АНТИОКСИДАНТНАЯ/АНТИРАДИКАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИФЕНОЛЬНОГО СОЕДИНЕНИЯ ПС-2

АННОТАЦИЯ

В данной статье изучена антиоксидантная (АОА) и антирадикальная активность (АРА) полифенольного соединения 1-О-галлоил-2,3-гексагидроксидифеноил-4,6-валонеил-β-D-глюкоза (ПС-2), выделенной из растений семейства Euphorbia. Антирадикальную активность исследовали по отношению к свободному радикалу 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилу (ДФПГ). Установлены количественные характеристики реакции восстановления ДФПГ исследованным полифенолом. Показана высокая способность изученных соединений тушению свободных радикалов. Антиоксидантная активность исследовалась на митохондриях печени крыс методом Fe²⁺/аскорбат индуцированным набуханием.

ABSTRACT

The antioxidant (AOA) and antiradical activity (ARA) of the polyphenolic compound 1-O-galloyl-2,3-hexahydroxydiphenoyl-4,6-valoneyl-β-D-glucose (PC-2), isolated from plants of the Euphorbia family were investigated. Antiradical activity was studied with respect to the free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Quantitative characteristics of the DPPH reduction reaction with the studied polyphenol have been established. The high ability of the studied compounds to quench free radicals was shown. Antioxidant activity was studied in rat liver mitochondria using the Fe²⁺/ascorbate induced swelling method.

Ключевые слова: ПС-2, АОА, митохондрии, АРА, ДФПГ, константа реакции

Keywords: PC-2, AOA, mitochondria, ARA, DPPH, reaction constant

Изучение роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран в регуляции клеточных функций представляет интерес по многим причинам. Индукция данного процесса в мембранах приводит к изменению их проницаемости, мембранного потенциала, разобщению процессов окисления и фосфорилирования а также ингибирования гидролиза АТФ. Влияние процесса ПОЛ на функции клетки реализуется как на уровне прямого влияния продуктов ПОЛ на липидный матрикс мембран, таких как окисленные жирные кислоты, так и различных опосредованных эффектов [1, 2].

Кроме этого, при различных неинфекционных патологиях, таких как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, сахарный диабет и др., сопровождается образование свободных радикалов [3]. Свободные радикалы являются довольно агрессивными окислителями, которые приводят к нарушению структуры и функции мембран клеток. Клеточные мембраны практически постоянно подвержены воздействию свободных радикалов в результате различных неблагоприятных экзо- и эндогенных факторов. В качестве эндогенных факторов могут служить метаболические процессы, происходящих в клетке. Кроме этого, свободные радикалы могут образовываться под воздействием эндогенных факторов таких как антропогенного или техногенного характера (под влиянием загрязненной окружающей среды, курения, радиации, бытовой химии) [13].

Основной причиной развития многих заболеваний человека и животных являются свободные радикалы [15]. В организме есть и антиоксидантная система, которая защищает организм от свободных радикалов [1, 14]. Однако, при патологиях или же под воздействием неблагоприятных факторов баланс антиоксидантной системы нарушается. В этом отношении поиск и исследование антиоксидантов растительного происхождения, которые способны нейтрализовать активность свободных радикалов, является актуальным. Таким образом, целью данной работы является определение антиоксидантной активности полифенольного соединения ПС-2 в условиях in vitro и ex vivo.

Материалы и методы

В работе исследовано новое полифенольное соединение 1-О-галлоил-2,3-гексагидроксидифеноил-4,6-валонеил-β-D-глюкоза (ПС-2), которое выделено из растения Euphorbia, произрастающий на территории Узбекистана.

Рисунок 1. Структурная формула 1-О-галлоил-2,3-гексагидроксидифеноил-4,6-валонеил-β-D-глюкозы (ПС-2)

В экспериментах использовали белых беспородных крыс с массой тела 180–220 г. Митохондрии выделяли из печени методом дифференциального центрифугирования. Для этого извлеченную печень промывали охлажденным 0,9%-м раствором KCl (4 °С), после чего измельчали и гомогенизировали. Для гомогенизации использовали среду выделения следующего состава (в мМ): 250 сахарозы, 20 трис-НCl-буфера и 1 ЭДТА (рН 7,4). Для выделения митохондрий гомогенат центрифугировали в течении 7 мин при 1500 об/мин, затем супернатант повторно центрифугировали в течении 15 мин при 6 000 об/мин при температуре -2 °С. Выпавший осадок суспендировали в небольшом объеме среды выделения, не содержащей ЭДТА, и хранили на льду при 4 °С [4].

