ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МОЧИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПАЛЛАДИЯ С МЕКСИДОЛОМ

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты изучения хронической токсичности нового комплексного соединения на основе палладия и мексидола в моче экспериментальных крыс. Целью исследования является проведение общего анализа мочи экспериментальных животных на фоне применения нового комплексного соединения на основе палладия с мексидолом в сравнительном аспекте с цисплатиной.

ABSTRACT

The article presents the results of studying the chronic toxicity of a new complex compound based on palladium and mexidol in the urine of experimental rats. The aim of the study is to conduct a general analysis of the urine experimental animals against the background of the use of a new complex compound based on palladium and mexidol in comparative aspect with cisplatin.

Ключевые слова: новое комплексное соединение на основе палладия с мексидолом, цисплатин, показатели общего анализа мочи.

Keywords: new complex compound based on palladium and mexidol, cisplatin, urinalysis indicators.

Введение

Поиск относительно малотоксичных лекарств среди химиотерапевтических средств является актуальной проблемой медицины. Учитывая механизм действия этих препаратов на злокачественную клетку, вероятность повреждения здоровых клеток организма достаточно высока. Основными требованиями к химиотерапевтическим средствам является их высокая эффективность наряду с высокой безопасностью. Т.е. необходимы препараты с максимальной терапевтической эффективностью на фоне минимальной токсичности [4]. Среди группы препаратов для химиотерапии производные платины считаются одним из наиболее эффективных [8]. Но возможность их применения ограничивает высокая гепато-, нефро- и нейротоксичность. Наиболее перспективными среди комплексных соединений других металлов платиновой группы, оказывающие выраженное противоопухолевое и значительно меньшее токсичное действие для организма в целом, оказались соединения палладия [3,4]

Синтезированный на базе НИЦ АМУ новый комплекс на основе палладия с мексидолом (НКС) -2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин аммоний тетрахлоропалладиевокислый, предположительно имеет противоопухолевую активность, которую доказал проф. др. Бурак Тюзюн, математической моделью. В этой связи нам представляется актуальным в первую очередь сравнительное изучение токсичности данного соединения с цисплатиной, широко использующийся в медицине в качестве противоопухолевого средства.

В статье опубликованы результаты некоторых физико-химических показателей мочи на фоне применения НКС и цисплатины у экспериментальных животных.

К определению физических свойств мочи относятся количество, цвет, наличие осадка и плотность. К химическим свойствам мочи относятся определение ее реакции или pH, наличие белка, глюкозы, кетоновых тел, билирубина, уробилиногена, крови и т.д. [2].

Материалы и методы

Исследования проводили на беспородных белых половозрелых лабораторных крысах - самцах весом 200-220г. Все животные, используемые в экспериментах, содержались в одинаковых условиях ухода и пищевого режима. Эксперименты на животных проводились согласно «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях», Страсбург, 1986 г. Проведение эксперимента разрешено решением Этического Комитета при Азербайджанском Медицинском Университете за № 10 от 16.10.2019 года. Животные были поделены на 3 группы:

1-я группа – контрольная состоит из 10 крыс.

2-я группа - основная из 50 крыс, получавших исследуемое соединение в течение 7, 15, и 30 дней в дозе равной 1/10  LD₅₀ , составляющей 0,004/ 100 г веса животного. А затем на протяжении 10 и 30 дней отслеживали состояние животных.

3-я группа - основная из 50 крыс, получавших цисплатин также в дозе равной

1/10 LD₅₀, что соответствует дозе 0,0007/ 100 г веса животного (1,3 мг для крысы весом 200 гр, длиной туловища 20 см), также в течение 7, 15, и 30 дней, а затем на протяжении 10 и 30 дней отслеживали состояние животных.

