СТРУКТУРНЫЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИМЕРМЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ ХИТОЗАН/МЕДЬ И ХИТОЗАН/КОБАЛЬТ

Авторы благодарят сотрудника лаборатории «Интерполиэлектролитных комплексов и металлополимеров» Института химии и физики полимеров д-ра хим. наук Н.Р. Вахидову за предоставленные образцы для исследования

АННОТАЦИЯ

С интенсивным развитием нанотехнологии большое внимание уделяется созданию материалов, содержащих наночастицы металлов, стабилизированных синтетическими и природными полимерами. В данной статье изучены структуры и свойства полимерметаллокомплексов (ПМК) на основе хитозана с ионами металлов Со и Сu, комплексом физических и физико-химических методов, таких как просвечивающая электронная микроскопия, ИК- и УФ-спектроскопия и рентгенография.

ABSTRACT

Due to the intensive development of nanotechnology, much attention is paid to the creation of preparations containing metal nanoparticles stabilized by synthetic and natural polymers. In this article, is the were studied structure and properties of polymer metal complexes (РМС) based on chitosan with Co and Cu metal ions, using a complex of physical and physicochemical methods, such as transmission electron microscopy, IR and UV spectroscopy, and X-ray diffraction.

Ключевые слова: полимерметаллокомплексы, хитозан, наноструктура, наноразмеры, форма частиц.

Keywords: polymer-metal complexes, chitosan, nanostructure, nanosize, particle shape.

Особенности:

• получены НЧ ПМК на основе Хз с ионами металлов Со и Сu;
• ИК-спектроскопией доказано получение ПМК;
• УФ-методом определена доля ионного и восстановленного металла.

Введение

Биоцидные свойства металлических наночастиц (МНЧ) вызвали большой интерес с точки зрения их применения в качестве новых противомикробных агентов [8; 3]. Это связано с их более высокой площадью поверхности, которая способствует большему контакту с клеточной поверхностью патогенов. Эта особенность порождает тенденцию к образованию агломератов в основном из-за Ван-дер-Ваальсовых и электростатических сил. Важность стабилизации высокой поверхностной энергии во избежание такой агломерации с использованием агента, способного связываться с поверхностью частиц, в конечном итоге заключается в их стабилизации во взвешенном состоянии и последующем улучшении антимикробной активности [19].

Формирование наноструктур путем восстановления переходных металлов в растворах полимеров является приоритетным направлением, так как наличие в системе полимеров предотвращает агрегацию и окисление наночастиц. Особый интерес к хитозану как стабилизатору НЧ обусловлен тем, что он является нетоксичным, биосовместимым с живыми организмами и извлекается из возобновляемого сырья, в связи с чем находит все более широкое применение в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и биомедицине [1; 9; 20; 16; 7].

Несмотря на то что в настоящее время синтезировано большое количество ПМК d-металлов, поиск путей синтеза ПМК природных полисахаридов, в частности хитозана (ХЗ), и выявление их оригинальных свойств привлекает особое внимание. Безусловно, это связано с биологической активностью, биодеградируемостью ХЗ, а также его применением в различных отраслях народного хозяйства, в частности в индукторах устойчивости растений к патогенам и бактерицидных препаратах [1]

Механизм образования полимерметаллокомплексов хитозаном зависит от ряда факторов, таких как рН раствора, молекулярно-массовые характеристики ХЗ, молекулярная масса (ММ) и степень деацетилирования (СДА) и др. [7].

В присутствии алифатических алканолов, в условиях in situ могут быть получены хитозанстабилизированные НЧ серебра, меди и кобальта [18; 21]. Следует отметить, что серебро является активным металлом (=0,8 Э), из-за быстрого окисления и агрегации получение НЧ на его основе и регулирование их размера затруднительно. Также наночастицы металлов со средним размером 6–10 нм получают в растворах хитозана путем химического восстановления при комнатной температуре [15].

