

2) Выращенный на яблоневом шроте (5 кг) гриб Stachybotrys chartarum заливали метанолом (10 л) и оставляли на сутки. Операцию повторили трижды. Объединенные метанольные извлечения сгущали, остаток сушили. Получили 10,58 г сухого экстракта.

Извлечение экстрактивных веществ из выращенного на соломе (5 кг) гриба Stachybotrys chartarum, проводили по аналогичной методике, как и в случае с яблоневым шротом. Получено 11,38 г экстракта.

Выделение 22-диметилстахиботрин. Сухой хлороформный экстракт штаммов Stachybotrys chartarum (11,38 г) наносили в колонку, содержащую 300 г силикагеля Silpeari. Колонку элюировали последовательно бензолом и системой 1. При элюировании колонки системой 1, выделили 60 мг 22-диметилстахиботрин.

22-диметилстахиботрин (I), C₂₇H₃₉NO₅, т.пл. 256°C (из МеОН), R_f=0,59 .(ТCX, силуфол, сист.1, [α]_D²⁴=14,5 ± 2°.

ИК-спектр (КВг, ν, см^-1): 3350-3140; 1675; 1650; 1630; 1475; 1360.

Масс - спектр, m/z (%): М⁺ 457 (95) [459,2483; C₂₆H₃₇N0₆]_, 441 (17,5) [441, 2401; C₂₆H₃₅NO₅], 428 (100), 410 (10) [410, 2251; C₂₅H₃₂NO₄], 368 (2,8), 354 (2), 342 (1,9), 339 (1,8), 312(1,9), 300 (3), 287 (3,3), 274 (10), [274, 1097; C₁₅H₁₆N0₄], 260 (10), 256 (7,5), 242 (10), 234 (12,5), 223 (30), 221 (20), 189 (15), [189,1649; С₁₄Н₂₁], 149 (12,5), 135(12,5),129(12,5),109(12,5).

Спектр ПМР-см. также табл. 1.

Спектр ЯМР ¹³С-см. также табл. 2.

3, 13, 24-триацетат - 22-диметилстахиботрина (II) из I. К 8 мг 22-диметилстахиботрина прилили 0,5 мл сухого пиридина и 0,25 мл уксусного ангидрида. Перемешав реакционную смесь, оставляли при комнатной температуре на 5 суток. После упаривания растворителей остаток хроматографировали на колонке, элюируя системой 2. Выделили 8,2 мг некристаллического триацетата II, C₃₃Н₄₅NО₈, схема – 1, R_f=0,38 (ТСХ, силуфол, системой 2.

ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 1771; 1744; 1728; 1700; 1615; 1480; 1373.

Масс-спектр, m/z (%): М⁺ 583 (15), 541 (3,75), 523 (100), 58 (10), 498 (5), 481 (37,5), 466 (10), 452 (5), 440 (10), 380 (5), 357 (6,25), 343 (6,25), 316 (12,5), 305 (30), 274 (8,75), 263 (20), 242 (10), 200 (45), 189 (23,8).

Спектр ПМР-см. также табл. 1.

13, 24 - диацетат 22-диметилстахиботрина (III) из I. 22-диметилстахиботрина (18 мг) ацетилировали 0,5 мл уксусного ангидрида в 1 мл абсолютного пиридина при комнатной температуре в течение 1 ч. Упарив растворители, остаток хроматографировали на колонке, элюируя системой 3. Выделили 21 мг аморфного диацетата III, C₃₁H₄₃NO₇, схема – 1, R_f=0,31 (TCX, силуфол, сист 3.

ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 3460; 1770; 1744; 1691; 1614; 1461; 1418; 1387; 1370.

Масс-спектр, m/z (%): М⁺ 541 (100), 525 (39,5), 510 (6,6), 501 (21,1), 483 (23,6), 470 (19,7), 458 (11,8), 440 (11,8), 428 (9,2), 346 (11,8), 305 (19,7), 242 (11,8), 189 (19,7), 175 (11,8), 135 (19,7), 119 (14,4), 107 (15,7), 95 (17,1), 81 (18,4), 69 (35,5), 55 (38,1).

Спектр ПМР-см. также табл. 1.

Спектр ЯМР ¹³С-см. также табл. 2.

13, 24 – диацетат 3 – дегидро-22-диметилстахиботрина (IV) из III. Диацетат III (15 мг) растворяли в 1 мл ацетона и охлаждали до -5°С. К раствору добавляли 2 капли реактива Джонса и перемешивали при той же температуре 10 мин. Реакцию прекратили добавлением нескольких капель метанола. После обычной обработки и упаривания растворителей продукт реакции хроматографировали на колонке, элюируя системой 4. Выделили 10 мг аморфного кетона IV. C₃₁H₄₁NO₇, схема – 1, R_f=0,28 (ТСХ, силуфол, сист. 4.

ИК-спектр (KBr, ν, см^-1): 1765; 1745; 1696; 1615; 1460; 1417; 1386; 1369.