Исследование мочи проводили при помощи различных тест анализаторов. Пробы мочи забирали у животных, содержащихся в метаболической камере с встроенным приемником мочи. Устройство также не позволяет смешивание мочи с калом. Тест- полоски (стикеры) опускали в мочу согласно инструкции в течении 1 минуты, а затем просушивали в течении 10 минут. Интенсивность окрашивания тестового поля стикеров сравнивали с шаблонной цветовой шкалой, представленной производителем.

Общий анализ мочи проводили с использованием тест стикеров производства Турции «True Line 10 M», позволяющий определять в моче количество осадков, наличие крови, билирубин, уробилиноген, кетоны, белки, нитриты, глюкозу, PH и плотность мочи, а также количество лейкоцитов.  Указанные показатели согласно данным производителя имели следующие значения для:

• Кровь: +  -  10 RBC/ ml; ++  - 50 RBC/ ml; +++ - 250 RBC/ ml.
• Билирубин: - -норма, + - присутствует, ++ - много, +++ - очень много
• Уробилиноген: 0,1 - норма; - 1mq/dl (16 mmol/L); + 2 mq/dl (33 mmol/L); ++ - 4mq/dl (66 mmol/L); +++ - 8 mq/dl (131 mmol/L).
• Кетоны: норма -  ±5 mq/dl (0,5 mmol/L); +  - 15 mq/dl (1,5 mmol/L); ++ - 40 mq/d l(3,9 mmol/L); +++ - 100 mq/dl (10 mmol/L).
• Белки: + - 30 mq/dl (0,3 q/l); ++ - 100 mq/dl (1,0 q/l); +++ - 300mq/dl (3,0 q/l).
• Нитриты: желтый цвет - neq, розовый цвет- trace, сиреневый цвет - pos.
• Глюкоза: голубой цвет - neq; ± 100mq/dl (5,5 mmol/L); + - 250 mq/dl (14 mmol/L); ++ - 500 mq/dl  (28 mmol/L), +++ - 1000 mq/dl (55 mmol/L).
• PH: оранжевый цвет- 5; желтый - 6; желто-зеленый -6,5; светло-зеленый - 7; зеленый - 8; бирюзовый - 9.
• Количество лейкоцитов: розовый цвет - негатив; + - 25 WBC/ml;  ++ - 75 WBC/ml; +++ - 500 WBC/ml.

Результаты исследования

Результаты наших наблюдений в экспериментальных группах были следующими:

Цвет мочи здоровых интактных животных имеет соломенно-желтый цвет [1,9]. Во второй группе на 7-ой день исследований у семи животных из десяти (р>0,05) цвет мочи изменялся и приобретал темно- желтый цвет. На пятнадцатый день цвет урины менялся в темно- желтый у всех животных (100%; р>0,001). На 30-й день эксперимента урина у 7 крыс приобретала коричнево-желтый оттенок (р>0,01), а у 3-х бурый, что свидетельствует об усугублении патологических изменений.

После прекращении введения НКС на десятый день наблюдений патологичный коричнево-желтый цвет урины оставался у 8 животных (р>0,001), а через месяц только у 3 животных (р>0,05), что говорит об обратимости патологических изменений, произошедших на фоне применения НКС.

В третьей группе, получавшей цисплатин цвет урины также менялся, но динамика процесса и интенсивность была значительна выше. Так, на седьмой день у всех 10 животных из десяти (р>0,001) цвет мочи приобретал темно- желтый цвет. Уже на 15-й день цвет урины у всех 10 животных становился коричнево - желтым (р>0,001), приобретая коричневый цвет, а на 30-й день (100%; р>0,01), что свидетельствует о более глубоких патологических изменениях. 

После прекращении введения цисплатина на десятый день наблюдений патологичный процесс продолжался и при этом коричнево-желтый цвет урины сохранялся у 6 животных (р>0,05), у 4 животных приобретал коричневый цвет (р>0,05). На тридцатый день наблюдений отмечается улучшение цветового показателя, и при этом темно-желтый цвет отмечался у 5 животных (р>0,05), у остальных 5 животных цвет мочи имел коричнево-желтый окрас (р>0,05).  На основании данных наблюдений можно заключить, что обратимость восстановления нормального цвета мочи в течении месяца после прекращения применения препарата не происходит полностью, хотя тенденция к этому наблюдается.