Хитозан позволяет образовывать хелаты с антимикробной активностью [11]. Эти характеристики делают хитозан и другие природные полимеры идеальным материалом для использования в качестве подложки для металлических наночастиц с антибактериальными свойствами для его потенциального использования в качестве замены некоторых традиционных методов лечения антибиотиками [10; 6]. Рост бактериальных штаммов с приобретенной устойчивостью к антибиотикам в последние годы был связан с чрезмерным использованием таких лекарств [17], повышая заболеваемость и смертность, что может потребовать более высоких затрат на более длительное лечение, включая госпитализацию [12; 5]. Более того, маловероятно, что бактерии могут развивать устойчивость к НЧ по сравнению с антибиотиками, поскольку металлы воздействуют на несколько мишеней в микробных клетках, включая клеточную мембрану, ДНК и активность ферментов [13; 14; 2].

Материалы и методы

Сотрудниками лаборатории интерполиэлектролитных комплексов и металлополимеров ИХФП АН РУз синтезированы комплексы хитозана (ХЗ) с ионами металлов (Со, Сu) [1].

Морфологию образцов проводили на просвечивающем электронном микроскопе ПЭМ-100.

ИК-спектроскопические исследования проводили на ИК-Фурье Inventio-S (Bruker, Германия) с приставкой нарушенного полного внутреннего отражения в диапазоне от 500 до 4000 см^–1. ИК-спектроскопия, в частности с приставкой многократного нарушенного полного внутреннего отражения, широко используется для изучения изменения химического состава модифицированного хитозана.

УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Specord 210 UV-Vis (Analytik Jena, Германия) с использованием кварцевых кювет диаметром 1 см, область сканирования – 190–1000 нм, щель – 1 нм. Скорость сканирования – 5 нм/с.

Содержание азота в образцах ХЗ и ПМК определяли по методу Дюма путем сожжения навески в кварцевой трубке за счет кислорода твердых окислителей в атмосфере двуокиси углерода. Измеряли объем выделившегося азота и рассчитывали его содержание в веществе по формуле:

X=[A×(V–N)×100]/G,

где  А – масса 1 мл азота при данной температуре и данном исправленном давлении (р);

V – объем азота, мл;

N – поправка для данного объема при калибровании азотометра, мл;

G – навеска, мг.

Результаты и обсуждение

Проведены электронно-микроскопические исследования, полученных наночастиц (НЧ) и наноструктур (НС) на основе металлокомплексов ХЗ/Co и ХЗ/Cu без и под воздействием ультразвукового диспергирования. Установлено, что размеры НЧ и толщина дендритов зависят от образца и концентрации растворов, уменьшаясь с ее понижением.

Проведенные структурные исследования показывают, что во всех образцах хитозана с металлами независимо от концентрации раствора хитозана наблюдаются наноразмерные частицы. При концентрации 0,5% раствора хитозана с металлами размеры частиц колеблются от 20 до 150 нм в зависимости от осадителя. Самые мелкие наночастицы Со наблюдаются при концентрации 0,1% (20–50 нм при осаждении спиртом, 35–70 нм при осаждении ацетоном).

Показано, что образуются сферические НЧ, размеры которых существенно уменьшаются при обработке УЗв, в результате чего возникают наиболее однородные и мелкие НЧ (30–80 нм), равномерно распределенные по всему объему. Результаты показывают принципиальную возможность получения НЧ ПМК на основе металлокомплексов хитозана.

На оптическом уровне все образцы, полученные из 0,1–0,5%-ного раствора ХЗ:Со, обнаруживают сплошную гранулярную структуру, размеры которых (гранул) (1,5–7 мкм) незначительно зависят от концентрации раствора, несколько уменьшаясь для 0,5%-ного раствора.

Для ХЗ Сu характерно наличие дискретных мелких частиц, размеры которых уменьшаются с уменьшением концентрации раствора, давая из 0,1%-ного раствора ХЗ Сu настолько мелкие частицы, что они не разрешаются на оптическом уровне.

На ПЭМ выявлены довольно крупные (300–500 нм) редкие дискретные сферические НЧ из 0,5% ХЗ Сu, дендриты и более мелкие НЧ, для 0,3%-ного раствора также наблюдаются мелкие НЧ (50–200 нм) и дендриты, и для 0,1%-ного раствора ХЗ:Сu еще более мелкие однородные НЧ (30–100 нм) и более тонкие дендриты, часто разрушенные или плохо сформированные сферические НЧ (рис. 1).