Влияние ПС-2 на перекисное окисление липидов (ПОЛ) изучали по методу Петерсона [5]. Перекисное окисление липидов индуцировали системой Fe²⁺/аскорбат и регистрировали по набухание митохондрий на фотометре ЛМФ-69 при 540 нм.

Содержание белка митохондрий определяли по методу Лоури в модификации Петерсона [5].

Для оценки АРА в данной работе использована методика спектрофотометрического (спектрофотометр UV-5100) измерения кинетики восстановления молекул стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) антиоксидантами [16].

При обработке полученных данных использованы компьютерные программы Origin 6.1 (OriginLab Corporation, США). Величину Р<0,05 рассматривали как показатель достоверных различий.

Результаты

Все растительные соединения по отношению к животным организмам в той или иной степени обладают биологической активностью чрезвычайно широкого спектра, за счет разнообразия их химического строения, и в настоящее время находятся в центре научного внимания. В связи с изложенным, поиск антиоксидантов и изучение их ингибирующего действия на процессы свободнорадикального окисления, неконтролируемой липопероксидации, представляется вполне своевременным и восстребованным.

В связи с этим изучено действие различных концентраций ПС-2 на процесс ПОЛ митохондриальных мембран, индуцированный системой Fe²⁺/аскорбат в опытах in vitro. Внесение в инкубационную среду систему Fe²⁺/аскорбат запускает цепную реакцию ПОЛ. В результате индукции ПОЛ происходит нарушениея барьерной функции митохондриальных мембран, что приводит к резкому набуханию митохондрий по сравнению с контрольным вариантом (Fe²⁺/аскорбат) (рис. 2). Внесение в инкубационную среду полифенольного соединения ПС-2, при концентрационном диапазоне 1-10 мкМ, происходит ингибирования набухания митохондрий, что свидетельствует об его антиоксидантных свойствах. Степень антиоксидантной активности полифенола ПС-2 зависел от его концентрации, т.е. с её увеличением в инкубационной среде концентрации ПС-2 процент ингибирования становился более выраженным. Полное ингибирование набухания митохондрий печени, т.е. процесса ПОЛ, отмечалось при концентрации ПС-2 равной 10 мкM. При этом значение концентрации, вызывающей полумаксимальное ингибирование процесса ПОЛ (IC₅₀), для ПС-2 составило 6,08±0,06 мкМ. Таким образом, в опытах показано, что ПС-2 обладает высоким антиоксидантным свойством.

Рисунок 2. Действие ПС-2 на Fe²⁺+аскорбат-индуцированное набухание митохондрий печени крыс
СИ (мМ): КСl - 125, трис-НСl - 10, рН 7,4; FeSO₄ – 0,01, аскорбата – 0,6; белок митохондрий 0,3-0,4 мг/мл; (** - Р<0,01, *** - Р<0,001; n=4)

Определение продуктов реакции процесса перекисного окисления липидов т.е. образование конъюгата тиобарбитуровой кислоты малонового диальдегида (MДA) является одним из классических методов исследования АОА физиологически активных соединений.  В литературе приводятся результаты АОА физиологически активных соединений с их способностью образовать комплексные соединения с различными катионами металлов [6], а также с непосредственным взаимодействием с активными формами кислорода [7, 8, 9]. Кроме того, антиоксиданты могут взаимодействовать с некоторыми компонентами реакционной среды [10], что может приводить к искажению результатов. Таким образом, применение метода с MДA не позволяет оценить общую антиоксидантную активность препаратов. В этом отношении применение методов c использованием стабильных органических радикалов в условиях in vitro дает возможность определения истинной антиоксидантной активности биологически активных веществ [11].

Таким образом, в дальнейших наших экспериментах была исследована антирадикальная активность (АРА) ПС-2 по отношению к стабильному радикалу ДФПГ. Для этого была использована классическая методика, которая основана на восстанавлении молекулы 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) потенциальными антиоксидантами [12]. Была изучена кинетика рекомбинации ПС-2 со стабильным радикалом ДФПГ. При добавлении ПС-2 в спиртовой раствор ДФПГ наблюдалось изменение оптической плотности раствора, что соответствовало о восстановлении молекулы свободного радикала ДФПГ. На рис. 3 представлена кинетика изменения оптической плотности раствора ДФПГ при добавлении ПС-2.

Анализируя полученные результаты можно заключить, что при добавлении в спиртовый раствор ДФПГ исследуемого соединения ПС-2 при концентрации 10, 25 и 50 мкл из ранее приготовленного исходного раствора (1мг/мл) наблюдается снижение оптической плотности раствора ДФПГ, что свидетельствует об антирадикальной способности ПС-2.