Интерес представляет сравнительная оценка изменений цвета урины на фоне применения исследуемого соединения и цисплатина. Статистический анализ, полученных данных показывает, что на фоне применения НКС отклонение цвета урины от нормального соломенно-желтого цвета в патологическом направление в темно-желтый цвет, что свидетельствует о повышении в ней концентрации желчных кислот из-за патологий печени, обезвоживании, застойных явлений в кровеносной системе и др. нежелательных изменений происходит значительно меньше и в более поздние сроки.

Коричневый оттенок мочи, как принято считать, свидетельствующий о выведении мышечного белка миоглобина, на фоне НКС проявляется в моче  незначительно в виде коричнево-желтого цвета на 10-й день после прекращения применения, тогда как на фоне применения цисплатины этот цвет обнаруживается на 7-ой день применения и остается до конца эксперимента. Таким образом, исследуемый комплекс на цветовой показатель мочи животных оказывает менее выраженное воздействие и этот процесс обратим в более короткие сроки после прекращения введения, чем на фоне применения цисплатины.

Суточное количество выделяемой мочи, наличие осадка также являются важными характеристиками при определении степени интоксикации [5,6].

Так как здоровые животные пьют больше воды, поэтому объем выделяемой ими мочи больше [1]. Как видно из таблицы 1, во второй группе на 7-ой день после введения НКС общий объем мочи снижался на 17,5 %, продолжая понижаться в последующие дни, на 15 день снижался на 21,6%, а на 30 сутки – на 27,5% по сравнению с интактными значениями. После прекращения введения вещества диурез постепенно нормализовался и разница с интактными значениями на 10 сутки составляла 12,5%, а на 30 день – 9,2%.

Таблица 1.

Количество выделяемой мочи на фоне применения НКС и цисплатина

В третьей группе, получавшей цисплатин на седьмой день общий объем мочи снижался на 21,6%, продолжая понижаться в последующие дни, на 15 день снижался на 25,8%, а на 30-е сутки немного увеличивался, но оставаясь меньше интактных значений на 17,5%. После прекращения введения цисплатины объем выделяемой мочи продолжал повышаться, но не доходил до интактных значений. Разница с интактными значениями на 10 сутки составляла 14,16%, а на 30 день – 8,3%.

Изменение количества и динамика, выделяемой суточной мочи в обеих группах незначительно отличаются между собой, а на 7-е и 15-е сутки и после прекращения введения веществ эти данные статистической достоверностью не обладали.

Оценка показателей мочи с использованием тест стикеров производства Турции «True Line 10 M»,выявила существенные отклонения многих показателей у крыс по сравнению с интактными животными, особенно отклонения были значительными у животных 3-ей группы.

Ph мочи является важной частью информации и дает представление о функции канальцев. В норме моча слегка кислая из-за метаболической активности. [1]. На 7-ой день на фоне применения НКС, рH доходил до 5,5 (5-6) от 5,0 (5-5) исходных значений, повышаясь на 10% при р<0,05, на 15-й день pH также продолжал повышаться и доходил до 6,3 (6-7), повышаясь на 26% при р<0,001. В 30-й день введения pH не изменялся. После отмены введения НКС на 10 - й день pH почти не изменился. На 30-й день наблюдений после отмены pH был в пределах нормы 5,5 (5-7).

В третьей группе, получавшей цисплатин на 7-ой день исследований pH доходил 6,4 (6-7) от 5,0 (5-5) исходных значений, повышаясь на 28% при р<0,001. На 15-й день pH почти не изменился  и был на уровне 6,6 (6-7), превышая интактные значения на 31% при р<0,001. На 30-й день pH повысился до 7,2 (7-8), увеличившись на 44% при р<0,001. После отмены введения цисплатина на 10-й день pH немного снизился до 6,9 (7-8), оставаясь повышенным на 38% при р<0,001. В последующие дни показатели pH продолжала восстанавливаться и доходила до значений 6,5 (6-7), оставаясь повышенным по сравнению с интактными значениями на 29% при р<0,001.