Для системы ХЗ Со из 0,5%-ного раствора наблюдается сетка полимера с порами и крупные агрегаты (>1 мкм), НЧ практически не наблюдаются. При уменьшении концентрации раствора до 0,3% на тонких дендритах появляются однородные мелкие НЧ (30–50 нм), а из 0,1%-ного раствора – НЧ размером (30–50 нм) и более крупные сферические НЧ (рис. 2).

Проведено исследование воздействия У/Зв в процессе введения осадителя в раствор комплекса ХЗ:Со. Показано, что при этом возникают однородные по размерам НЧ (30–80 нм) (рис. 3).

Рисунок 3. ПЭМ снимки ХЗ:Со + Ац + УЗ

Проведен анализ полимерметаллокомплексов на содержание азота с различным соотношением ХЗ:Ме.

Таблица 1.

Характеристика полимерметаллокомплексов по содержанию азота и меди

Как видно из таблицы 1, с повышением содержания ионов меди, от 8,21–14,22%, уменьшается содержание азота, от 5,23–4,31% по сравнению с содержанием азота в исходном образце (N=8,25%).

В зависимости от соотношения хитозана и кобальта (2:1, 1:2) содержание металла соответственно увеличивается от 3,37–6,92%, а содержание азота уменьшается по сравнению с исходным хитозаном.

Рисунок 4. ИК-спектры хитозана (1) и металлокомплекса ХЗ:Со (2)

На ИК-спектрах для хитозана (рис. 4) наблюдается широкий пик при 3360 см^–1, который относится к NH-группам и к водородным связям О-Н-групп. Отсутствие полосы около 3500 см^–1 указывает на отсутствие свободных ОН-групп. Полосы при 2851 и 2917 см^–1 относятся к симметричным и асимметричным колебаниям СН₂-групп. Также наблюдается полоса при 1420 см^–1, которая является ножничными колебаниями СН₂-групп. Пик – при 1638 см^–1 С=О амидной группы, а 1578 см^–1 к колебаниям NH-групп – вторичный амид. Асимметричные колебания С-О-С наблюдаются при 1196 см^–1 [4].

В отличие от хитозана в ИК-спектрах образцов металлокомплексов ХЗ c кобальтом и хитозана с медью (рис. 4, 5) наблюдаются полосы поглощения в области 500–650 см^–1 волновых чисел. Это связано с образованием координационных соединений, в которых центральный атом кобальта и меди образует координационную связь между аминогруппами, а также с гидроксильными группами при С₆. Эти пики относят к валентным колебаниям Со-N, Сu-N и Со-О, Cu-O связи. При этом пики, обусловленные деформационными колебаниями N-H при 1578 см^–1, соответствующими исходному хитозану, сместились в область 1551 см^–1, что свидетельствует об участии аминогрупп в образовании ПМК.

Рисунок 5. ИК-спектры хитозана (1) и металлокомплексов ХЗ:Сu (2)

Проведены УФ-спектроскопические исследования ПМК на основе ХЗ с медью для определения доли восстановленного и ионного металла. Для ионного состояния металлов электронные спектры находятся в видимой зоне электромагнитных волн. Как известно, в комплексных соединениях переходных металлов d-электроны, взаимодействуя с лигандами, расщепляются, и наблюдается сдвиг электронных переходов в соответствии с координационным числом металла.

Для определения доли восстановленных металлических частиц полученные УФ-спектры образцов описывали в виде суммы нескольких спектров, которые дают нам возможность определить площади для каждых пиков и оценить соотношение пиков. Как известно, у наночастиц металлов происходит плазмонный резонанс, который наблюдается при коротких длинах волн.