Рисунок 3. Изменение оптической плотности спиртового раствора ДФПГ по отношению к контролю при добавлении исследуемого соединения в зависимости от времени. Сплошная линия построена на основании нелинейной регрессии. Концентрация ДФПГ 0.1 мМ. Измерения проводились при 20^оС сразу после добавления исследуемого препарата. Исходная концентрация исследуемого соединения 1 мг/мл

Из экспериментальных данных следует, что изучаемое соединение обладает высокой способностью к тушению свободных радикалов. Для количественной оценки антирадикальной активности использовали стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ), а также параметр t₅₀ – время, необходимое изучаемым препаратам для снижения исходной концентрации радикала на 50% и параметр IC₅₀ - концентрация вещества, необходимое для снижения исходной концентрации радикала на 50%. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Концентрация, ингибирующая на 50 % (IC₅₀) и время необходимое для снижения концентрации ДФПГ на 50 % (t₅₀) при реакции с исследуемыми веществами

Таким образом можно заключить, что полифенольное соединение 1-О-галлоил-2,3-гексагидроксидифеноил-4,6-валонеил-β-D-глюкозы (ПС-2) проявляет высокую способность ингибировать ПОЛ и высокую антирадикальную активность.

Коэффициент корреляции между антиоксидантным свойством ПС-2 и антирадикальной активностью составляет r=0.89.

Список литературы:

1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. – Москва. – 1972.
2. Владимиров, Ю.А. Нарушение барьерных свойств внутренней и наружной мембран митохондрий, некроз и апоптоз / Ю.А. Владимиров // Биол. мембраны. – 2002. - Т. 19, №5. - С.356-377.
3. Gupta D. Methods for determination of antioxidant capacity: a review. Intern. J. of Pharmaceutical Sciences and Research. – 2015. – V. 6(2). – P. 546-566.
4. Schneider W.C., Hageboom G.H. Cutochemical studies of mammalian tissues: The isolation of cell components ba differential centrifugation // Cancer Research. – 1951. – V. 11(4). – P. 1-56.
5. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowre et al. Which is more generally applicable // Analytical biochemistry. – 1977. – V. 83(2). – P. 346-356.
6. Tripathi V.D., Rastogi R.P. Flavonoids in biology and medicine // J. Sci. Ind Res. – 1981. – V. 40. – P. 116-24.
7. Takahama U.O^2- dependent and -independent photooxidation of quercetin in the presence and absence of riboflavin and effects of ascorbate on the photooxidation // Photochem Photobiol. – 1985. – V.42. – P. 89-91.
8. Takahama U. Hydrogen peroxide-dependent oxidation of flavonols by intact chloroplasts // Plant Physiol. – 1984. – V. 74. – P. 852-855.
9.  Takahama U., Youngman R.J., Elstner E.F. Transformation of quercetin by singlet oxygen generated by a photosensitized reaction // Photobiochem. Photobiophys. – 1984. – V. 7. – P. 175-181.
10. K.M.Riedl, S.Carando, H.M.Alessio, M.McCarthy, A.E., Antioxidant activity of tannins and tannin-protein complexes: Assessment in vitro and in vivo // Free radicals in Food. – 2002. – V. 807. – P. 188-200.
11. T.Yokozawa, C.P.Chen, T.Tanaka, G.-I.Nonaka, I.Nishioka, Study on the inhibitory effect of tannins and flavonoids against the 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl radical // Biochem. Pharmacol. – 1998. – V. 56. – P. 213–222.
12. Т.В.Починок, М.Л.Тараховский, В.А.Портнягина, М.Ф.Денисова, В.А. Вонсяцкий, А.Н.Александров, В.А. Мельничук, Экспресс-метод определения антирадикальной активности лекарственных веществ // Хим. Фарм. журн. – 1985. – № 5. – C. 565-567.
13. Su Y.L., Leung L.K., Bi Y.R. et al. Antioxidant activity of flavonoids isolated from Scutellaria rehderiana.// J. Amer. Oil Chemists’ Society. – 2000. – V.77(8). – P. 807-13.
14. Медкова И.Л., Иванов А.Н., Мосякин А.И., Гончаров Л.Ф. Липиды крови и интенсивность свободнорадикальных окислительных процессов у больных ишемической болезнью сердца пожилого возраста на фоне вегетарианской диеты // M. Клиническая медицина. – 2000. – № 1. – С. 21-24.
15. Новоселова Е.Г., Макар В.Р., Семилетова Н.В., Галыбина И.В., Вакулова Л.А. Фесенко Е.Е. Участие антиоксидантов в регуляции клеточного иммунитета.// М. Иммунология. – 1998. – № 4. – C. 33-37.
16. Мельничук В.А. Экспресс-метод определения антирадикальной активности лекарственных веществ // Хим. Фарм. журн. – 1985. – Т.5. – С. 565- 567.