Определение в суточной моче наличие следов крови, уробилиногена, белков и лейкоцитов в моче показало следующее: [1,5,6,7,9,10,11,12]. Результаты представлены в таблице 2.

Билирубин – показатель, характеризующий функциональное состояние печени и степень распада эритроцитов. Это вещество является конечным продуктом распада гемоглобина. Как видно из таблицы 2, у испытуемых животных показатель билирубина увеличивался во все дни введения, особенно на 15-й и 30-е дни. Так на 15-й день билирубин во 2-ой группе был «++» у 70% (р>0,05), а в 3-ей «+++» - у 60% (р=0,016).  На 30-й день содержание билирубина в моче увеличилось на очень много  «+++» у 50% животных 2-ой группы (р=0,016) и  у всех 100% животных 3-ей гр. (р<0,001). Далее в обеих гр. происходило снижение билирубина, в особенности во 2-ой гр. Так через месяц после остановки введения  у 30% животных 2-ой гр. было полное отсутствие  билирубина, а в 3-ей гр. полного отсутствия не было ни у одного животного.

Наличие крови в моче -  патологическое состояние, которое может свидетельствовать о заболевании почек, уретры, мочевого пузыря и других органов. Кровь обнаружилась в моче животных 3-ей гр. уже на 7-ой день, а во 2-ой гр. лишь на 15-й день введения. Далее происходило уменьшение содержания крови в моче у животных обеих групп. Через месяц после остановки введения во 2-ой гр. животных было полное отсутствие крови в моче.

Нормальная моча содержит низкую концентрацию уробилиногена. Уровень его резко возрастает при гемолитической желтухе, а также при токсических и воспалительных поражениях печени, кишечных заболеваниях. Во второй группе на 7-й день повышение уровня уробилиногена не выявлено, а в 3-ей гр. уробилиноген «+» повысился у 70% крыс (р=0,002).  На 15-й день во 2-ой гр. повышение уровня уробилиногена «+» отмечено у 70% животных (р<0,001), а в 3-ей гр. у 60% крыс (р=0,005) – в значительном количестве «++». На 30-й день во 2-ой гр. значительное повышение уровня  уробилиногена «++» отмечено у 60% животных  (р=0,005), а у 40% крыс (р=0,043)– незначительное увеличение (+). В 3-ей гр. «++» было у 60% (р>0,05), «+++» у 40%

Далее происходило понижение уробилиногена в обеих группах и через месяц после остановки введения во 2-ой гр. у 60% животных уробилиноген был в пределах нормы. В то время как, в 3-ей гр. содержание изучаемого показателя ни у одного животного не было в норме, у 20% был в значительном - «++» (р>0,05), а у 70% в незначительном количестве «+» (р=0,01).

Белок в норме в моче отсутствует или присутствует в неопределяемой обычными методами концентрации. Белок на 7-ой день введения в моче животных 2-ой гр. отсутствовал, в то время как появился у половины животных 3-ей гр. В следующие дни происходило повышение в обеих группах, но во 2-ой гр. по сравнению с 3-ей было меньше концентрации белка. К концу эксперимента в моче у половины животных 2-ой гр. белок полностью отсутствовал, а в 3-ей гр. полного отсутствия не было.

Таблица 2.

Сравнительный анализ содержания в суточной моче у экспериментальных животных крови,билирубина,белков и лейкоцитов

В норме в моче лейкоциты отсутствуют. На 7-й день во 2-ой гр. лейкоциты в незначительном количестве «+» выявлены у 30% животных (р>0,05), а в 3-ей у 50% (р>0,05). Далее наблюдалась негативная динамика в обеих группах.