Рисунок 6. УФ-спектры ПМК ХЗ/Cu

В УФ-спектрах металлокомплексов хитозана с медью (рис. 6) наблюдаются полосы поглощения при 235 и 255 нм, связанные с возбуждением органического лиганда (хитозан), индуцированного присутствием ионов меди. Это переходы n → π* и π → π*, которые в УФ-видимом спектре хитозана находятся при 237 и 287 нм, но из-за взаимодействия с ионами меди в этих полосах наблюдается гипсохромный сдвиг. Широкая полоса при 800 нм при высоких длинах волн связаны с dd-электронными переходами. При этом ионы меди занимают определенное и фиксированное положение в решетке хитозана, и между атомами азота и гидроксильными группами хитозана и ионами меди устанавливается химическая связь. При восстановлении ионов меди до ноль валентного состояния наблюдаются полосы поглощения, связанные с плазмонными резонансами металлических наночастиц, которые проявляются в области длин волн от 500 до 600 нм. Проведя деконволюцию полосы поглощения УФ-спектра и учитывая полосы поглощения ионной и восстановленной меди, оценено соотношение восстановленной меди в виде наночастиц, которая варьируется от 10 до 40% и зависит от условий получения.

Рисунок 7. УФ-спектры ПМК ХЗ/Cо

УФ-спектроскопическое исследование растворов хитозана, хлорида кобальта и металлокомплекса ХЗ-Со (II) (рис. 7) показывает, что на спектре ХЗ имеются полосы поглощения, связанные с сопряженными связями ацетамидных групп при λ=238 нм и плечо при λ=300 нм, связанные с аминогруппами ХЗ. Также для ионов кобальта, участвующих в комплексных соединениях, характерный пик появляется при 511 нм, причем на спектре ХЗ-Со (II) сохраняются характерные полосы поглощения как для амино- и ацетамидных групп хитозана, так и для ионов кобальта. Как видно из спектров ХЗ-Со (II), наблюдается образование октаэдрического комплексного соединения кобальта, у которого лигандами являются ХЗ и вода. По теории кристаллического поля электроны d-оболочки кобальта расщепляются на два уровня энергии перехода между уровнями 2,42 эВ, которые соответствуют полосе поглощения при длине волны 511 нм.

Изучение процесса восстановления ионов кобальта свидетельствует о том, что восстановление ионов металла Со²⁺ приводит к смещению полосы поглощения при 511 нм к области меньших длин волн. Проведя деконволюцию полосы поглощения УФ-спектра и учитывая полосы поглощения ионного и восстановленного кобальта, оценено соотношение восстановленного кобальта в виде наночастиц, который варьируется от 10 до 30% от условий получения.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена принципиальная возможность получения НЧ ПМК на основе хитозана с медью и кобальтом. Показано, что в полимерметаллокомплексе хитозана с ионами кобальта при обработке ультразвуком происходит образование однородных наночастиц малого размера (30–80 нм).

С помощью УФ-спектроскопии определена доля ионного и восстановленного металла в ПМК.

Список литературы:

1. Вохидова Н.Р. Синтез, свойства и применение полимерметаллокомплексов хитозана Bombyx mori и хитозан стабилизированных наночастиц d-металлов: Автореф. дис. … д-ра хим. наук. – Ташкент : Научно-исследовательский центр химии и физики при НУУз, 2016. – 82 с.
2. Джамаледин Р., Yiu CKY, Zareetal EN. Достижения в области противомикробных пластырей с микроиглами для борьбы с инфекциями // Advanced Therapeutics. – 2020. – С. 200–212.
3. Достижения в области антимикробных органических и неорганических наносоединений в биомедицине / C.-Y. Ван, П. Макванди, Э.Н. Заре [и др.] // Advanced Therapeutics. – 2020. – P. 20–24.
4. ИК-спектроскопические исследования хитозана Bombyx Mori и его производных / С.М. Югай, С.Ш. Шахобутдинов, А.А. Атаханов, С.Ш. Рашидова // Химический журнал Казахстана. – 2019. – № 3 (67). – С. 254–265.
5. Использование антибиотиков и связанные с ними факторы в большой выборке госпитализированных пожилых людей / I. Ardoino, P.M. Mannucci, A. Nobili, C. Franchi // Journal of Global Antimicrobial Resistance. – 2019. – Vol. 19. – С. 167–172.
6. Калинска С., Яворски М., Вежбицки М. Наночастицы серебра и меди – альтернатива в будущем лечении и профилактике мастита // Международный журнал молекулярных наук. – 2019. – Вып. 20, № 7. – С. 1672–1678.
7. Куликов С.Н., Хайруллин Р.З. Хитозан // Механизм действия и роль химической структуры в антибактериальной и антимикотической активности хитозана / под ред. К.Г. Скрябина, С.Н. Михайлова. – М. : Центр «Биоинженерия» РАН, 2013. – С. 363–407.
8. Нанокомпозиты на основе антимикробных камедейи их промышленные и биомедицинские применения / E.N. Zare, P. Makvandi, A. Borzacchiello [et al.] // Chemical Communications. – 2019. – Vol. 55, № 9. – P. 14871–14885
9. Нудьга Л.А. Производные хитина и хитозана и их свойства // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение // под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, Б.П. Варламова. – М. : Наука, 2002. – С. 141–177.
10. Серебряные наночастицы: мощное нанооружие против бактерий с множественной лекарственной устойчивостью / M.K. Rai, S.D. Deshmukh, A.P. Ingle, A.K. Gade // Journal of Applied Microbiology. – 2012. – Vol. 3, № 5. – С. 841–852.
11. Сравнительная антибактериальная активность коммерческого хитозана и хитозана, экстрагированного из Auriculariasp / А.К. Чанг, Р.Р. Фриас-младший, Л.В. Альварес [и др.] // Биокатализ и сельскохозяйственная биотехнология. – 2019. – Вып. 17. – С. 189–195.
12. Устойчивость к антибиотикам у синегнойной палочки: механизмы и альтернативные терапевтические стратегии / Z. Pang, R. Raudonis, B.R. Glick [и др.] // Успехи биотехнологии. – 2019. – Т. 37, № 1. – С. 177–192.
13. Шах А., Хуссейн И., Муртаза Г. Химический синтез и характеристика пленок из нанокомпозитов хитозан. Серебро и его потенциальная антибактериальная активность // Международный журнал биологических макромолекул. – 2018. – Вып. 116. – С. 520–529.
14. Эльмехбад Н., Мохамед Н.А. Разработка, приготовление и оценка антимикробной активности биоматериалов на основе хитозана, модифицированного наночастицами серебра // Международный журнал биологических макромолекул. – 2020. – Вып. 151. – С. 92–103.
15. Ясна Лен, Гало Карденас, Маурисио Ариас. Синтез и характеристика металлических наночастиц в хитозане при химическом восстановлении // J. Chil. Chem. Soc. – 2017. – Vol. 62, № 4.
16. Farideh Shakeri., Ali Khaleghian. Developing a biopolymeric chitosan supported Schiff-base and Cu (II), Ni (II) and Zn (II) complexes and biological evaluation as pro-drug // International Journal of Biological Macromolecules. – 2020. – Р. 846–861.
17. Holmes H., Moore LSP, Sundsfjordetal A. Понимание механизмов и движущих сил устойчивости к противомикробным препаратам // Lancet. – 2016. – Vol. 387, № 10014. – С. 176–187.
18. Janiak Ch. Ionic Liquids for the Synthesis and Stabilization of Metal Nanoparticles // Naturforsch. – 2013. – № 68b. – P. 1059–1089.
19. Jayeoye T.J., Nwabor O.F., Rujiralai T. Синтез высокостабильных и диспергированных наночастиц серебра / поли (виниловый спирт-со-этиленгликоль) / поли (3-аминофенилбороновая кислота) нанокомпозита: характеристика и антибактериальные, гемолитические и цитотоксические исследования // Журнал промышленной и инженерной химии. – 2020. – Вып. 89. – С. 288–300.
20. Philippova O.E., Korchagina E.V. Chitosan and its hydrophobic derivatives: Preparation and aggregation in dilute aqueous solutions // Polymer Science. Series A. – 2012. – Vol. 54, № 7. – P. 552–572.
21. The Properties of Chitosan-Cobalt Nanoparticle Solutions and Related Composite Films / A.M. Bochek, N.R. Vokhidova, N.N. Saprykina [et al.] // Polymer Science, Ser. A. – 2015. – Vol. 57, № 4. – P. 460–466.