Масс-спектр, m/z (%): М⁺ 539 (50), 497 (25), 479 (5,3), 468 (9,2), 455 (13,1), 439 (5,3), 426 (7,8), 413 (6,9), 350 (6,9), 332 (2,6), 284 (5,3), 256 (19,7), 129 (35,7), 107 (15,7), 97 (36,8), 91 (18,4), 83 (27,6), 73 (42,1), 69 (65,8), 55 (100).

Спектр ПМР- см. табл. 1

В данной статье приводятся результаты установления строения этого соединения.

Колоночной хроматографией суммы продуктов жизнедеятельности гриба Stachybotrys chartarum, выращенного в лабораторных условиях, выделили преобладающий по содержанию компонент, названный нами 22-диметилстихиботрином (схема 1).

Элементный состав 22-диметилстахиботрина определен высокоразрешающей масс- спектрометрией электронного удара - C₂₇H₃₉NO₅. Спектр ЯМР ¹³С изучаемого соединения I (табл. 2) содержащий сигналы при 156,88; 155,41; 138,66; 117,69; 113,32; 103,80 м.д., свидетельствует о том, что молекула 22-диметилстахиботрина включает пяти замещённое бензольное ядро. В соответствии с этим в спектре ЯМР ¹H соединения I (табл. 1) при 7,33м.д. наблюдается одно протонный синглет, отнесенный единственному ароматическому протону.

Таблица 1.

Химические сдвиги (δ, м.д.), мулътиплетности, КССВ (Ј, Гц) протонов 22-диметилстахиботрина (I) и его производных (0-ТМС)

Спектр соединения I снят в дейтеропиридине а соединения II-IV в дейтерохлороформе. Химические сдвиги, приведенные без мулътиплетностей и КССВ, определены из спектров 2М ЯМР ¹Н-¹Н, ¹Н-¹³С корреляций химических сдвигов. Сокращения: с-синглет, д-дублет, т-триплет, дд-дублет дублетов, тд-триплет дублетов, дт-дублет триплетов, тт-триплет триплетов, кд-квартет дублетов, м-мультиплет.

Интерпретация спектров ЯМР ¹Н, ¹³С, 2М, ЯМР ¹Н-¹Н и ¹Н-¹³С корреляций химических сдвигов позволяет построить фрагментарную структуру 22-диметилстахиботрина, приведенную на схема 1. Алициклическая часть молекулы состоит из 15 атомов углерода и напоминает скелет сесквитерпеноида дремана [2-4].

Таблица 2.

Показатели спектров ЯМР ¹H, ¹³C, ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC 22-диметилстахиботрина (I) и его диацетата III (δ, м.д., С₅D₅N, 0-ТМС)

Химические сдвиги, приведенные без мультиплетностей и КССВ, определены из спектров ¹H-¹H COSY и HMQC.

Ацетилирование 22-диметилстахиботрина уксусным ангидридом в пиридине дает триацетат II. Образование триацетата позволяет предположить, что в молекуле соединения I имеются три гидроксильные группы. В спектре ПМР триацетата II одно из ацетильных групп резонирует при 2,29 м.д., указывая на фенольный характер соответствующей гидроксильной группы. Действительно, в спектре ЯМР ¹³С наблюдается сигнал при 155,41 м.д., принадлежащий фенольному атому углерода.

В спектрах ПМР ацетатов II и III (СDCI₃) при 4,65 и 3,39 м.д. соответственно, наблюдается сигнал Н-3 в виде триплета с КССВ ³J=3 Гц. Приведенные величины химических сдвигов Н-3 свидетельствуют о том, что свободная гидроксильная группа в диацетате III находится при С-3 и следовательно, продукт III представляет собой 13,24-диацетат 22-диметилстахиботрина. Кетон IV, полученный окислением диацетата III по Джонсу, является 13, 24 - диацетатом 3 – дегидро – 22-диметилстахиботрина. КССВ рассматриваемых триплетов (³J=3 Гц) определяют β - экваториальную ориентацию Н-3. Значит, ацетоксильная группа при С-3 в соединении II и соответствующие гидроксильные группы в молекулах 22-диметилстахиботрина и его диацетата III имеют α – аксиальную конфигурацию.

Химическое изучение токсических компонентов (метаболитов), в том числе низкомолекулярных метаболитов макро- и микроскопических грибов, выявление природы действующего токсического начала. Вызывающего массовые отравления человека и животных, разработка методов выделения индивидуальных компонентов, установление новий химической структуры и модификации этих веществ.

Список литературы:

1. Билай В.И., Пидопличко Н.М. Токсинообразующие микроскопические грибы и вызываемые ими заболевания у человека и животных. Киев, Наукова думка, - 1970. -292с.
2. Kamolov LS, Aripova SF, Isaev MI, Stakhibotrin - a new natural compound. // Chemistry of nature, compound., Special. release -1997-, p. 4,
3. Kamolov L.S., Aripova S.F., Isaev M.I. Low molecular weight metabolites of fungi. I. Stachibotrin from Stachybotrys chartarum. // Chemistry of nature, compound., -1997-, p. 599-607.
4. Kamolov L.S., Aripova S.F., Tashkhodzhaev V., Isaev M.I. Low molecular weight metabolites of fungi. II. Clarification of the stachibotrin structure. // Chemistry of nature, compound., -1998-. p.666.