На 15-й день во 2-ой гр. лейкоциты «+» выявлены у 60% животных (р<0,05). В 3-ей гр. «+» и значительном количестве «++» выявлены поровну каждого (р=0,016).

На 30-й день во 2-ой гр. лейкоциты были выявлены в моче у всех животных: «++» у 60% животных (р=0,005), «+» у 40% крыс (р=0,005). На фоне применения цисплатины лейкоциты «+» обнаружились в моче 20% крыс (р>0,05), у 60% животных - «++» (р>0,05) и у 20% крыс в большом количестве «+++» (р>0,05).

Показатели лейкоцитов в последующие дни продолжали улучшаться и после отмены введения НКС на 10-й день лейкоциты были выявлены в моче «+» у 60% животных (р=0,005). В 3-ей гр. лейкоциты «+» (р>0,05) и «++» выявлены у животных поровну (р=0,016).

На 30-й день наблюдений картина была нижеследующей: во 2-ой гр. не обнаруживались у всех животных, а в 3-ей гр. выявлены «+» у 40% животных (р=0,043) и «++» у 20% животных (р>0,05), а у остальных не выявлено.

Рисунок 1. Наличие осадка в суточной моче животных, получавших  НКС и цисплатин

Количество осадка в суточной моче животных 2-ой и 3-ей группы в сравнительном аспекте демонстрирует рис. 1. Из рисунка наглядно видно, что на 7-й день на фоне применения цисплатина в моче осадок начинает появляться у 90% животных, тогда как на фоне применения комплексного соединения осадка нет в моче в 70% случаев. На 15-й день применения просматривается однозначно негативная динамика, причем на фоне применения цисплатина она более выражена. Так, в этой группе в 10% случаев – осадков мало (осадок есть), много осадков у 50% животных и уже в 40% -осадков очень много. Тогда как на фоне применения комплекса картина более утешительна: у 80% животных в моче осадков много и только у 20% - очень много. В последний 30-й день введения исследуемых веществ данный показатель сохранял динамику патологических изменений. На фоне применения НКС у 10% животных в моче осадок обнаруживался в незначительных количествах, у 50% - много осадка и у 40% - очень много осадка. А на фоне применения цисплатина у 30% животных в моче много осадка, у 70% - очень много. Данные показывают, что на фоне применения НКС сроки появления и обильность осадка значительно менее выражено, чем при введении животным цисплатина. Наблюдения после прекращения введения животным исследуемых веществ показало, что обратное развитие событий на фоне применения цисплатины проходит менее активно, чем на фоне применения НКС. Так, на 10 день наблюдений после применения комплекса очень много осадка обнаруживается в 20% случаев, много осадка также наблюдается в 20%, а в 60% уже осадок обнаруживается в незначительных количествах. После применения цисплатина хотя очень много осадка не было в моче ни у одного животного, но много осадка – у 60% и незначительно - только у 40% животных. На 30 день наблюдений во 2-ой  группе, получавшей НКС в 40% осадка нет, в 50% - осадок в незначительном количестве и только в 10% - осадка много, тогда как в группе получавшей цисплатин осадок не обнаруживался только у 10% животных, незначительное количество у 60%, и много осадка у 30% животных.

Таблица 3.

Сравнительный анализ содержания в суточной моче животных кетонов, нитратов, глюкозы на фоне введения НКС и цисплатина

Как видно из таблицы 3, содержание в суточной моче животных кетонов, нитратов, глюкозы на фоне введения НКС и цисплатина изменялись незначительно и в конце эксперимента приближались к норме.

Заключение. Сравнительный анализ данных по содержанию в суточной моче животных крови, билирубина, уробилиногена, белка, кетонов, нитратов, глюкозы, лейкоцитов на фоне введения НКС и цисплатины показал, что практическое значение имеет в моче изменение содержания лейкоцитов, уробилиногена, билирубина, белков и крови в моче. Эти показатели статистически достоверно меньше изменяются на фоне применения НКС, чем на фоне применения цисплатины. Так во второй группе показатели мочи к концу эксперимента были более близки к интактным, чем в третьей группе. Что является подтверждением меньших повреждений печени и почек комплексным соединением и соответственно указывают на его меньшую токсичность для печени и почек.

Список литературы:

1. Абрашова Т.В., Гущин Я.А., Ковалева М.А., Рыбакова А.В., Селезнева А.И., Соколова А.П., Ходько С.В. СПРАВОЧНИК. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных. СПБ.: Изд-во «ЛЕМА», 2013.- 116 с.
2. Багиров И.М., Гасымов Ш.Г., Ахундов Р.А., Гасанов Х.И. Биологически активные комплексы палладия (II) с 3-окси-6-метил-2-этилпиридином / В сборнике: Онкология - XXI век. Материалы XXIII Международной научной конференции по онкологии; IX Итало-российской научной конференции по онкологии и эндокринной хирургии; XXIII Международной научной конференции «ЗДОРОВЬЕ НАЦИИ – XXI ВЕК» . 2019:С. 35-37.
3. Балакина А.А., Пещерова К.С., Ступина Т.С., Корнев А.Б., Якушев И.А., Столяров И.П., Терентьев А.А. Изучение механизмов цитотоксического действия карбоксилатных комплексов палладия с гетероциклическими азотсодержащими лигандами // Российский биотерапевтический журнал. 2017:Т. 16:С. 8
4. Ефименко И.А., Филимонова М.В., Чураков А.В., Иванова Н.А., Ерофеева О.С., Самсонова А.С., Подосинникова Т.С., Филимонов А.С. «Первые полиядерные соединения палладия [(C5H12NO)(PDCL3)]N И [(C10H16NO)2(PD2CL6)] с высокой противоопухолевой и радиопротекторной активностью» //Координационная химия. 2020. Т. 46. № 5. С. 304-315
5. Кирпатовский В.И., Мудрая И.С., Греков Е.А., Кабанова И.В., Голованов С.А., Дрожжева В.В., Надточий О.Н  «Влияние экспериментально вызванного метаболического синдрома на функциональное состояние мочевого пузыря у крыс»// Журнал "Экспериментальная и клиническая урология" Выпуск №1 с.8-13
6. Кирсанова А.Ю., Кубрак Н.В. «Показатели осадка мочи здоровых крыс линии вистар»// Лабораторные животные для научных исследований. – 2022. - № 1 с.3-7 https://doi.org/10.29296/2618723X-2022-01-01
7. Пономарева Е.И.  1 Лукина С.И.  1 Одинцова А.В// «Исследование влияния ахлоридного хлеба «завет» на медико-клинические показатели крови крыс»  Успехи современного естествознания. – 2015. – № 9 (часть 2) – С. 331-335 УДК 664. 66: 664. 788.3
8. Сорокина Л.Д. «Платина, палладий, технеций и их соединения, обладающие антираковой активностью» //Forcipe. 2019:Т. 2:№ S:С. 588.
9. Abnormal Urine Color Ryan D. Aycock, MD, MS, Dara A. Kass, MD Pages 43-47 January, 2012 Volume 105 - Issue 1 DOI 10.1097/SMJ.0b013e31823c413e
10. Echeverry G, Hortin GL, Rai AJ. Introduction to urinalysis: historical perspectives and clinical application. Methods Mol Biol. 2010;641:1-12.
11. Simerville JA, Maxted WC, Pahira JJ. Urinalysis: a comprehensive review. Am Fam PHysician. 2005 Mar 15; 71(6):1153-62
12. Yadav. S. N.  , Ahmed N.  ,  Nath. A. J. , Mahanta D.,  Kalita M. K. «Urinalysis in dog and cat»// Vet World 2020 Oct;13(10):2133-214 doi: 10.14202/v etworld.2020.2133-2141.